Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
ситетрациклин), который гораздо дольше циркулирует в организме, чем природные тетрациклины. Существует несколько механизмов резистентности к эритромицину. Рибосомы резистентных клеток не связывают эритромицин. В результате антибиотик теряет способность тормозить белковый синтез. Причиной этого является метилирование рибосомной РНК в большой субъединице бактериальной рибосомы. В резистентных клетках специфическая метилаза катализирует введение метальных групп в строго определенный остаток аденина в молекуле рибосомной РНК. В результате изменяется конформация всей большой рибосомной субъединицы, и эритромицин теряет способность связываться с ней и вообще с рибосомой. Ферментативное расщепление макроциклического лактонного кольца, что ведет к потере активности эритромицина. Фосфорилирование или гидроксилирование по ОН-группе одного из присутствующих в молекуле антибиотика сахаров. Поиск новых природных беталактамов и целенаправленная трансформация беталактамной молекулы Мишени для беталактамов в бактериальной клетке, как отмечалось, множественны, в клетке имеются разные виды пенициллин связывающих белков (PBPs). Преимущественное воздействие на белок того или иного вида ведет к разным эффектам — литическому, бактерицидному без лизиса, бактериостатическому с разной длительностью бактериостазиса и т. п. Все это имеет значение для клиники при определении выбора препарата для конкретного больного, режима антибиотикотерапии частоту введения, возможность использования комбинаций двух беталактамных антибиотиков и т.д. У некоторых встречающихся в клинике резистентных к бета лактамам штаммов бактерий резистентность проявляется, как отмечалось, на уровне PBPs, те. мишени уменьшают сродство к старым беталактамам. Поэтому новые природные и полусинтетические беталактамы проверяются на степень сродства к PBPs этих штаммов. Высокое сродство означает перспективность новых беталактам ных структур. Далее, при оценке новых беталактамных структур проверяется их устойчивость к действию разных беталактамаз — пенициллаз и цефалоспориназ плазмидного и хромосомного происхождения, выделенных из разных бактерий. С этой целью используются большие наборы беталактамаз, обладающих разной субстратной специфичностью. Если большинство используемых беталактамаз не инактивирует новую беталактамную структуру то она признается перспективной для клиники и заслуживает дальнейшего углубленного изучения. Первые успехи в этом направлении были получены, когда химиками были созданы нечувствительные к распространенным у стафилококков пенициллиназам полусинтетические пеницилли- ны, такие как метициллин и оксациллин, а также нечувствительный к ферменту из синегнойной палочки карбенициллин. Получить эти полусинтетические пенициллины удалось после того, как из бензилпенициллина была выделена 6-аминопенициллановая кислота (6АПК): 142 условно названная ядром молекулы пенициллина. В промышленных условиях 6АПК производят ферментативным гидролизом либо бензилпенициллина (в России, либо феноксиметилпенициллина за рубежом) с помощью фермента пенициллинацилазы, который осуществляет гидролиз пенициллина по связи СО (между радикалом и ядром) с получением 6АПК. Ацилированием 6АПК были получены указанные антибиотики. Далее было показано, что наличие метоксигруппы или некоторых других заместителей в ба-положении у пенициллинов и, соответственно, в 7а-положении у цефалоспоринов приводит к тому что многие беталактамазы теряют способность гидролизовать бета лактамное кольцо у таких природных или полусинтетических бета лакгамных антибиотиков как, например, у цефамицина С: Эффективность беталактамов против грамотрицательных бактерий зависит и от такого фактора, как скорость прохождения через пориновые каналы. Преимущество здесь имеют компактные молекулы, которые проникают и через катионоселектив ные, и через анионоселективные каналы. Получил, например практическое применение антибиотик такого рода, как имипе- нем: К его ценным свойствам относится также устойчивость кряду беталактамаз. Немалой ценностью обладают беталактамные структуры, у которых вводимые в ядро молекулы-заместители создают в ней катионный центр. NH2 О НОН ОСНз СН— (СН2)з—C - N СООН СООН Беталактамное СН3 / кольцо НО s — c h 2c h 2n h c = n h о СООН 143 Такие беталактамы высокоактивны против многих кишечных бактерий по причине катионоселективности пориновых каналов у бактерий, обитающих в кишечном тракте. В качестве примера можно привести структуру молекулы применяемого в клинике беталактама — цефтазидима: HN СООН Н С С Н 3 \ / 3 НООС—С - ОС - II О -+N Г W -NH N Отметим, что химические модификации все чаще затрагивают структуру сконденсированного с беталактамом пяти- или шестичленного кольца. Если сера в пятичленном (пенициллины) или шестичленном (цефалоспорины) кольце замещена на кислород или углерод, то соединения называют нетрадиционные или неклассические беталактамы. К ним относится уже упоминавшийся, быстро проникающий через пориновые каналы имипенем. Также к нетрадиционным относят и такие беталактамы, в которых беталактамное кольцо не сконденсировано с другим кольцом пяти- или шестичленным. Они получили название «монобакта- мы, а наибольшую известность приобрел ценный для медицинской практики препарат азтреонам: Беталактамное кольцо S — СО г н \ \ II / / С Н 3 H2N - C 4 .С—С Ст х А i Я I 0 ° SOjH 1 H jC X I ^ C 0 С Н 3 144 Значительный интерес представляют также природные соединения с гаммалактамным, те. пятичленным, кольцом, обладающие высокой антибактериальной активностью и широким спектром действия. Их мишенями, как и у беталактамов, являются транспептидазы пептидогликана, те. разные PBPs. При контакте с мишенью гам мал актам ное кольцо подобно беталактамному расщепляется и происходит ацилирование одного из аминокислотных остатков в активном центре транспептидаз. Беталактамазы могут, как оказалось, инактивировать и гаммалактамы. Однако большая стабильность пятичленного гаммалактамного кольца по сравнению с четырехчленным беталактамным расширяет возможности химического синтеза, те. получение синтетических гамма лактамов с пространственной защитой гаммалактамного кольца от беталактамаз. Ряды получаемых синтетических гаммалактамов быстро растут и некоторые из этих соединений уже проходят предклинические испытания. Пути борьбы с антибиотикорезистентностью Потребность периодического обновления используемых в медицине антибиотиков обусловлена постепенным распространением в микромире вариантов резистентности к антимикробным препаратам. Постоянное применение в клиниках определенного географического региона конкретного антибиотика в течение 20 — 30 и более лет приводит к тому, что резистентные к нему штаммы начинают обнаруживаться все чаще. Применяемые в медицинской практике антимикробные антибиотики, непосредственно с геномом микроорганизмов не реагируют, те. не являются мутагена ми. Однако в популяциях микроорганизмов происходят, хотя и редко, разнообразные спонтанные мутации отдельных генов причины которых неизвестны. Образуются мутанты с измененными субклеточными структурами и отклонениями в метаболизме Нормальные клетки, являясь результатом длительной эволюции хорошо приспособлены к окружающим их естественным условиям. Мутанты к таким условиям приспособлены хуже и, спустя определенное время, после ряда генераций исчезают, однако, если сама окружающая среда изменилась и эти изменения длительно сохраняются, то мутантные формы микроорганизмов могут оказаться лучше приспособленными к новым условиям, что и объясняет распространение такого разнообразия антибиотикорезистент ных форм. Одни и те же антибиотики при их массовом и непрерывном применении играют роль селективных факторов отбора резистентных к ним мутантных микроорганизмов. В этом случае именно мутанты, обладающие резистентностью, реализуют свой потенциал. Исходные антибиотикочувствительные культуры такой возможности не получают даже в том случае, если их скорость размножения в свободной от антибиотиков среде выше, чему мутантов. Спонтанные мутации — отнюдь не единственный источник генов резистентности. У продуцентов некоторых антибиотиков, например аминогли- козидов, существуют ферменты, модифицирующие или трансформирующие молекулу собственного антибиотика, что приводит к его последующей инактивации. Гены, кодирующие ферменты инактивации, могут включаться в ДНК некоторых фагов, а иногда ив плазмиды и переноситься из продуцентов в клетки патогенных и непатогенных бактерий. Таким образом, попадание генов резистентности в патогенные микроорганизмы предопределено существованием в биоценозах самих продуцентов антибиотиков. Есть прямые доказательства того, что гены резистентности к антибиотиками, соответственно, разные механизмы этой резистентности существовали до концах гг. — до того времени когда стали применяться пенициллин, стрептомицин, левомицетин, тетрациклины. Музейные коллекции культур бактерий, хранившиеся с конца XIX вине соприкасавшиеся с препаратами антибиотиков музейные культуры пересеваются два—три раза в год в боксах с особыми предосторожностями, содержат, хотя и редко, варианты, стойкие к тем или иным антибиотикам. Например, у таких культур были обнаружены гены, кодирующие образование бета лактамаз. Еще одно доказательство изначального существования генов антибиотикорезистентности было получено в х гг. микробиологами в труднодоступных районах планеты, где местное население еще не соприкасалось с антибиотиками (в верховьях Амазонки, на островах Полинезии. Из кишечной микрофлоры аборигенов, хотя и очень редко, но выделяли штаммы с генами резистентности, обусловливающими образование беталактамаз или ферментов, инактивируюших антибиотики аминогликозид- ной структуры. Все перечисленные факты свидетельствуют, что полностью избавиться от генов резистентности теоретически невозможно однако частоту их распределения можно минимизировать. Изъятие антибиотика из клинической практики будет означать уменьшение распространенности генов резистентности к нему. Через определенное время антибиотики близкие к нему препараты восстановят свою эффективность и могут быть возвращены в лечебную практику. Так, в США ставший малоэффективным стрептомицин, был вытеснен из лечебной практики гентамицином, ами- кацином, полусинтетическими беталактамами и другими новыми антибиотиками. В небольших городах, не являющихся транзитными пунктами для большого количества людей, стрептомицин восстановил свою эффективность спустя примерно 20 лет после прекращения его применения. В Нидерландах было запрещено использование тетрациклина в животноводстве ввиду широкого распространения тетрациклино резистентных сальмонелл. Уже через пять лет после этого частота встречаемости этих бактерий в стране снизилась в два раза, а применение тетрациклина при случаях пищевых отравлений стало в два раза более эффективным. Общая стратегия в борьбе с антибиотикорезистентностью может заключаться в последовательной замене одних препаратов другими с возвращением старых препаратов в практику через определенный срок. Такая цикличность быстрее приведет к желаемым результатам, если она будет соблюдаться в крупных географических регионах. В настоящее время в клинической практике ассортимент антибиотиков и других антимикробных препаратов не позволяет достаточно эффективно полностью заменять одни группы антибиотиков другими. Однако при условии получения ряда новых групп антибиотиков принцип цикличности мог бы быть реализован. В этом случае произойдет постепенное значительное уменьшение генов резистентности к представителям временно исключенных из лечебной практики групп антимикробных препаратов. Таким образом, не только эффективность лечения, но и возвращение к экологическому равновесию в окружающей человека микрофлоре требует усиления работы в области создания методами биосинтеза и оргсинтеза антибиотических средств с новыми механизмами действия. Контрольные вопросы. Какова биологическая роль антибиотиков как вторичных метаболитов Как накопление антибиотика — целевого продукта согласуется с накоплением биомассы. Каковы пути создания высокоактивных продуцентов антибиотиков. Каковы механизмы зашиты от собственных антибиотиков у их су перпродуцентов? 5. Каковы особенности ферментации актиномицетов и бактерий (эубак- терий) как продуцентов антибиотиков. Почему в инструкциях по применению антибиотиков существуют указания на PBPs2 и PBPs3? 7. Какую опасность представляют хромосомная и плазмидная резистентность К. Какими препаратами антибиотиков представлены новые поколения цсфалоспоринон и пенициллинов? 9. Каков механизм резистентности к аминогликозидным антибиотикам. В чем преимущества целенаправленной трансформации аминогли- козидов на примере антибиотика амикацина? 11. Какие аналоги эритромицина, превышающие его эффективность в отношении внутриклеточных возбудителей инфекции, известны в настоящее время. Какие природные источники генов резистентности к антибиотикам существуют. Какие организационные мероприятия ограничивают распространение генов антибактериальной резистентности Глава ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ, ПОЛУЧАЕМЫЕ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ. Стероиды К фармацевтическим препаратам, в производстве которых используется биотехнология, принадлежат стероидные гормоны к основным представителям которых относятся кортикостероиды, прогестогены, эстрогены и андрогены. Они не только участвуют практически во всех жизненно важных функциях организма, но и как лекарственные средства высоко избирательны, имеют большую широту спектра действия. В медицинской практике стероидные гормоны применяются в качестве противовоспалительных, диуретических, анаболических, контрацептивных, противораковых лекарств. При сравнении структуры наиболее ценных кортикостероидов, прогестогенов, эстрогенов и андрогенов можно обнаружить что все они содержат в положении С кетогруппу, кроме эстрогенов, у которых кольцо А — ароматическое. Кортикостероиды содержат при С гидроксизамещенную ацетильную группу. Их отличительной особенностью является наличие кислородной группы у 11 -го углеродного атома. Андрогены и эстрогены в положении С -17 имеют карбонильную или гидроксильную группы, а их модифицированные аналоги — алкильную или этинильную группу. К стеринам (стеролам) относятся стероиды, имеющие в положении С гидроксильную группу. В основе истории синтеза стероидных гормонов лежат методы биотрансформации (биоконверсии), результатом применения которых является превращение метаболитов в структурно родственные соединения под влиянием микроорганизмов или микробных клеток. В этом процессе весьма существенно, что микроорганизмы могут влиять только на отдельные (единичные) стадии довольно сложных и длительных процессов химического синтеза. Общей чертой всех процессов микробиологической трансформации является изменение именно молекулярной структуры трансформируемого вещества, а не синтез молекулы de novo. Основные процессы микробиологической трансформации — это окисление восстановление, декарбоксилирование, дезаминирование, гидролиз, метилирование, конденсация, изомеризация и т.д. Реакции биотрансформации в большинстве строго специфические, осуществляются индуцибельными ферментами в строго определенном порядке. Так, например, процесс гидроксилиро- вания относится к дыхательным системам (гидроксилаты содержат ионы железа или цинка, а в дегидрировании участвуют ферменты флавиновой природы, содержащие рибофлавин и витамин В12. С позиций физиологии биотрансформация стероидных соединений как источников углеродного питания (стерины расщепляются до Си Н ) связана с метаболизмом микроорганизмов, в процессе которого происходит детоксикация субстрата например, 11а-оксисоединения обладают меньшим отрицательным влиянием нарост и дыхание клеток). Использование биотрансформации при получении тех или иных продуктов известно с древних времен. В качестве примера можно привести методику получения уксуса еще во времена Древнего Вавилона (около 5 ООО лет дон э, когда этиловый спирт с помощью микроорганизма Gluconobacter suboxidans превращали в уксусную кислоту (естественно, что все подобные методы носили чисто эмпирический характер и не имели никакой научной подо плеки). В настоящее время возможности и достоинства использования биотрансформации проявились наиболее ярко в области превращений стероидных соединений. Дело в том, что сложность и громоздкость молекул стероидов затрудняет даже незначительные их модификации химическим путем. Микроорганизмы могут осуществлять уникальные реакции в синтезе лекарственных препаратов стероидной природы, например дегидрирование и аи (З-гид- роксилирование. Промышленный синтез таких важнейших лекарств, как гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон стал возможен только после разработки микробиологических способов их получения. Первые сообщения о микробиологической трансформации стероидов появились задолго до установления их химической структуры. Так, еще в XIX в. было известно, что бактериальная флора кишечника млекопитающих превращает холестерин в капросте- рин, а холевую кислоту в дезоксихолевую. В 1913 г. было открыто полное расщепление холестерина микобактериями, но только в 1930 гг., после установления структуры основных стероидных гормонов, стали пытаться применить биотрансформацию как метод получения этих соединений. В те годы ученые Базельского университета впервые получили из надпочечников кортизон. Однако лишь десять лет спустя было установлено, что кортизон эффективен при лечении ревматоидного артрита. |