Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
ния. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и особенно изоэл е ктрофокусирован ие. Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур (в частности лизосом, митохондрий, ядер, несущих в своем составе многие индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, которая ведет к потере ферментативной активности. Поэтому данные технологические операции проводят в присутствии защитных добавок, в частности, содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цис теамина и др. Очень важно поддерживать на всех этапах выделения ферментов низкую температуру, так как некоторые из ферментов даже при 80 С теряют активность. Для оценки гомогенности ферментного препарата прибегают к обычным методам белковой химии. О степени чистоты ферментного препарата судят как правило, по его биологической активности если активность при дальнейшей очистке не возрастает, препарат можно считать гомогенным. В качестве примерам ож но привести краткие технологические схемы получения трех ферментов террилитина, стрептокиназы и липазы. Протеолитический ферментный препарат террилитин получают культивированием штамма Aspergillus terricola с последующим отделением от мицелия. Затем полученный нативный раствор освобождают от пигментов пропусканием через анионит (продукт поликонденсации ф еноксипроизводны х формальдегида при нейтральном. Далее методом ультрафильтрации раствор ферментов обессоливают и концентрируют полученный концентрат ли о филизируют. С целью сокращения длительности процесса и увеличения выхода целевого продукта депигментированный нативный раствор дополнительно очищают от высокомолекулярных балластных веществ. С трептокиназу получают непрерывным культивированием продуцента Streptococcus egyisim ilis на питательной среде, включающей м ясопептонн ы й бульон, содержащий настой из говяжьих сердец, глюкозу и бикарбонат калия. Подачу питательной среды регулируют в зависимости от изменения культураль н ой взвеси. Далее целевой продукт выделяют и очищают. Для повышения выхода целевого продукта питательную среду перед культивированием нагревают до заданного Липазу получают из семян хлопчатника, которые облучают определенное времяимпульсным концентрированным светом. Затем семена проращивают в темноте. Проросшие семена измельчают и обрабатывают ацетоном, после чего последовательным осаждением раствором сульфата аммония и ацетона липазу выделяют из ацетонового экстракта. Для увеличения выхода целевого продукта и повышения его активности перед облучением семена предварительно замачивают. Контрольные вопросы. Какие химические модификации стероидной молекулы осуществляются с помощью биотрансформации? 2. Что служит основным источником сырья для производства стероидных препаратов и почему. На чем основан выбор микроорганизмов, способных трансформировать стероиды. Что лежит в основе классификации витаминов. Какие методы доминируют в производстве витаминов 6 . Какая стадия получения аскорбиновой кислоты является биотехнологическим методом. Какие лекарственные препараты на основе аминокислот существуют. В чем отличие биосинтеза треонина от биосинтеза лизина. Каковы причины развития дисбактериоза. Какие требования предъявляются к производственному штамму микроорганизма-симбионта? 11. Какие основные классы ферментов существуют 2 . Каковы особенности методов очистки и выделения ферментов Глава БИОТЕХНОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ КУЛЬТУР РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. Общая характеристика Одним из главных механизмов, поддерживающим стабильность жизни на Земле, является сохранение разнообразия, взаимосвязанного и взаимозависимого сосуществования человека и природы. Так, академик Г.Ф. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Рост городов, вырубка лесов, ухудшение экологии, усиленная эксплуатация дикорастущих и плантационных растений — традиционного источника лекарственных средств приводят к растущему дефициту сырья. Многие виды растений находятся на грани вымирания. Использование культур клеток и тканей растений помогает спасти от уничтожения ставших уже редкими тысячи дикорастущих растений, которые синтезируют необходимые для жизнедеятельности человека вещества. Культивирование растительных клеток и тканей на искусственной питательной среде в биореакторах помимо решения ряда экономических экологических и технологических задач позволяет, в частности, преодолеть ряд проблем свести к минимуму влияние климатических, сезонных и географических условий сократить посевные площади в хозяйственном обороте страны получать уже известные, присущие интактному растению вещества, например никотин, кодеин, хинин, диосгенин и синтезировать новые биологически активные соединения использовать культуры растительных клеток для биотрансфор мации конечных продуктов. Использование новых технологий получения биомассы лекарственных растений (содержащих то или иное активное начало) в виде каллусных (лат. callus — толстая кожа, мозоль) и суспензионных культур имеет ряд преимуществ стандартность накапливаемого сырья высокий выход активного начала (на примере культивирования женьшеня рентабельность производства стала возрастать при внедрении технологии получения бородатых корней, где по условиям роста и скопления клеток возникают субпопуляции с повышенной дифференцировкой — самые продуктивные клетки по биоактивным веществам сокращение сроков культивирования для накопления растительной биомассы возможность промышленного производства биомассы экзотических растений, малодоступных для нашей страны, например, таких как раувольфия, диоскорея, унгерия и др использование разных технологических режимов использование методов иммобилизации и биотрансформации для повышения выхода продуктов вторичного метаболизма применительно к растительным клеткам. Однако растительные клетки и ткани имеют свои особенности, затрудняющие работу сих культурами (по сравнению с клетками микроорганизмов размеры клеток растений (15— 1 ООО мкм) враз больше, чем клеток бактерий в результате роста клеток растений у них появляется большая вакуоль, при этом все физические и химические константы клеток изменяются суспензионные культуры состоят из клеток-агрегатов разного размера культуры клеток растений имеют целлюлозную стенку, что весьма затрудняет работу биотехнолога с такими культурами. Промышленный способ выращивания изолированных культур дает возможность за сравнительно короткий срок (30—45 сут) получить значительный объем ценного лекарственного сырья, используя каллусные и суспензионные культуры. Метод получения лекарственных средств на основе культур клеток растений начинается с процесса получения культуры кал- лусной ткани (или каллуса), образующейся в местах повреждения органов растения (спонтанная пролиферация клеток растения, и используется для получения изолированных тканей и клеток растения. Впервые каллусная культура была получена в 1902 г. Она состоит из сообщества клеток, выращиваемых на искусственной питательной среде. До середины х гг. культуры каллусных тканей использовали как модельную систему для исследования физиологических и биохимических процессов в работе с изолированными клетками и органами растений. Через некоторое время было доказано, что культуры клеток растений на искусственных питательных средах могут синтезировать вещества, присущие интактному растению, те. могут быть продуцентами БАВ. В этой связи необходимо рассмотреть такое понятие как тотипотентность — способность любой клетки образовывать полноценное растение, что предопределено ее генетическим потенциалом. Все типы дифференцировки — образование отдельных дифференцированных клеток, тканей, органов (орга- 205 ногенез) — возможны, благодаря тотипотентности, те. любая растительная клетка содержит полный набор генов организма, из которого она была выделена. В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток, поэтому морфогенез в них можно рассматривать как проявление тотипотентности растительных клеток. Каждая клетка кал- лусной культуры может дать начало целому организму, однако реально детерминируется только одна из 400— 1 ООО клеток, что, по-видимому, определяется как физиологическим состоянием клетки, таки ее компетентностью. Существенную роль в дифференциации клеток играют как генотип растения-продуцента, таки условия культивирования. Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях происходит независимо от принадлежности растений к той или иной таксономической группе. Существуют общие требования к выращиванию объектов в культуре in Асептика является обязательной и необходимой для культивирования как отдельных клеток, таки каких-либо фрагментов ткани или органа растения (экспланта). На растительных тканях может оказаться эпифитная микрофлора, которая в дальнейшем обнаружится ив культуре ткани. Внутреннее инфицирование растительной ткани чаще всего встречается у тропических и субтропических растений. Поэтому кроме поверхностной стерилизации с использованием дезинфицирующих веществ применяются и антибиотики, убивающие микробную флору внутри ткани, однако существует серьезная проблема подбора антибиотика направленного действия. Для успешного культивирования клеток и тканей какой-либо культуры растений необходимо учитывать влияние физических факторов нарост и физиологические характеристики этой культуры на уровне фенотипа и генотипа (рис. Большинство каллусных тканей растут в условиях слабого освещения, так как они неспособны к фотосинтезу. Нов тоже время свет может являться и фактором морфогенеза, активирующим процессы вторичного синтеза. В качестве источника света используются люминесцентные лампы. Примером влияния освещенности на метаболизм каллусных клеток является культура чайного растения, у которого под действием света увеличивается биосинтез полифенолов. Однако в культуре клеток Scopolia parviflora тот же свет подавляет образование алкалоидов. Для большинства каллусных культур также важна оптимальная температура (около 26 СИ з-за низкой интенсивности дыхания этих клеток потребность их в кислороде соответственно понижена, и необходимость в обес- 206 Рис. 19. Физические факторы, влияющие нарост клеточной культуры печении данных культур системой интенсивной аэрации отпадает. В связи с этим при внедрении технологии суспензионного культивирования надо подбирать соответствующие типы биоре акторов с объемом не болеем и с системами особого перемешивания (турбинное, восходящим потоком воздуха, встряхиванием, чтобы не разрушить растительные клетки. При сравнении ферментеров разных типов было установлено, что максимальный синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре происходит при подаче воздуха снизу. Если же выращивают клетки в колбах малого объема, то аэрация достаточна при постоянном перемешивании суспензии. Оптимальная влажность для роста культуры обычно составляет 60—70 %. Весьма существенным для обеспечения роста биомассы и синтеза продуктов вторичного метаболизма является подбор ингредиентов среды культивирования. Особое значение для культивирования изолированных клеток и тканей имеют жидкие питательные среды. Они, как правило, многокомпонентны, имеют определенные различия по составу, нов тоже время в них обязательно должны быть включены неорганические питательные вещества — макроэлементы, микроэлементы источники железа органические добавки — витамины, фитогормоны, ауксины и ци- токинины (регуляторы роста растений, играющие роль пусковых механизмов источники углеводов — сахароза или глюкоза. Сахароза или глюкоза особенно необходимы для каллусных тканей, так как они лишены хлорофилла и неспособны к автотрофному питанию. Обязательным компонентом питательной среды должны быть ауксины — индолилуксусная кислота, нафтилуксус- ная кислота и 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота и цитокини- ны — 6 -бензиламинопурин; N -изоптен, 6 -фурфуриламинопурин. Ауксины вызывают дедифференцировку клеток экспланта и повышают продуктивность культур клеток, являясь пусковыми механизмами первичного и вторичного метаболизма. Индуцируя клеточное деление, цитокинины по-разному влияют на накопление вторичных метаболитов одни не реагируют на внесение в среду ц и токини на, например культура клеток D atura tatula, другие, например, активно образуют алкалоиды Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фосфора координирует скорость роста клеток в среде. Истощение среды приводит к снижению как роста клеток, таки процессов вторичного метаболизма. Для синтеза вторичных метаболитов весьма существенно внесение в питательную среду предшественников, стимулирующих определенные ферментативные пути метаболизма. Например, внесение фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивает выход диосгенин а на 100% . При приготовлении твердых питательных сред для выращивания каллусных тканей используют очищенный агар-агар — полисахарид, выделенный из морских водорослей. При получении каллусных культур сначала готовят эксплант — маленькие мм) кусочки растительной ткани, не утратившие способность к репродукции. Этот растительный материал тщательно моют, стерилизуют спиртом или 0,1 % сулемой, а затем снова тщательно промывают дистиллированной водой и помещают на синтетическую агаризованную питательную среду. Сосуды закрывают ватно-марлевы ми тампонами. Для образования каллуса и роста ткани сосуды переносят в темное помещение, где поддерживают определенную температуру (2 4 —26 Си влажность (65 — 70 %), при этом через 2 — 3 нед на раневой поверхности образуется первичный каллус. К аллусная клетка развивается аналогично другим клеткам, проходя соответственно такие циклы, как деление, растяжение, дифференцировка, старение и отмирание. Кривая роста каллусной ткани имеет образный характер и включает пять фаз разной длительности у разных растений (рис. 2 Рис. 20. Кривая роста каллусной ткани. Фазы — латентная (лаг-фаза — клетки адаптируются и готовятся к делению 2 — линейная (рост каллусной ткани идет с постоянной скоростью 3 — экспоненциальная (время максимальной митотической активности рост клетки ускорен масса каллуса увеличивается 4 — стационарная (интенсивность деления резко снижается 5 — отмирания Нет однозначного ответа на вопрос, как связан синтез вторичных метаболитов с ростовыми процессами. У большого числа культур вторичные метаболиты синтезируются и накапливаются в значительных количествах либо вовремя экспоненциальной фазы, когда ростовые процессы особенно активны, либо в период стационарной фазы роста культуры клеток, когда прирост клеточной массы прекращается. Однако есть культуры (например, клеток Catharanthus roseus), у которых синтез вторичных метаболитов сопровождает весь период роста. Синтез вторичных соединений может коррелировать с процессом дифференцировки в культуре клеток. Например, в суспензионной культуре Papaver somniferum синтез алкалоидов начинается после того, как в ней дифференцируется достаточно большое количество специализированных клеток млечников, предназначенных для депонирования метаболитов. Культуры же клеток табака и моркови синтезируют большое количество никотина и ан- тоциана соответственно, хотя их клетки слабо дифференцированы. Синтез вторичных метаболитов в культивируемых клетках связан с внутриклеточными органеллами — в основном с пластида ми и эндоплазматическим ретикулумом. В клетках, неспособных к транспорту метаболитов, продукты вторичного синтеза обычно накапливаются в вакуолях и свободном пространстве. Важная особенность культивируемой популяции клеток — ее стабильность в отношении синтеза и накопления вторичных метаболитов. Необходимо отметить, что клетки каллусной культуры обычно не транспортируют синтезируемые метаболиты в питательную среду или другие клетки, хотя некоторые культуры составляют исключение, в частности культура клеток мака, которые депонируют алкалоиды в млечники. Очень важно, что каллус- ные культуры сохраняют многие физиологические особенности растения, из которого они были получены (например, морозостойкость, устойчивость к внешним воздействиям, способность к синтезу вторичных метаболитов и т.д.). Стабильность синтеза вторичных метаболитов как целевого продукта зависит, как правило, от стадии культивирования и дифференцировки клеток. Например, дифференцированные корневые каллусы Atropa belladonna синтезируют тропановые алкалоиды, а недифференци рованные — уже неспособны к их синтезу. Однако недифферен цированные клетки Rauwolfia serpentina способны синтезировать индолиловые алкалоиды с достаточно большим выходом метаболитов. Исходя из этого, можно сделать вывод, что морфологическая специализация клеток не является основной предпосылкой для синтеза БАВ. В настоящее время промышленный синтез вторичных метаболитов на основе суспензионных культур клеток является перспективными рентабельным, так как производство растительного сырья для него не зависит ни от климатических факторов, ни от повреждения насекомыми. Каллусные культуры выращивают на малых площадях ив дальнейшем используют для синтеза соединений практически всех классов. Причем выход вторичных метаболитов — несопоставимо более высок по сравнению сих синтезом в целых растениях. Использование технологий получения каллусных культур из растительного сырья дает такие преимущества, как надежность и стабильность по выходу биомассы и продуктов вторичного метаболизма, а также возможность использования каллусной системы для иммобилизации с последующей биотрансформацией. Недостаток только один — необходимость применения ручного труда. Из сравнения каллусных и суспензионных культур следует, что выход продуктов вторичного метаболизма выше именно в каллусных культурах, но при этом управление процессом культивирования легче осуществлять при работе с суспензионными культурами. При промышленном выращивании суспензионных культур применяют биореакторы, в которых процессы глубинного культивирования ведут к увеличению биомассы и синтезу вторичных соединений. Выделяют биореакторы, в которых суспензионная культура перемешивается только за счет подачи воздуха, и биоре акторы, в которых суспензионная культура перемешивается механическим способом (см. рис. 1 Культуры растительных клеток в биореакторах выращивают водном из двух режимов первый — периодическое культивирование, при котором по окончании процесса биосинтеза откачивают и используют всю суспензию клеток второй — полупериодическое культивирование, при котором в биореактор постоянно добавляют определенный объем свежей питательной среды и одновременно забирают тот же объем либо клеточной суспензии (открытое проточное культивирование, либо отработанной питательной среды, оставляя при этом клеточную массу в реакторе (закрытое проточное культивирование). В основном растительные клетки выращивают в периодическом режиме. Полупериодическое культивирование используют, когда показано, что нарастание биомассы четко коррелирует с синтезом вторичных метаболитов. Существуют также две разновидности открытого проточного культивирования турбидостат — автоматическое поддержание концентрации клеточной биомассы в реакторе на одном уровне регулировкой скорости протока • хемостат — в биореактор с постоянной скоростью подается питательный раствор при одновременном откачивании стой же скоростью клеточной суспензии. Существуют также технологии получения вторичных метаболитов с помощью иммобилизованных клеток каллусной культуры. Их помещают (встраивают) в определенные носители альгинат кальция агарозные шарики трехмерные сетчатые структуры из | нейлона, порошкового металла, полиуретана (в частности, такие системы используются для иммобилизации каллусной культуры клеток Digitalis lanata) или адсорбируют в них. Носитель с клетками помещают в питательную среду, клетки при этом остаются живыми. Они прекращают рост, но продолжают синтез метаболитов, выделяя их в среду. Основные условия иммобилизации — выделение метаболитов в питательную среду и свободное извлечение метаболитов, например алкалоидов из питательной среды. Иммобилизованные клетки по сравнению с суспензионными культурами имеют следующие преимущества многократное использование четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма увеличение продолжительности культивирования на стадии активного биосинтеза получение большего количества вторичных метаболитов сокращение времени ферментации увеличение срока работы клеток (иммобилизованные клетки с низкой скоростью роста способны к интенсивной выработке метаболитов). Довольно часто синтез метаболитов в суспензионной культуре останавливается на промежуточных этапах, не доходя дополучения необходимого целевого продукта. В этом случае получение конечного продукта возможно, благодаря процессу биотрансфор мации, суть которого в изменении промежуточных метаболитов с помощью культур других растений или клеток бактерий с целью повышения биологической активности конкретной химической структуры. Несмотря на то, что биотрансформация очень эффективна в случае применения бактериальных клеток, однако растительные клетки также используют, когда процесс по каким-либо причинам не может осуществляться в клетках микроорганизмов. В качестве примера можно привести превращение дигитоксина в дигоксин клетками Digitalis lanata. Недифференцированные культуры клеток Digitalis lanata сами по себе не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду. Растения наперстянки (Digitalis lanata) в большом количестве синтезируют диги- токсин вместо необходимого дигоксина. Для соответствующей биотрансформации с успехом используют недифференцирован ную суспензионную культуру наперстянки. Иммобилизованные клетки этой культуры способны долгое время с постоянной скоростью трансформировать р-метилдигитоксин в р-метилдигоксин за счет реакции 1 2 -гидроксилирования, катализируемой ферментом, находящимся в клетках Digitalis Другой пример культура клеток женьшеня корневого происхождения способна биотрансформировать (гликозилировать) фенольные соединения (продукты жизнедеятельности суспензионной культуры клеток корня Panax Еще один пример — биотрансформация карденолидов, в которых содержатся гликозиды, используемые в медицине для лечения болезней сердца. Для успешного осуществления процессов биотрансформации необходимо постоянно проводить селекцию специализированных линий клеток и оптимизировать условия культивирования. В заключение приведем в качестве примеров используемые в клинической практике лекарственные средства, полученные на основе каллусных и суспензионных культур клеток растений ши- конин (кожные заболевания, дигоксин (сердечно-сосудистые заболевания, берберин (кишечные растройства — в качестве бактерицидного средства, диосгенин (противозачаточное средство, панаксозиды (адаптогены, укрепляющие иммунитет. При производстве настоек женьшеня плантационное выращивание этой культуры по выходу панаксозидов имеет преимущество перед каллус- ным сырьем, однако препараты, получаемые из каллусного сырья, менее токсичны. Трансгенные растения Возможности современной биотехнологии в отличие от традиционных методов генетики и селекции позволяют комбинировать гены разных биологических видов и получать трансгенные растения. Трансгенными называются растения тех видов, в которых успешно функционируют гены (или ген, пересаженные из растений или животных других видов. Делается это для того, чтобы растение-реци пиент получило новые удобные для человека свойства повышенную устойчивость к вирусам, гербицидам, вредителями болезням растений. Пищевые продукты, полученные из таких генноизмененных культур, могут иметь улучшенные вкусовые качества, лучше выглядеть и дольше храниться. Также часто такие растения дают более богатый и стабильный урожай, чем их природные аналоги. Если взять гены устойчивости к заболеваниям — из вирусов, морозоустойчивости — из рыбы, сопротивляемости вредителям — из бактерий и внести этот коктейль в геном какого-нибудь растения, то такая комбинация придаст растению совершенно новые свойства, хотя его биологический вид не изменится. Картофель останется картофелем, просто теперь он станет неуязвимым для колорадского жука. Уже получены морозоустойчивая свекла, светящаяся в сумерках газонная трава и даже банан, съев который, получаешь прививку от тропических болезней». Поиски путей введения чужеродных генов в клетки высших растений интенсивно ведутся во всем мире с х гг. Было обнаружено, что опухолеобразующие Ti-плазмиды агробактерий (Ti — tumor inducing), представляющие миникольцевые ДНК, являются великолепной природной векторной системой, которую в настоящее время используют для переноса генов в растения. Плаз мида содержит тДНК (transferred DNA), состоящую из 12—22 тыс. пар оснований и кодирующую ферменты синтеза фитогормонов и опинов — производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии. Кроме тДНК, в Ti-плазмиде содержатся область, отвечающая за перенос тДНК в растение, гены утилизации опинов, а также локусы, контролирующие размножение плазмиды в бактериальной клетке и ее перенос при бактериальной конъюгации. Плазмида агробакте рии переносит часть своей ДНК в ДНК растительной клетки, те. в ДНК последней встраивается нужный ген. Весь процесс вырезания и интеграции тДНК в растительную хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir- области. Индукция генов обратима, что очень важно для патогена в случае, если хозяин — больной и нежизнеспособный организм, перенос тДНК не осуществляется. Внедрение тДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом, при этом в геном растения могут встраиваться несколько копий тДНК. После встраивания в хромосому тДНК становится обычной частью генома растения и транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой растения-хозяина. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной тДНК как фабрику, продуцирующую опины. тДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк они трансформируют клетки практически всех двудольных растений (иногда даже однодольных, в том числе злаков. Во- вторых, интегрированная в состав генома растения тДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии, под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в тДНК чужеродные гены. В целом идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений, систему для экспрессии чужеродных генов в растениях узнаваемый растительными полимеразами регулируемый промотор, маркер (репортерный ген, который необходим для селекции трансформированных клеток и не содержать онкогенов, те. генов, которые подавляют дифференцировку растительных кле ток. Сейчас используют широкий арсенал методов для получения трансгенных растений. Одним из способов введения тД Н Кв клетки растения является использование бинарных векторных систем, создание которых заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней мере две разные модифицированные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только область, гены которой будут участвовать в вырезании тДНК. Такие плазмиды называют плазмидами-помощницами. Вторая Ti-плаз- мида должна содержать область тДН К с нужным встроенным геном. Продукты генов способны вырезать тДНК как на собственной плазмиде, таки на соседней, те. гены могут работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ti-плаз- миду с сегментом vir и другую плазмиду с тДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений. Существуют и другие способы введения чужой ДНК в клетки растения. Например, можно ферментами растворить толстую клеточную оболочку растительной клетки, мешающую прямому проникновению чужой ДНК, поместить такие очищенные клетки в раствор, содержащий ДНК и какое-либо химическое вещество, способствующее проникновению ДНК в клетку (чаще всего применяется полиэтиленгликоль). Иногда в мембране клеток короткими импульсами высокого напряжения проделывают микроотверстия, через которые в клетку могут проходить отрезки ДНК. В некоторых случаях применяют даже непосредственно впрыскивание ДНК в клетку микрошпри цем под микроскопом. Несколько лет назад предложено покрывать молекулами ДНК сверхмалые металлические пули, например шарики из вольфрама диаметром 1 — 2 мкм, а затем из специального прибора «Shotgun» стрелять ими в растительные клетки. Проделываемые в стенке клетки отверстия быстро заживляются, а застрявшие в протоплазме пули так малы, что не мешают клетке функционировать. Часть залпа приносит успех — некоторые пули внедряют свою ДНК в нужное место, осуществляя таким образом трансформацию растительных клеток. В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с «antisense RNA» (перевернутой или антисмысловой РНК, который позволяет управлять работой ин тересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (кДНК) встраиваемого гена переворачивают наград В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРН К и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРН К образует с ней комплекс, и кодируемый белок не синтезируется. Такой подход был использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. В вектор была включена кДНК гена PG, контролирующего синтез полигалакту- роназы (polygalacturonase) — фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что, в свою очередь, значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства (прежде всего к фитопато генным грибами насекомым, так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая. Было обнаружено, что устойчивость растений к вредителям можно запрограммировать генетически — введением в геном растений чужеродных генов, продукты которых вызывают гибель вредителя. Традиционно для этого используют ген Ы, продуктом которого является бактериальный токсин, продуцируемый бактерией Bacillus thuringiensis. Этот крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt, попадая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к гибели насекомых. Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном Ы уже производятся фирмами «Monsanto», «Ciba Seeds» и успешно продаются на мировом рынке. Известно, что растения, подобно животным, способны вырабатывать иммунитет. Однако этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения, у которых при атаке патогенов резко меняется метаболизм. В результате у этих растений накапливаются такие химические соединения, как пероксид водорода, салициловая кислота и фитоалексины. Повышенное содержание этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами. Например, трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилата гидролазы (этот фермент разрушает салициловую кислоту, были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-ин женерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген пероксида водорода может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений Многообещающим направлением в генной инженерии растений является получение трансгенных растений, содержащих комбинацию определенных гормональных генов бактерий. Оказалось, что плоды некоторых из таких трансгенных растений являются партенокарпическими, те. сформировавшимися без опыления. Эти плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить пробле- ф му лишних косточек, например в арбузе, у цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат се мян. Во всем мире активно ведутся работы по созданию на основе трансгенных растений так называемых съедобных вакцин, которые в дальнейшем можно будет использовать для предупреждения наиболее опасных болезней человека. Например, учеными СО РАН успешно ведется разработка противотуберкулезной вакцины. При создании вакцины ученые используют гены человека, кодирующие синтез специфических антител к белкам возбудителя болезни — Mycobacterium tuberculosis. Эти антитела и обеспечивают иммунитет к данному заболеванию. Гены, кодирующие антитела против туберкулеза, встроили в геном растительных клеток. Из клеток, в которых удачно произошло встраивание защитных генов, регенерировали полноценные растения, которые обладают способностью синтезировать антитела против туберкулеза. Традиционные методы лечения туберкулеза не всегда безвредны и эффективны, и ученые надеются, что использование трансгенных растений дает шанс не только избавиться от болезни, но и избежать побочных эффектов. Также в Институте физиологии и биохимии растений СО РАН создается вакцина против СПИДа, гепатита на основе трансгенеза томата и огурца. Группе немецких ученых-генетиков из Giessen University во Франкфурте удалось вырастить генетически модифицированную морковь, которая содержит вакцину против гепатита В, что позволяет значительно снизить затраты на профилактику этого заболевания (по официальной статистике ВОЗ около 350 млн человек в мире инфицированы вирусом гепатита В, который приводит к тяжелым повреждениям печени, хронизации процесса и смертельным исходам, ежегодно унося 1 млн человеческих жизней. Трансгенная морковь может расти в разных климатических поясах и на разных грунтах, хорошо хранится, транспортируется, может употребляться в сыром виде. Потребляя этот продукт с пищей, человек как бы постоянно вводит вакцину маленькими дозами, чем поддерживает активность иммунитета к вирусу гепатита В. Крупнейшим в мире производителем и потребителем трансгенных растений являются США, лидирующие как по площадям посевов, таки по степени принятия обществом трансгенной пищи Повсеместное использование там генетически модифицированных растений (от общего количества, взятого за 1 0 0 %) составляет 40 % выращиваемой в стране кукурузы, 81 % сои, 65 % канолы рапса) и 73 % хлопка, и оно продолжает расти. Получением и испытанием таких растений занимаются сотни коммерческих фирм с совокупным капиталом более 1 0 0 млрд долл. На сегодня лидером по выращиванию трансгенного хлопка, устойчивого к насекомым, является Китай. В Аргентине, правительство которой поддерживает выращивание генетически модифицированных культур, доля трансгенной сои составляет 90 %, а кукурузы и хлопка — 50 Ю жно-Африканская Республика — единственная африканская страна с масштабными посадками трансгенных культур — 80% хлопка, 2 0 |