Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
Некоторое время назад считалось, что геном эмбриональных клеток в процессе дифференцировки соматических клеток (стадия образования разных тканей организма) не изменяется, а все разнообразие форм и функций дифференцированных клеток относится к различиям в экспрессии одних и тех же генов. Однако в дальнейшем было показано, что разнообразие молекул антител которые образуются зрелыми лимфоцитами, связано с так называемой активной перетасовкой нескольких сотен генов в клет- ках-предшеотвенниках лимфоцитов. Причем именно степень активности этой перетасовки и обусловливает широчайшее разнообразие антител. Было также показано, что рекомбинация ДНК позволяет изменять геном клетки, направляя ее метаболизм (клеточную специализацию) на увеличение генетического разнообразия. Как известно, молекула антитела является результатом сборки из нескольких белковых цепей, а синтез любого белка определяется соответствующим геном. Соответственно предполагалось, что должны существовать миллионы генов, кодирующих синтез определенных молекул антител, вырабатываемых организмом мл екоп и тающ их. О днако было установлено, что в геноме клеток последних из сотен тысяч генов только незначительная их часть вызывает синтез антител в результате того, что так называемые стволовые (эмбриональные) клетки не содержат полного набора генов всех антитела обладают лишь набором генетических элементов, которые способны очень быстро перестраиваться в процессе дифференцировки и созревания клеток иммунной системы (В -лимфоцитов, что, собственно, и приводит к образованию миллионов клеточных линий, вырабатывающих разные антитела. Что касается молекулы самого антитела (иммуноглобулина, то она состоит из двух легких (L) и двух тяжелых (Н ) белковых цепей, которые соединены расположенными в строго определенных местах дисульфидными мостиками и водородными связями (рис. 22). Каждая цепь имеет постоянную (константную ) и вариабельную области. N -концевые участки (L) и (Н ) цепей образуют антигенсвязы ваю щ ий сайт. Отдельные домены (области) молекулы антитела выполняют разные функции, что облегчает манипуляции с генами антител. А нтигенсвязы ваю щ ие сайты состоят из трех участков C D R — com plem entarity-determ ining regions, определяющих комплементарность антител к антигену и образующих вариабельные (VH и V L) области на концах Ни) цепей. Для характерна очень высокая изменчивость последовательности аминокислот, поэтому их называют еще гипервариа- бельными. Л егкие цепи идентичны у всех видов животных, а тяжелые цепи представлены пятью типами (ц, 5, у е и а ), которые и определяют пять классов иммуноглобулинов, обнаруженных ум лекопи тающих IgM , IgD , IgG , IgE и При контролируемом ферментативном гидролизе иммуноглобулинов образуются фрагменты двух типов и F c, причем концевая часть Fab фрагмента, называемая фрагментом, обладает антигенсвязы ваю щей активностью , присущей интактной молекуле антитела. Существуют около миллиона разных специфических антител, что обеспечивает определение практически любых биологически активных веществ как природного, таки синтетического происхождения. Например, в антителах класса IgM все тяжелые цепи имеют одинаковую постоянную область ц, вариабельные же области у разных молекул антител различны и отражают их антигенные свойства. Таким образом, константная постоянная) область тяжелых цепей определяет способ действия антитела в организме если она, например, типа, те. антитело принадлежит к классу IgD, то оно является связанным с поверх Рис. 22. Строение молекулы антитела. Ни цепи состоят из вариабельных (VH и VL) и константных (постоянных) доменов (С ь С НС Н, Снз). Вариабельные домены содержат CD участки (CDR1, CDR2 и CDR3) ностью синтезирующей его клетки если же тяжелая цепь, например е-типа, то соответствующее антитело IgE может связываться с поверхностью специализированной клетки, способной выделять гистамин, что приводит к появлению симптомов астмы или лихорадки, когда антитело взаимодействует с антигеном (например, с пыльцой какого-либо растения). Моноклональные антитела с успехом применяются для дифференциальной диагностики многих инфекционных и неинфекционных заболеваний, а также для стандартизации определения групп крови путем иммунохимического анализа. Именно с помощью моноклональных антител были идентифицированы индивидуальные маркеры многих возбудителей инфекционных заболеваний как вирусной, таки бактериальной природы. Изучение генетических механизмов многих заболеваний стало возможным благодаря уникальной специфичности моноклональных антител. Так методом иммуносцинтиграфии опухолей можно идентифицировать локализацию опухоли с ее метастазами размером 0,5 — 1,0 см Самыми важными областями использования иммунохимиче- ского анализа являются контроль банков крови и продуктов из донорской крови обнаружение возбудителей в объектах внешней среды диагностика инфекционных заболеваний диагностика диабета. Сегодня количество проводимых иммунохимических анализов в мире растет настолько стремительно, что производство имму- нодиагностикумов совместно с приборами и вспомогательными материалами можно рассматривать уже как отдельную, самостоятельную область биотехнологической промышленности. П ринципы иммунохимического анализа можно представить реакцией растворимого антигена (АГ) с антителом (АТ, зная о двухвалентности АТ и поливалентности АГ. Антитело, образуя комплекс с антигеном, обеспечивает уникальное по специфичности узнавание определяемого вещества в любых сложных многокомпонентных системах. Этот процесс описывается системой уравнений двух стадий: ГАГ + АТ = АГАТ АГАТ + АТ = АГ л АТ) Первая стадия характеризует взаимодействие активного центра антител с антигенной детерминантой, которая представляет участок молекулы АГ, способного связываться с активным центром специфического АТ. Здесь проявляется свойство АТ склеивать антигены (АГ). Причем размеры антигенных детерминант (эпитопов), например, для белковых антигенов составляют всего несколько аминокислот. Вторая стадия характеризуется образованием комплексов сложного состава, когда двухвалентная молекула АТ способна связаться лишь с двумя молекулами АГ в комплекс, который в свою очередь может связать еще одно АТ и т.д. Образующиеся агрегаты таких комплексов обнаруживаются либо по возникающей мутности раствора, либо по выпадению в осадок. Такая реакция взаимодействия белковых антигенов с антителами лежит в основе определения групп крови, когда происходит склеивание эритроцитов антителами той или иной специфичности. Эта реакция получила название гемагглютинации и очень широко используется на практике. Этот метод также широко применяется при определении белков плазмы крови в концентрации до 1 мг/л. Однако методы агглютинации вследствие довольно низкой точности относятся только к качественным или полуколиче- ственным методам анализа. Для расширения пределов чувствительности и повышения специфичности иммунохимических тестов в один из компонентов системы вводят маркер, концентрацию которого можно легко определять. После отделения продуктов реакции от исходных компонентов находят концентрацию АГАТ и по калибровочному графику рассчитывают содержание АГ. К онцентрацию антигена определяют из принципа конкурентного связывания антителами меченого и немеченого антигенов. Происходит следующая реакция: АГ + АГАТ АТАГ + АТАГ* где АГ и АГ* — определяемый антиген без метки и сметкой АТ — антитела АТАГ и АТАГ* — соответствующие комплексы. И так, если в пробирку с раствором, содержащим постоянную концентрацию антител и меченого антигена, добавить разные количества нем еченого антигена, то концентрация комплекса АТАГ* (сметкой) будет обратно пропорциональна концентрации немеченого антигена. Для того чтобы отделить комплексы АТАГ от несвязавш ихся компонентов анализируемой смеси, АТ или АГ ковалентно связывают с твердой фазой, например с полистеро- ловы ми шариками. После промывки твердой фазы отделяют связавшиеся и несвязавш иеся компоненты. Такой тип анализа называют гетерогенным (принцип двух фаз твердой и жидкой). С большим успехом в гинекологическую практику вошел экс пресс-метод определения беременности по уровню хориогониче- ского гонадотропина в моче. Тесты таких типов можно проводить не только в специальных лабораториях, но ив домашних условиях. В качестве практического примера использования твердофазного иммуноф ерментного анализа ELISA можно рассмотреть метод определения хорионического гонадотропина. В этом методе на полистирольные шарики сорбируются моноклональные антитела к хорионическому гонадотропину. К сенсибилизированным шарикам добавляют исследуемую пробу (мочу) и конъюгат, состоящий из маркера и моноклональных антител, меченных пероксидазой. В результате иммунологической реакции хорионический гонадотропин связывается одной детерминантой с моноклональными антителами, иммобилизованными на поверхности шариков, а другой — с моноклональны ми антителами коньюгата с маркером. Затем шарики отмывают от всех несвязавшихся компонентов мочи и определяют активность фермента в составе иммунных комплексов с помощью субстрат-хромоген ной смеси. При этом степень окраски раствора будет прямо пропорциональна количеству хорионического гонадотропина в образце мочи. Лекарственный мониторинг также осуществляется посредством использования методов иммунохимического анализа. Необходимость контроля за концентрацией лекарственного препарата в процессе терапии у больного возникает при следующих ситуациях длительных курсовых приемах лекарственных средств • низком терапевтическом эффекте или полном его отсутствии возникновении побочных явлений в случае превышения терапевтической дозы препарата трудно определяемом фармакологическом эффекте особых обстоятельствах (например, при лечении новорожден ных). Лекарственный мониторинг может применяться, например, при терапии такими препаратами, как бронхолитик теофиллин, сердечный гликозид дигоксин и т.д. Известно, что успешный клинический результат зависит не от дозы препарата, а от его концентрации в плазме крови. Поэтому при достижении одного итого же лечебного эффекта у разных больных лекарственная дозировка препарата может разниться в десятки раз. Совершенно очевидно, что в этих случаях необходим индивидуальный подбор доз для каждого пациента. Кроме того, мониторинг лекарственных средств исключает передозировку лекарственного препарата и, соответственно, проявления токсических эффектов. Рентабельными, экспрессными методами определения низкомолекулярных соединений в плазме крови являются иммуноана- литические методы, которые отличаются универсальностью (применимы к любому веществу, способному к индукции антител, высокой селективностью и чувствительностью не требуют предварительной обработки образцов и имеют сравнительно низкую стоимость. Известно, что иммунизация низкомолекулярными веществами не может вызывать иммунный ответ, поэтому для получения антител нужно предварительно лекарственный препарат ковалентно связать с иммуногенным высокомолекулярным носителем. Сначала лекарственное вещество делают реакционноспособным, вводя разные функциональные группы, которые затем взаимодействуют с соответствующими функциональными группами белка и образуют так называемый синтетический конъюгированный антиген. При иммунизации животного таким комплексным антигеном будут образовываться поликлональные антитела, те. антитела к антигенным детерминантам самого белка и к антигенным детерминантам лекарственного средства. В настоящее время иммунодиагностические тест-системы с использованием поликлональных антител созданы практически для всех лекарственных препаратов. При проведении лекарственного мониторинга с использованием методов иммунохимическо- го анализа в качестве маркеров применяются радиоактивные метки (радиоиммунный анализ с использованием радиоактивных атомов — трития, радиоактивного йода и др.); • ферментные метки (если ферменты стабильны, активны и действуют в минимальных концентрациях • субстратные метки (АТФ и НАД, которые пришиваются к молекуле антигена через адениновы й остаток и сохраняют способность взаимодействия с ферментом. В качестве примера можно привести радиоиммунный метод количественного определения инсулина, основные принципы которого рассмотрим более подробно. Общ еизвестно, что инсулин влияет на концентрацию глюкозы в крови. В лабораторных условиях при наличии животных можно по снижению уровня глюкозы в крови сравнивать отдельные препараты инсулина. Но этот путь совершенно неприемлем для определения инсулина в крови больных, учитывая, что в контроле фактически нуждается если не миллионный, то многотысячный контингент больных. Клиническая лаборатория обязана определять количество эндогенного инсулина в крови больных, которым предписано введение инсулина извне. В противном случае возможны передозировки инсулина. Метод отличается высокой избирательностью (на результаты не влияют любые белки крови) и высокой точностью. В качестве лабораторного оборудования необходимы стандартный гамма-счетчик (например ГСБ-1) и коммерческий набор реагентов (в него входят меченый (по йоду) инсулину которого кодированы остатки тирозина и гистидина антисы воротка к инсулину (антитела к инсулину, получаемая из крови кроликов, которым вводили инсулин). У больного отбирается проба крови, где количество эндогенного (немеченого) инсулина неизвестно (х. Создается реакционная смесь меченый инсулин + антисы воротка (фиксированное количество, те. комплекс антигена с антителом, который затем осаждается. Количество метки в осадке, определяемое радиометрическим методом, соответствует количеству меченого инсулина. Принцип анализа если в реакционную смесь одновременно с меченым инсулином вводится проба крови с эндогенным инсулином, то количество метки в осадке будет тем меньше, чем больше х. В данной ситуации возникает конкуренция за антитело между мечеными немеченым инсулином. Количество немеченого инсулина не должно резко превышать количество меченого, иначе возможны погрешности в точности измерения. В соответствии с этим пробы крови принято разводить х, х хи т.д. Избыток меченого инсулина помешать не может, так как метка определяется в осадке — там, где находится только связанный с антителом меченый инсулин. Расчеты проводятся по калибровочным кривым. Метод пригоден для определения числа микрограммов инсулина в 1 мл крови и не требует предварительных препаративных процедур. Один счетчик типа ГСБ-1 дает возможность анализа нескольких сотен проб в неделю. Радиоиммунный анализ удобен для мониторинга не только инсулина, но и многих других биологически активных агентов Существуют гетерогенные и гомогенные иммуноферментные методы с разделением компонентов после проведения иммуно- химической реакции (роль пассивного маркера выполняет фермент, не меняющий своей активности входе реакции) и без разделения компонентов (также используется ферментная метка, активность которой входе иммунной реакции меняется). Гетерогенный иммуноферментный анализ основан на конкурентной реакции антител с исследуемым веществом и меченым веществом с последующим отделением антител и измерением активности фермента, связавшегося с ними. Гомогенный иммуноферментный метод основан на способности антител модулировать активность некоторых ферментов, ковалентно связанных с измеряемым веществом. Антитела влияют на конформацию активного центра фермента, а добавление свободного вещества восстанавливает активность фермента. Чувствительность гомогенных методов, как правило, меньше, чем гетерогенных, но вполне достаточна для определения практически всех лекарственных препаратов и даже некоторых гормонов. Гомогенные методы достаточно просты анализ проводится в одну стадию и длится несколько минут. Также в иммуноанализе используют липосомы, содержащие метку. Существует множество модификаций этого метода, например, на мембране липосом находится антиген, взаимодействующий с антителами в присутствии комплемента и вызывающий лизис липосом с последующим высвобождением метки. Существуют также и неинструментальные полуколичественные методы экспресс-анализа на бумаге, например на многослойных целлюлозных полосках, которые пропитывают разными реагентами иммунохимической реакции и затем склеивают вместе на пластике. Такой же принцип последовательного взаимодействия находится в основе еще одного полуколичественного метода — иммунохроматографического. На полоску бумаги сорбируют антитела. Затем конец этой полоски вносится в раствор пробы и конъюгата. В процессе диффузии раствора вверх по полоске меченый и свободный лекарственный препарат конкурентно взаимодействует с антителами, вызывая их насыщение. Чем больше концентрация препарата в пробе, тем выше будет зона насыщения. Затем следует проявление (детекция) полоски в растворе субстрата. Высота окрашенного столбика определяет концентрацию препарата в исследуемом образце (пробе). Рассмотрим более подробно вакцины и сыворотки, а также биотехнологические методы их получения. Как уже отмечалось, вакцины относятся к группе активных специфических препаратов и применяются с целью профилактики или лечения. Вакцинация способствует формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмами тем самым защищает его от инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в организме человека или животного вырабатываются антитела к патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к его инактивации (нейтрализации или гибели, блокируют его пролиферацию и не позволяют развиться заболеванию. Эффект вакцинации открыл в 1796 г. врач Э. Дженнер. Он доказал экспериментально, что человек, перенесший коровью оспу (не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчивым к оспе натуральной. Вакцина — сложный иммунобиотехнологический препарат, в состав которого входят действующий компонент, представляющий специфические антигены (живые ослабленные микроорганизмы, убитые микробные клетки или вирусные частицы, извлеченные из микроорганизма антигенные структуры, продукты жизнедеятельности микроорганизмов — токсины как вторичные метаболиты консервант, который определяет стабильность вакцины при ее хранении и не допускает размножения случайно попавшей в препарат микрофлоры (мертиолят 1 : 1 0 0 0 0 , формалин и другие антимикробные препараты стабилизатор, предохраняющий антиген от разрушения и продлевающий тем самым срок годности вакцины (сахарозо-агар- желатина и др адъювант, повышающий иммуногенность антигена, те. его свойство вызывать иммунный ответ (полимерный носитель, минеральный сорбент, липиды и эмульгаторы). В зависимости от природы, характера и способа получения вакцины классифицируются (по А. А. Воробьеву) на живые (аттенуи рованные, дивергентные, рекомбинированные (векторные неживые или |