Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
% кукурузы и 1 1 % сои здесь генетически модифицированы. Остальную часть Африки агробиотехнологические фирмы рассматривают прежде всего как полигон будущих испытаний. Япония одним из приоритетов своего научного бюджета сделала агробиотехнологию, несмотря на то, что применение генетически модифицированных продуктов встречает здесь сильное сопротивление общественности. В Европе после принятия ЕС в 1998 г. правил применения генетически модифицированной продукции Франция, Италия, Дания, Греция и Люксембург запретили эти продукты. Сейчас ЕС принял новые правила сертификации и маркировки последних и значительно смягчил свою позицию. Однако только в Испании вне значительных объемах выращивают трансгенную кукурузу. В России к выращиванию на полях не разрешено ни одно трансгенное растение. Исключение составляет трансгенная соя, и то только в качестве пищевого сырья или компонента продуктов (ее можно есть, ноне выращивать). Несмотря на потрясающие успехи биотехнологии по созданию трансгенных растений с одновременным проведением всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность, в обществе существует настороженное отношение к генетически модифицированным продуктам. Есть вполне реальные опасения по поводу того, что пыльца и семена трансгенных растений и сорняков могут скреститься ив конечном счете вырастет такой суперсорняк, который не сможет уничтожить ни один гербицид. Вместе стем неконтролируемое распространение (горизонтальный перенос) чужеродных генов в популяции культурных, традиционных сортов и дикорастущих форм растений может привести к нарушению равновесия в биоценозах, а также к засорению традиционных сортов трансгенными вставками ив дальнейшем к их полному уничтожению. Улучшение питательных свойств картофеля, кукурузы, сои может стать причиной тяжелых аллергических реакций у человека. Некоторые ученые высказывают серьезную обеспокоенность по поводу возможности образования новых вирулентных штаммов в результате генетической рекомбинации между трансгенами и генами природных вирусов. Контрольные вопросы. Какие проблемы производства лекарственных средств решаются при использовании культур клеток растений. Какова специфика растительных клеток, определяющих условия их культивирования при получении лекарственных средств. Каковы особенности роста растительных клеток в культурах и как это влияет на выход конечного продукта. Какова специфика питательных сред для культур растительных клеток. Какова роль биотрансформации (биоконверсии) при получении лекарственных средств на основе культур растительных клеток. Каковы преимущества иммобилизации растительных клеток при получении на их основе лекарственных веществ. Какие существуют формы и методы иммобилизации растительных клеток ив чем заключается сложность иммобилизации растительных клеток по сравнению с клетками микроорганизмов. Каковы перспективы развития биотехнологии в получении лекарственных средств на основе культур растительных клеток. Какие основные методы получения трансгенных растений существуют. Могут ли трансгенные растения использоваться для получения лекарственных средств Глава 10 ИММУНОБИОТЕХНОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Иммунобиотехнология — это раздел современной биотехнологии, представленной как научными достижениями, таки динамично развивающимся технологическим производством диагностических, профилактических и лекарственных средств с применением в качестве действующего начала разных агентов и процессов иммунной системы. Известно, что человек обладает иммунной системой для защиты от воздействия внешних неблагоприятных факторов, биологически активных агентов. В качестве таких агентов выступают клетки микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, антибиотики, пестициды, объединенные под общим названием антигенов. Понятие антиген является общим, так как обозначает определенную химическую структуру, против которой могут быть получены антитела. Н а самом деле антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившим название антигенных детерминант (эпитопов). Например, в случае белковых молекул антигенными детерминантами являются участки поверхности, содержащие всего около пяти аминокислотных остатков. В случае бактериальных клеток в качестве антигенных детерминант часто выступают короткие цепочки из трех—пяти остатков сахаров, образующих стенку бактерий. Что касается низкомолекулярных соединений, например некоторых лекарств, то сами по себе они не могут вызывать образование антител. Их называют гаптенами. Однако после присоединения гаптенов к поверхности какой-либо макромолекулы организм начинает вырабатывать антитела. Причем даже малые размеры гап- тена по отношению к объему полости активного центра антитела не являются препятствием для образования высокоспецифических антител, хотя гаптен в этом случае связывается лишь счастью специфических участков активного центра антитела. В качестве примера можно привести молекулы двух гормонов — тироксина и тирони на, структура которых отличается всего лишь одним атомом йода, а вырабатываемые антитела против них разнятся по константам связывания более чем в 1 ООО раз Антигены внешней среды поступают в организм человека с воздухом, водой, пищей, через слизистые и кожные покровы. Часть антигенов может попадать к человеку в виде вакцин и им муномодулирующих лекарственных средств (агентов. Иммуно модуляторы либо усиливают, либо ослабляют иммунный ответ организма, поэтому в зависимости от свойств их подразделяют на иммуностимуляторы и иммуносупрессоры. Иммунный ответ — сложный процесс межклеточного взаимодействия лимфоидных клеток разных типов с участием специфических гормонов, в результате чего так называемые В-клетки активно синтезируют специфические антитела против данного антигена. Антитела, однородные по структуре и специфичности, производимые в неограниченных количествах, называются моноклональны ми антителами. Способы усиления иммунного ответа по типу воздействия подразделяют на активные и пассивные, последние — на специфические и неспецифические (табл. К группе активных специфических препаратов можно отнести вакцины, полученные на основе либо рекомбинантных, протек- тивных антигенов, либо живых гибридных носителей. К группе препаратов для образования пассивного иммунитета (неспецифи ческой иммуностимуляции) относят рекомбинантные интерлей кины, интерфероны и другие цитокины. Вместе стем существует группа препаратов с иммуносупрес- сивной активностью, появление которых в клинической практике в х гг. было связано с необходимостью подавления реакции отторжения тканей при трансплантации органов и лечения аутоиммунных заболеваний (табл. Как видно из табл. 4, к препаратам, вызывающим супрессию специфического иммунного ответа к какому-либо аутоантигену относятся толерогены. Их получают, конструируя комплекс из рекомбинантных антигенов и неиммуногенных носителей, подав- Т а блица Способы усиления иммунного ответа с помощью иммунобиопрепаратов Активное воздействие Пассивное воздействие специфическое неспецифическое Вакцины на основе рекомбинантных протективных антигенов, живые гибридные носители Поликлональные антитела — на инфекционных агентов, микробных токсинов Рекомбинантные интер лейкины, интерфероны и другие цитокины. Тими ческие факторы. Трансплантация костного мозга Таблица Способы супрессии иммунного ответа с помощью иммунобиопрепаратов Специфическое воздействие Неспецифическое воздействие активное пассивное Рекомбинантные антигены связующие молекулы и созданные на их основе толерогены Иммунотокси ны, антиидиоти пические антитела в качестве мишени для ауто антител. Специфическая плазмо- иммуносорбция Моноклональные антитела против цитокинов. Неспецифическая гемосорбция и иммуно- плазмофорез ляющий специфический ответ на аллерген. При конъюгации цитостатика или токсина с антителами (иммунотоксинами) можно осуществить направленный транспорт лекарственного средства к определенному рецептору клетки, к конкретной субпопуляции клеток, например к Т-лимфоцитам (Т-хелперам). Кроме того, антиидиотипические антитела (образующиеся против антиген- связывающих центров) могут быть мишенью для аутоантител, с помощью которых можно влиять на течение аутоиммунного заболевания, нивелируя его симптомы, корректируя, например, нарушения системы свертывания крови и т.д. Методы пассивной иммуносупрессии включают специфическую плазмоиммуносорбцию, которая используется при тяжелых формах аллергических заболеваний. С помощью этого метода можно удалять из крови больного глобулины и аллергеноспецифические антитела. В современной фармацевтической биотехнологии кроме имму номодуляторов и иммуносупрессоров значительное место отводится лекарственными диагностическим препаратам, получаемым на основе медиаторов иммунной системы. Медиаторы иммунологических процессов, являющиеся в обобщенном виде полипептидными факторами неиммуноглобулино вой природы, называются цитокинами. Белки, синтезируемые лимфоцитами, называют лимфокинами, а синтезируемые макрофагами и моноцитами — монокинами. Иммуномедиаторы — это единая функциональная совокупность, обеспечивающая в гомеостазе созревание и дифференцировку Т- и В-клеток путем регулирования их пролиферативной активности. Как правило, количество медиаторов в организме невелико и они быстро инактиви руются. С помощью биоинженерии удалось решить проблему получения и н тер лейки на и -2 для группы Т -клеточных ли м фок и - нова также медиаторов семейства интерф еронов. П оказанием к терапии служит эндогенный дефицит интерлей- к и на, возникающий, например, после трансплантации костного мозга, а также при цитостатической терапии. В настоящее время методами генной инженерии можно получать препараты и н терф еронов всех классов, положительные результаты применения которых были получены при лечении вирусных заболеваний и отдельных видов опухолей (в онкологии). Л екарственны е вещества, проявляющие высокую активность при тестировании in vitro (обычно в культуре клеток, зачастую оказываются значительно менее эффективными. Кажущееся снижение их активности объясняется тем, что они не достигают органа или клетки мишени в нужной концентрации. Увеличение дозы принимаемого препарата не решает проблему, поскольку при этом часто возникают побочные эффекты. Более того, чтобы избежать этих эффектов, многие терапевтические средства заведомо вводят в дозах, не достигающих оптимальных, что дополнительно снижает их эффективность. Для облегчения доставки лекарственного вещества к месту его действия используют несколько приемов заключают его в липосомы, липидная оболочка которых имеет высокое сродство к нужным органам встраивают гены специфических токсинов в инфильтрую щ ие опухоль лимфоциты, которые высвобождают эти токсины непосредственно в опухоли присоединяют молекулы лекарственных веществ км он ок л о нальны м антителам, специфичным по отношению к белкам, находящимся на поверхности строго определенных клеток, например опухолевых (рис. 2 1 , о используют лекарственные вещества в неактивной форме, переводя их в активное состояние при помощи ферментов. Чтобы такое превращение происходило только вблизи клетки мишени, фермент присоединяют км оноклональном у антителу, специфичному к поверхностному антигену этой клетки (рис. 2 1 , б). Рис. 21. Использование моноклональных антител для целевой доставки лекарственных веществ — лекарственное вещество 2 — инертная форма лекарственного вещества 3 — моно клональное антитело 4 — фермент 5 — поверхностный белок 6 — клетка-мишень 222 - , ( У а ' % а б Несмотря на весьма существенные достижения применения моноклональных антител в терапии разных заболеваний, имеются все-таки и некоторые ограничения их использования в клиниках. Прежде всего они как гибридомные продукты могут быть кон- таминированы генетическим материалом ретровирусов, так как все миеломы как опухолевые партнеры гибридизации имеют в геноме гены ретровирусов, являющиеся онкогенными и соответственно опасными для человека. Поэтому все препараты моно клональных антител обязательно тестируются на отсутствие вирусного генетического материала. Для получения антител используют мышей, морских свинок, кроликов, кур, овец, коз, лошадей, которым делают инъекции антигена. В присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Обычно антитела выделяют из сыворотки крови сульфатом аммония, спиртом или полиэтиленгликолем. Эти антитела имеют много примесей белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной и аффинной хроматографий на иммуносорбентах. Для организации масштабного производства моноклональных антител ключевую роль сыграл метод гибридомной технологии. Хорошо известно, что в результате иммунного ответа на какой- либо антиген образуется высокогетерогенный продукт — анти сыворотка со смесью антител, продуцируемых разными линиями В-лимфоцитов и направленных к разным антигенным детерминантам антигена. Проблема получения определенной линии лимфоцитов, которые не растут на искусственной среде in vitro в культуре, была решена, как только стало возможным получение соматических гибридов. Известно, что миеломы (злокачественные опухоли костного мозга, клетки которых обладают способностью к неограниченному росту) продуцируют большое количество аномальных иммуноглобулинов. В 1975 г. Г. Келер и К. Мильштейн сумели впервые выделить клоны клеток, способные секретировать только один тип молекул антител ив тоже время расти в культуре. Эти клоны клеток были получены слиянием антителообразующих и опухолевых клеток — клеток-химер, названных гибридомами, так как, с одной стороны, они наследовали способность к практически неограниченному росту в культуре, ас другой стороны, способность к продукции антител определенной специфичности (моноклональных ан тител). Весьма существенно для биотехнолога то, что отобранные клоны могут длительно храниться в замороженном состоянии, поэтому в случае необходимости можно взять определенную дозу такого клона и ввести животному, у которого будет развиваться опухоль, продуцирующая моноклональные антитела заданной специфичности. Вскоре в сыворотке животного будут обнаружены антитела в очень высокой концентрации от 10 до 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела получать из культуральной жидкости. В настоящее время гибридомная технология получила широкое применение. Создание гибридом, которые можно хранить в замороженном состоянии (криоконсервирование), позволило организовать целые гиб ридомные банки, что в свою очередь открыло большие перспективы по применению моноклональных антител. Сфера их применения помимо количественного определения разных веществ включает самую разнообразную диагностику, например идентификацию определенного гормона, вирусных или бактериальных антигенов антигенов группы крови и тканевых антигенов (табл. Только благодаря использованию моноклональных антител полученных в результате иммунизации животных лекарствами стало возможно определение дозы этих лекарств. Такая «иммуно дозировка» надежна и экономична. В х гг. в США Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) впервые утвердило к прода- Т а блица Области применения моноклональных антител Диагностика Терапия Технология Научные исследования. Иммуно- 1. Воздействие на. Иденти 1. Исследова химические определенные кле фикация ние этиологии анализы точные популяции. молекул. и патогенеза биологи. Влияние наим. Очистка различных ческих жид мунные регулятор клеток, заболеваний. костей, кле ные механизмы несущих. Исследова ток орга с помощью антител специфи ние систем низма, к лимфокинам. ческий ных и меж- микроорга 3. Иммунорегуляция антиген системных низмов, вис помощью анти- механизмов русов и т.д. идиотипических регуляции. Иммуно- антител. Создание гистохими- 4. Направленный новых ле ческие транспорт лекарств карственных методы. с помощью моно средств 3. Иммуно- клональных антител. и биопре сцинтиграфия 5. Элиминация паратов опухолей. токсинов, иммуно 4. Типиро- глобулинов из клас вание групп са крови и тканей же коммерческий набор для диагностического скрининга на основе гибридом, предназначенный для установления аллергена. С помощью моноклональных антител возможно выделение биологически активных веществ (белков, гормонов, токсинов) из сложных смесей. Например, при использовании иммуноадсорб ции для очистки интерферона был получен препарат высочайшей степени очистки (до 99% ). Только после одного пассажа через колонку с иммобилизованными моноклональными антителами препарат очищался в 5 ООО раз! М ож но использовать моноклональные антитела ив качестве меток для точной идентификации специализированных клеток например нейронов. Существует также технология использования моноклональных антител для изучения клеточных мембран, позволяющая выделять мембранные белки в чистом виде и измерять их биологическую активность. М оноклональные антитела можно использовать как в качестве стандартного реагента для обнаружения определенных молекул на клеточной мембране, таки для разделения популяции клеток несущих на поверхности разные антигены. Кроме того, с помощью моноклональных антител можно создавать высокоспецифичные вакцины, особенно против определенных вирусных штаммов и паразитов. Моноклональные антитела способны также к нейтрализации лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассеянный склероз, ревматические болезни. В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клетки-миш ени, позволяя избегать серьезных побочных явлений, весьма обычных, например при химиотерапии рака. |