Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
^ _ Препарат bbМ е т ион и н ------------Действие Г ПРИ ^ ^ т и и метионина осуществляется синтез холина (соединение входящее в состав клеточных мембран) из жиров обладает липотропным и гепатропным эффектом _______Овипииие табл. 2 ______ Применение п Ри Циррозах иге bbпатитах печении и и лицам преклонного возраста У которых имеются признаки атеросклероза Цистеин Приостанавливает процесс помутнения хрусталика В начальных стадиях развития катаракты входит в состав глазных капель витайодурсша и др. Тимоген Иммуностимулирующее; усиливает неспецифи ческую резистентность организма Для стимуляции репара- тивных процессов после тяжелых травм (в том числе переломов костей) Ц ере б роли - зин Регулирует процессы регенерации в головном мозге После травм головного мозга инсультов и ишемического голодания головного мозга, а также при задержке умственного развитая У Детеи Р ума л он р а в ер он При артритах и арфозах ВоС"аЛ„Т™п“р ^ " ял ь и о » * ^ Лпя ПроФИЛа 1 СГИ 1 °1тНЫХ Э м б р и ° блаСТ - ------' — ^ ^ б ш 1 И ^ские усиливает процессы ^ ^киии возрастных и шеи ^ ----------- ___- . ляЖйВ" — — да» усЦ°^Н стан<>»леи"Я Перечень препаратов на основе аминокислот и их комплексов постоянно растет и расширяется. Очень хорошую перспективу для успешного развития имеют препараты для парентерального питания, содержащие комплексы аминокислот. Они назначаются, когда питание естественным образом противопоказано, так как стимулирует секрецию пищеварительных желез. Например, при остром панкреатите человек не должен ни пить, ни есть, поскольку любая стимуляция секреции может привести к самопереварива- нию поджелудочной железы. Тенденция сегодняшнего дня — использование препаратов содержащих весь комплекс аминокислот (или, по меньшей мере 18 из них, те. в оптимальном для человеческого организма соотношении. В основном это импортные препараты аминоплазмаль, кетостерил, валин (Германия аминостерил КЕ (Финляндия аминосол (Югославия. Некоторые из этих препаратов помимо аминокислот содержат также глюкозу и витамины. Соотношение аминокислот в них оптимальное. В организме человека в зависимости от возраста синтезируются белки соответствующего состава, например аминокислотный состав этих препаратов для детей приближается к составу грудного молока матери, для взрослых он несколько иной. Установлено, что в любом органе и ткани имеются свои пептиды — соединения, состоящие из небольшого количества аминокислотных остатков, которые образуются и выделяются при их разрушении, стимулируют, как правило, и процессы их регенерации. В соответствии с этим из того или иного органа животных готовят экстракты и на их основе — лекарственные препараты которые используют для терапии заболеваний этих органов. Общим для всех этих препаратов является то, что действующим началом у них являются пептиды. В частности, в препарате на основе тимуса — тимогене таким действующим началом является глута- милтриптофан (дипептид, состоящий из глутаминовой кислоты и триптофана. Аминокислоты также входят в состав комплексных препаратов, применяемых в косметологии. Существуют так называемые космоцевтические медицинские препараты, для получения которых используется фармацевтическое сырье, к чистоте которого предъявляют повышенные требования. При этом известно, что особочистыми являются вещества полученные биотехнологическими методами, например с помощью специально выведенных штаммов-микроорганизмов. Иллюстрацией может служить препарат эмбриобласт, получаемый из эмбриональной зубной ткани овец, содержащий как биостимуляторы (факторы роста, цитокины и др, таки необходимый строительный материал — аминокислоты, нуклеотиды витамины, минералы. В настоящее время аминокислоты получают методами • биологическим (применение гидролиза белоксодержащих субстратов химическим (тонкий органический синтез химико-энзиматическим (энзиматическая трансформация химически синтезированных предшественников аминокислот со б разованием биологически активных изомеров микробиологическим (получение L-аминокислот). Древнейший способ получения аминокислот — кислотный, щелочной или ферментативный гидролиз белоксодержащих субстратов (мясо, молоко и т.д.). При высокой температуре белок расщепляется на соответствующие аминокислоты или фрагменты, состоящие из нескольких аминокислот. При этом образуется смесь аминокислот и пептидов. Извлечение из этой смеси какой либо определенной аминокислоты — довольно сложная, но тем не менее выполнимая задача. Само по себе сырье (мясо и белок молока — казеин) — дорогостоящий продукт, и этот метод применяется, когда имеют дело сбросовым сырьем, тес отходами производства (таким сырьем являются рога, копыта, волосы, перья и пух, состоящие из кератина, в котором содержится очень много серосодержащей кислоты цистеина, ив небольших количествах — других аминокислот). Следующий способ получения чистых аминокислот — химический синтез. Их синтезируют подобно другим органическим кислотам, это несложно. Однако в процессе химического синтеза получается смесь D - и стереоизомеров (иногда получается и большее количество изомеров, а как известно, в белках человека биологически активны только стереоизомеры аминокислот поэтому существуют трудности разделения этих изомеров. Кроме того, химическое производство аминокислот, как правило, связано с использованием дорогостоящего оборудования и нередко агрессивных токсических соединений в качестве исходного сырья Процесс протекает при высокой температуре, требует дорогостоящих катализаторов и как всякое химическое производство сопровождается образованием побочных продуктов, загрязняет окружающую среду, небезопасно и небезвредно для обслуживающего персонала. Тем не менее некоторые аминокислоты получают химическим синтезом, например глицина также D -, метионин, D -изомер которого малотоксичен, поэтому медицинский препарат на основе метионина содержит D - и формы, хотя за рубежом в медицине используется препарат, содержащий только форму метионина. Там рацемическую смесь метионина разделяют биоконвер сией D -формы в форму под влиянием специальных ферментов живых клеток микроорганизмов. Следующий способ получения аминокислот — химико-энзи- матический. Как видно из названия, этот метод получения аминокислот предполагает два этапа. Сначала химическим методом синтезируется предшественник — соответствующая карбоновая кислота, а затем эта карбоновая кислота (обычно в присутствии аммиака) превращается в соответствующую аминокислоту. Эта биотрансформация (биоконверсия) осуществляется ферментами живых клеток. Причем полученные стереоизомеры аминокислот сами по себе необходимы для жизнедеятельности этих клеток, те. фактически этот способ наполовину биотехнологический Таким методом получают, например, аспарагиновую кислоту (на основе фумаровой кислоты. Раствор фумаровой кислоты пропускают через колонки, в которых иммобилизованы или ферменты или клетки микроорганизмов с высокой активностью аспартазы, например, Escherichia coli или Serratia marcesceus; туда же подается аммиак и осуществляется биотрансформация. Аналогичным образом на основе коричной кислоты получают фенилаланин (L-стереоизомер): используя для этого дрожжевые клетки. Химико-энзиматически можно производить практически все аминокислоты, однако из-за дороговизны и сложности получения соответствующих органических кислот-предшественников этот метод не всегда экономически выгоден ив большинстве случаев уступает методу прямого микробиологического синтеза. Четвертый способ получения аминокислот — их прямой микробиологический синтез — целиком основан на использовании биообъектов (те. является полностью биотехнологическим. В качестве биообъектов в нем применяются штаммы-продуценты аминокислот. Этим методом аминокислоты чаще всего получают на основе Escherichia coli (кишечная палочка — симбионт человека Bacillus subtilis (сенная палочка — почвенный микроорганизм) и Corynebacterium glutamicum (почвенный микроорганизм). Все эти микроорганизмы на сегодняшний день прекрасно изучены. Известна полная нуклеотидная последовательность всего их генома. Для кишечной палочки разработаны многообразные способы генетического обмена, позволяющие легко комбинировать разные гены и изменять процесс метаболизма. В меньшей степени это относится к Bacillus subtilis, и еще в меньшей степени к Corynebacterium Использование этих микроорганизмов для получения аминокислот основано на их способности самостоятельно синтезировать все 20 аминокислот. Также они являются гетеротрофными бактериями, которые в качестве источника углерода используют органические соединения (углевод или какую-нибудь органическую кислоту, а все остальные компоненты получают из неорганических соединений. Применение микроорганизмов гетеротрофов позволяет существенно сократить повремени процесс ферментации. Так, кишечная папочка в богатой питательной среде делится каждые 2 0 — 30 мин, коринебактерии — каждый час. В бедных средах — время регенерации в два раза больше ( 1 ч для кишечной палочки, 1,5— 2 ч для коринебактерий и сенной палочки). Вместе стем существуют бактерии, так называемые ауксо- трофные мутанты — микроорганизмы, которые, с одной стороны утратили способность самостоятельно синтезировать необходимые для построения всех компонентов своей клетки разные аминокислоты, ас другой — приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты. Такие мутанты получают либо воздействием различных мутагенов физической и химической природы на исходную культуру микроорганизма с последующей селекцией штамма по заранее заданным признакам, либо методами генной инженерии. Известно, что клетки бактерий синтезируют аминокислоты для удовлетворения собственных потребностей (синтез белка и другие метаболические процессы синтезируется их в клетках бактерий определенное количество. В процессе эволюции (естественного отбора) выживали только те формы, в которых метаболические процессы протекали наиболее экономно, и это обеспечивалось за счет механизмов регуляции этих процессов. Известно, что в регуляции и управлении метаболическими процессами используется принцип обратной связи. Существуют два уровня (механизма) регуляции биосинтеза конечного (целевого) продукта — ретроингибирование и репрессия. На первом уровне образующаяся вцепи последовательных реакций аминокислота ингибирует активность одного изначальных ферментов собственного синтеза. Если этого механизма недостаточно и конечный продукт (аминокислота) все равно присутствует в избытке, то включается второй механизм регуляции ив результате подавляется (репрессируется) образование всего комплекса ферментов соответствующей биосинтетической цепи. На примере биосинтеза аминокислоты треонина: н о n h 2 I можно показать, как реализуются эти принципы в клетках кишечной палочки. Треонина также лизин и метионин относятся к семейству аспарагиновой кислоты. В клетках бактерий сначала синтезируется аспарагиновая кислота H O O C-CH 2 —C H -C O O H n а затем на ее основе синтезируются треонин, метионин и лизин поэтому они и объединены в семейство аспарагиновой кислоты Синтез каждой из этих аминокислот осуществляется в несколько этапов с образованием промежуточных соединений. Каждый из этих этапов катализируется белком-ферментом, синтез которого контролируется (кодируется) соответствующим геном, в нуклеотидной последовательности которого записана структура этого белка. Первая реакция синтеза этих аминокислот — превращение аспарагиновой кислоты в аспартил-фосфат под влиянием фермента аспартокиназы (киназы — ферменты, навешивающие фосфорную группу). Следующий этап — превращение аспартил-фосфата в полуаль- дегид аспарагиновой кислоты (промежуточное соединение. Эту реакцию катализирует фермент дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты. Ген, контролирующий синтез этого фермента, локализуется в другом участке хромосомы и называется ASD. Под влиянием фермента гомосерин-дегидрогеназы, кодируемого геном треонин А, синтезируется гомосерин, который является предшественником для синтеза треонина и метионина. В свою очередь гомосерин под влиянием фермента гомосерин-киназы превращается в гомосерин-фосфат (ген, кодирующий эту реакцию, — треонин В. И, наконец, гомосерин-фосфат под воздействием фермента треонин-синтетазы превращается в треонин. Ген кодирующий образование (синтез) этого фермента, — треонин С При добавлении в среду пирувата из треонина образуется изолейцин (рис. Все структурные гены в хромосоме кишечной палочки расположены в определенной последовательности в общей регуляторной области, которая включает промотор (участок связывания РНК-полимеразы, которая считывает информацию, в результате чего образуется информационная РНК, которая затем присоединяется к рибосомами транслируется, при этом образуется каждый из указанных белков-ферментов) итак называемый аттенуа- тор — регуляторный элемент, который воспринимает сигналы обратной связи. Необходимо подчеркнуть, что синтез треонина происходит одновременно с ростом биомассы и после остановки ее роста синтез треонина замедляется и постепенно прекращается (рис. 16, кривая Регулируется биосинтез треонина в клетках кишечной палочки следующим образом когда треонин в клетках бактерий накапливается в количестве большем, чем его нужно для метабо- 175 Лизин Аспарагиновая кислота Аспа фос этил- фат Ген Треонин А1 (^сп артоки н аза^) Полуальдегид аспарагиновой кислоты Треонин Пируват Изолейцин Метионин Гомосерин Г Ген 1 ^ Треонин В , Гомосерин- Г Ген фосфат Треонин С Треонин- синтетаза Треонин- дезаминаза Рис. 15. Схема биосинтеза треонина у бактерий Escherichia coli лических процессов и синтеза белка, и появляется в свободном состоянии, — он подавляет активность фермента аспартокиназы. Фермент аспартокиназа — аллостерический фермент (alios — другой, имеющий кроме активного центра еще один, так называемый аллостерический центр, который может взаимодействовать с низкомолекулярными эффекторами. И таким эффектором в данном случае является треонин. При присоединении к аллостери- ческом у центру треонин изменяет конформацию аспартокина- зы, в результате чего активный центр становится недоступным для субстрата, и фермент утрачивает активность. В свою очередь подавление активности аспартокиназы ведет к прекращению синтеза аспартил-ф осф ата и, соответственно, прекращается синтез всех промежуточных соединений пути биосинтеза треонина. Когда одного механизма оказывается недостаточно и треонин продолжает накапливаться в избытке, у кишечной палочки включается еще один механизм регуляции биосинтеза — репрессия. При этом , если треонин накапливается в избытке, он превращается в изолейцин, который, в свою очередь, также накапливается виз bbбытке. В тот момент, когда треонин и изолейцин накапливаются в избытке одновременно они опосредованно взаимодействуют с ат тенуатором и подавляют транскрипцию, вызывая ее терминацию. В этом случае синтез всех белков-ферм ентов данного синтетического пути прекращается. Как уже отмечалось, у природных микроорганизмов контроль за скоростью биосинтеза аминокислот исключает их перепроизводство, поэтому выделение аминокислот из клетки в среду возможно лишь у культур с нарушенной системой регуляции. Советскими учеными в конце XX в. был создан ш тамм-суперпродуцент треонина. Использование его в промышленных масштабах позволило увеличить синтез треонина до гл, а время ферментации сократилось до одних суток. Рис. 16. Зависимость синтеза треонина и лизина от роста биомассы — треонин 2 — лизин (/, / / — стадии процесса В промышленном производстве лизина СН 2 - ( С Н) з - С Н — соон I I n h 2 n в настоящее время используется штамм-суперпродуцент корине- бактерий (Corynebacterium glitamicum). Продолжительность ферментации сут. Уровень накопления целевого продукта составляет 5 0 — 100 г/л. Коринебактерии являются грамположительными, более древними в эволюционном отношении микроорганизмами, отличаются от грамотрицательной кишечной палочки также тем, что у них очень низкая активность внутриклеточных протеиназ, поэтому синтезированные клеткой белки-ферменты долго остаются в активном состоянии. Схема биосинтеза лизина представлена на рис. 17. У штамма Corynebacterium glitamicum существует только один механизм регуляции биосинтеза по принципу обратной связи — совместное согласованное) ретроингибирование активности аспартокиназы. Это единственный фермент, активность которого регулируется совместно треонином и лизином. Когда треонин и лизин одновременно избыточно накапливаются в клетке, они вместе присоединяются к аллостерическому центру в результате, активность ас партокиназы подавляется, и этот биосинтетический путь блоки руется. Итак, синтез лизина контролируется треонином и лизином, а чтобы получить штамм-суперпродуцент лизина, нужно убрать треонин, так как треонин и лизин, находясь в избытке, подавляют активность аспартокиназы. Поэтому нужно блокировать синтез треонина. Для этого необходимо получить мутацию, блокирующую этот ген, нов этом случаев питательную среду необходимо добавлять чистый треонин (так как большинство продуцентов лизина неспособны синтезировать гомосерин или треонин — они являются «ауксотрофами» по этим аминокислотам). Если блокировать в другом месте цепи биосинтеза, то мутант будет нуждаться в метионине и треонине, тогда в среду добавляют гомосерин. Если добавить в среду треонин и метионин в ограниченном количестве, то штамм будет расти до тех пор, пока они не будут израсходованы, нов клетках этого штамма будут присутствовать также ферменты, необходимые для синтеза лизина, которые длительно сохраняются в клетках коринебактерий в активном состоянии. И штамм начнет синтезировать лизин, те. синтез лизина штаммом Corynebacterium glutamicum будет осуществляться, только когда исчерпан треонин. Экспериментально подбирают такое количество треонина и метионина, которое привнесении в питательную среду обеспечило бы максимальный синтез лизина. Как только треонин исчезает из среды и рост биомассы прекращается, начинается активный синтез лизина. Таким образом, данный процесс имеет две стадии развития рост биомассы и синтез лизина (рис. 16, кривая 2 Биотехнологи при разработке микробиологической технологии получения аминокислот в процессе культивирования продуцентов подбирают такие условия, при которых скорость синтеза аминокислоты клетками продуцента являлась бы максимально высокой и сохранялась максимально долго, а также образование побочных продуктов биосинтеза сводилось бык минимуму. |