Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
Ингибирование происходит вследствие избирательного подавления активности тех или иных ферментов, включенных в многоэтапный синтез основного полимера клеточной стенки — пепти- догликана. В число ингибиторов синтеза пептидогликана входят цефалоспорины и другие вещества беталактамной структуры. Пептидогликан, в соответствии со своим названием, состоит из принципиально разных частей. Его длинные параллельные гли- кановые нити построены из перемежающихся остатков двух сахаров N -ацетилглюкозамина и мурамовой кислоты. Мурамовая кислота (ее название — от греч. цири£ — стена, так как впервые она была обнаружена в клеточной стенке бактерий) является эфиром N-ацетилглюкозамина и молочной кислоты. Пептидная часть полимера состоит из коротких пептидных цепочек (трех — пяти аминокислотных остатков, отходящих от остатков мурамовой кислоты в гликане. Пептидные цепочки, ответвляющиеся таким образом от параллельных гликановых нитей, замыкаются пептидной связью Между параллельными нитями гликана образуются поперечные пептидные мостики и формируется завершенный или целостный пептидогликан, который жесткой сетью охватывает всю бактериальную клетку (рис. Грамположительные бактерии имеют толстый слой пептидо гликана; у грамотрицательных он гораздо тоньше. Беталактамные антибиотики (все без исключения) вовремя биосинтеза пептидогликана подавляют катализируемое ферментами замыкание пептидных цепочек в пептидные мостики. Гли- кановые нити остаются разъединенными формирования непрерывной сети пептидогликана, охватывающей клетку, не происходит. Это означает, что пептидогликан теряет свои свойства жизненно необходимые бактериальной клетке. Бактериальные клетки делятся, увеличиваются в размерах, вновь делятся и т.д., а это требует постоянного синтеза пептидогликана и вставки вновь синтезированных фрагментов в полимер, который для этого разрезается специфическими гидролазами пептидогликана. В нор Рис. 14. Фрагмент структуры пептнлогликана: 1 — гликан; 2 — незамкнувшнеся пептидные цепочки 3 — пептидные мостики мальных условиях в клетке сохраняется баланс между действием ферментов, гидролизующих пептидогликан и синтезирующих его. В присутствии беталактамных антибиотиков этот баланс нарушается. Прекращается синтез пептидогликана, но его ферментативный гидролиз продолжается и даже усиливается из-за того что клеточная стенка теряет некоторые компоненты, сдерживающие их активность путем обратимого блокирования гидролаз Гидролизуются и гликановые нити, и пептидные мостики. Механизм антибиотической активности беталактамов связан с теми ферментами — мишенями, которые не имеют аналогов в животной клетке. В ней нет ни жесткой клеточной стенки, ни пептидо гликана, ни, соответственно, ферментов его синтеза. Таким образом. беталактамы не могут быть токсичны для организма человека, а если у некоторых из них при определенных условиях выявляются токсические свойства или аллергенность, то это никак не связано с механизмом их антибактериального действия. Ингибиторы белкового синтеза у бактерий К ним относятся все аминогликозиды (стрептомицин, гентами- цин и др, а также тетрациклины, эритромицин, левомицетин и некоторые другие антибиотики. Эти антибиотики реагируют с рибосомами бактерий, в результате чего синтез белка в рибосомных системах прекращается. Цитоплазматические рибосомы животной клетки реагируют сними гораздо слабее или вообще не связывают указанные антибиотики. Рибосомы митохондрий животной клетки близкие по свойствам к бактериальным) защищены от перечисленных антибиотиков митохондриальной мембраной. Два этих обстоятельства и создают возможность использования этих антибиотиков в клинике, те. делают их малотоксичными для человека. Существуют антибиотики, реагирующие с рибосомами и микроорганизмов, и животной клетки. В медицинской практике они не используются, но производятся как реагенты для биохимических и молекулярно-биологических исследований (например, антибиотик циклогексимид). Как правило, ингибиторами белкового синтеза являются бактериостатические вещества. Прекращение синтеза белка само по себе не ведет к гибели клетки. В опытах in vitro клетки прекращают размножение и постепенно, очень медленно отмирают. Если же антибиотик вызывает бактериостазис в макроорганизме, то прекратившие размножение клетки уменьшаются в количестве гораздо быстрее, так как уничтожаются защитными силами организма хозяина. Среди ингибиторов белкового синтеза оказались и бактерицидные вещества — большая группа антибиотиков аминогликозидов. Последние реагируют с малой рибосомной субъединицей и связываются именно стем ее местом, где происходит узнавание кодона информационной РНК антикодонами транспортных РНК. В результате нарушается точность узнавания. В синтезируемый в это время рибосомной (точнее полисомной) системой белок включаются аминокислоты, несоответствующие последовательности аминокислот в этом белке, закодированной в информационной РНК. Это явление получило название нарушение точности передачи генетического кода на стадии трансляции». Хотя аминогликозиды быстро прекращают белковый синтез особенность места их связывания на рибосоме приводит к тому что до прекращения работы рибосомных систем с них успевает сойти некоторое количество белковых молекул с неправильной последовательностью аминокислот. Эти белки, получившие название летальных, включаются в цитоплазматическую мембрану бактериальной клетки и нарушают ее молекулярную организацию. Клетка начинает терять низкомолекулярные метаболиты коферменты, неорганические ионы. Все это ведет к дисбалансу ферментативных реакций и гибели клетки. Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот К этой группе антибиотиков (антрациклины, блеомицин, оли- вомицин и др) относится ряд ДНК-тропных противоопухолевых веществ. Они подавляют синтез РНК, а некоторые из них — синтез и ДНК, и РНК, поскольку связываются с ДНК (последняя играет роль матрицы как при репликации ДНК, таки при транскрипции, те. синтезе РНК). Такие антибиотики всегда заметно токсичны, потому что связываются с ДНК любого происхождения — бактериального, вирусного, растительного, животного. Возможность их применения как цитостатиков в онкологической практике обусловлена тем что клетки опухолей растут (размножаются) быстрее клеток нормальной ткани, и антибиотический эффектна опухоли выражается сильнее. В инфекционной клинике ДНК-тропные препараты не принято употреблять ввиду их токсичности и наличия в распоряжении лечащего врача ряда более избирательно действующих антимикробных антибиотиков. Ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот могут быть не только ДНК-тропные антибиотики. Антибиотик рифампицин — ингибитор синтеза РНК, связывается нес ДНК-матрицей, ас ферментом — РНК-полимеразой, причем связывается избирательно только с ферментом из бактерий, а не из животных клеток. Ри фампицин применяется для лечения ряда инфекций, в том числе туберкулеза, так как может длительно вводиться человеку без проявления токсичности. К числу ингибиторов ферментов, участвующих в синтезе и превращениях нуклеиновых кислот, относятся и новые синтетические антибактериальные вещества — фторхинолоны, внедряемые в настоящее время в лечебную практику. Эти препараты обладают широким антибактериальным спектром действия. В качестве примера можно привести пефлоксацин (абактал): преимущественно влияющий на грамотрицательные бактерии и норфлоксацин (нолицин): отличающийся от первого отсутствием метильной группы в пипе- разинильном ядре и более высокой антибактериальной активно стью. О О ОН С2Н5 С2Н5 129 Отметим, что есть данные о влиянии фторхинолонов на развитие хрящевой ткани (в связи с этим применение фторхинолонов в детской клинике не рекомендуется. Они не являются продуктами биотехнологического производства. Вместе стем, учитывая их практическую важность, а также возможность получения ковалентно связанных цефалоспоринов с фторхинолонами, целесообразно кратко рассмотреть механизм их действия. Фторхинолоны являются ингибиторами фермента ДНК-гира- зы. Функция этого фермента — введение в кольцевую ДНК «су первитков» или скручивание ее молекулы. Молекула ДНК становится более компактной, а также приобретает внутреннее напряжение при разрезании ее рестриктазами комплементарные нити быстро расходятся, чем облегчается действие ДНК- и РНК полимераз при репликации ДНК или транскрипции (синтезе РНК на ДНК-матрице). Фермент ДНК-гираза состоит из нескольких субъединиц и катализирует несколько реакций, в том числе требующих энергии при введении в ДНК супервитков. Фторхиноло ны подавляют функции так называемой субъединицы А. Бактериальная ДНК-гираза относится по классификации ферментов к ДНК-топоизомеразам. В реакции с ДНК-топоизомеразами животной клетки фторхинолоны не вступают. Ингибиторы функций цитоплазматической мембраны микробной клетки Среди применяемых в лечебной практике антибиотиков ста bbким механизмом действия наиболее известны противогрибковые антибиотики полиеновой тес сопряженными двойными связями) структуры нистатин, амфотерицин В, леворин. Они реагируют со стеролами в мембране патогенных грибов и дрожжей, в результате чего образуются поры, через которые вытекают низкомолекулярные метаболиты, и клетка гибнет. Эргостерол (основной стерол в мембране грибов и дрожжей) реагирует с поли- еновыми антибиотиками быстрее и при более низких концентрациях, чем холестерол (холестерин) мембраны животных клеток Эта реакция лежит в основе избирательного действия полиенов. Тем не менее полиены — препараты в основном только наружного и полостного применений. Если рассматривать механизм действия антибиотиков на молекулярном уровне, то выявляются различия уже между представителями одной и той же группы, те. близкого механизма действия. Например, разные ингибиторы белкового синтеза реагируют с разными субъединицами рибосом и с разными местами на этих субъединицах. При этом подавляются, естественно, разные реакции такого сложного многоэтапного процесса, как белковый синтез. Указанное обстоятельство объясняет причину применения в клинике не одного, а разных ингибиторов белкового синтеза, поскольку на молекулярном уровне механизм их действия неодинаков. Второй пример относится к беталактамным антибиотикам Мишенями в клетке для пенициллинов и цефалоспоринов являются ферменты транспептидазы и 0 ,0 карбоксипептидазы, которые катализируют последние реакции сложного процесса синтеза полимера клеточной стенки бактерий — пептидогликана. Активный центр этих ферментов имеет сродство к остаткам аминокислот, которыми заканчиваются пептидные цепочки. Почти у всех бактерий последняя и предпоследняя аминокислота в пептидной цепочке — D -аланин. Беталактамное кольцо в молекуле антибиотиков, подавляющих активность транспепти даз и 0 ,0 -карбоксипептидаз, имеет сходство с одной из стерео форм, которые принимают попавший в активный центр свободный конец пептидных цепочек, являющийся О-аланил-Б-ала- нином. Попав в активный центр ферментов-мишеней, беталактам- ный антибиотик после расщепления своего беталактамного кольца ковалентно связывается с ферментом, ацилируя одну из гидроксильных групп в активном центре. Бактериальная клетка содержит несколько разных по молекулярной массе транспептидаз, например, участвующих в элонгации (удлинении, росте палочковидных клеток) пептидогликана или в формировании полюсов клеток, или в образовании пептидогликановой перегородки при делении клетки. Сродство у разных беталактамных молекул к разным транспеп тидазам, получившим название «пенициллинсвязывающие белки (Penicillin bounding proteins): PBPsl, PBPs2, PBPs3 и др, неодинаково. Поэтому фактически неодинаков и механизм действия разных беталактамов. Все это непосредственно сказывается на лечебных свойствах беталактамных антибиотиков. Важность сведений о механизме действия антибиотиков, в частности беталактамов, для лечащего врача или фармацевта наглядно демонстрируется тем, что в самые короткие по тексту рекламные материалы, рассчитанные на широкие круги практических работников, зарубежные фирмы нередко вставляют строку новый беталактам реагирует с таким-то «пенициллинсвязыва- ющим белком (конкретным PBPs). К сожалению, наши специалисты мало знакомы с этим критерием, определяющим продолжительность антибиотического эффекта препарата, переносимость его определенными категориями больных и другие важные каче ства. Изложенное свидетельствует о необходимости знания врачами и фармацевтами основ механизмов действия антибиотиков 7.5. Антибиотикорезистентность 7.5.1. Молекулярные механизмы Выделяют четыре основных механизма резистентности антибиотиков изменение конформации внутриклеточной мишени для данного антибиотика. Антимикробный агент проникает в клетку, но его мишень (транспептидаза пептидогликана, рибосома, ДНК-гираза и т.д.) его не связывает и подавления метаболизма не происходит уменьшение проницаемости оболочки микробной клетки для антибиотика. Антибиотик хотя и проникает в клетку, нов незначительных количествах появление в оболочке клетки системы активного выброса проникающего в клетку антибиотика, вследствие чего его внутриклеточная концентрация не может оказываться высокой ферментативная инактивация антибиотика защитными ферментами. Этот последний тип защиты микробной клетки для нее наиболее эффективен и является очень частой причиной неудач антибиотикотерапии. Ферментативной инактивации подвергаются все важнейшие группы антибиотиков пенициллины и цефалоспорины, аминогликозиды, эритромицина также некоторые другие антибиотики. Формирование в бактериальной клетке указанных защитных механизмов обусловлено появлением генов резистентности не только в хромосоме. Большое внимание привлекают и внехромо- сомные (плазмидные) генетические элементы микробной клетки — кольцевые молекулы ДНК, имеющие размер в сотни раз меньший, чем хромосомы. Плазмиды, несущие гены резистентности к антибиотикам, получили название R-плазмид (более старый термин — R-факторы). Основная опасность плазмидной резистентности в генетическом плане состоит в том, что плазмиды передаются из клетки в клетку конъюгацией (аналог полового процесса) — без деления клетки, однако плазмида при этом реплицируется. Таким образом, одна клетка может быстро передать резистентность большому количеству клеток. Этому способствует и многокопийность плазмид некоторых типов. Возник даже термин инфекционная резистентность, те. заражение резистентностью одних клеток от других. Плазмидная резистентность редко встречается лишь в случае первого из перечисленных выше механизмов резистентности. Причиной антибиотикорезистентности, вызванной изменением конформации внутриклеточной мишени, являются спонтанные мутации в структурном гене, определяющем структуру той мишени макромолекулы, с которой связывается антибиотик. В результате таких мутаций меняется аминокислотная последовательность в ферменте или в рибосомном белке, что ведет и к изменению конформации молекулы, перестающей связывать антибиотик. Мутировавшие хромосомные гены могут быть согласно принятому термину мобилизованы, те. оказаться в плазм идах и быть переданы в другие клетки за счет механизмов распространения плазмид. Однако переноса резистентности при этом в большинстве случаев не происходит. В новой клетке-хозяине будут работать (экспрессироваться) как свои (хромосомные, таки чужие (пл аз мидные) структурные гены, ив результате часть мишеней для антибиотика будет чувствительной к нему — будет его связывать, а часть — резистентной. В таких случаях антибиотик оч ув- ствительность доминирует над ан тибиотикорезистентностью Именно поэтому при выявлении резистентности за счет изменения конформации мишеней гены резистентности оказываются локализованными в хромосомах. Исключения здесь связаны стем и случаями, когда изменения конформации мишени происходят не вследствие мутации в ее структурном гене, а в результате ферментативной модификации уже синтезированной мишени. Ген фермента, модифицирующего мишень, может иметь не только хромосомную, но и плазмидную локализацию. Особенно часто плазмидная локализация генов резистентности встречается при ферментативной инактивации антибиотиков Иногда водной плазмиде оказываются локализованными несколько генов, кодирующих ферменты, воздействующие на антибиотики разных групп. Отсюда возникло понятие пол и резистентности микроорганизмов. Полирезистентные штаммы возбудителей инфекций представляют серьезную проблему вин ф е к ц ионной клинике. Мишени, на которые направлены антибиотики, располагаются или в цитоплазматической мембране ферменты биосинтеза пептидогликана), или в самой цитоплазме рибосомы, ферменты биосинтеза белка, биосинтеза нуклеиновых кислот и т д .) . Чтобы достигнуть мишени, антибиотик должен проникнуть через внешнюю мембрану и клеточную стенку, а иногда через цитоплазматическую мембрану (если мишени находятся в цитоплазме. Резистентность к антибиотикам нередко обусловлена особыми изменениями в оболочке бактериальной клетки. Подоболочкой подразумевается совокупность, состоящая из внешней мембраны только у грамотрицательных бактерий, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Клеточная стенка, хотя и является жесткой решетчатой структурой, построенной из пептидогликана, нем ож ет препятствовать проникновению небольших молекул антибиотиков. За последние десятилетия неоднократно отмечалось возрастание роли грамотрицательной микрофлоры вин ф ек ц ионной патологии. Это относится к инфекционным осложнениям при хирургическом вмешательстве, к урологическим инфекциями т.д. Большую роль в инфекционном процессе играют грамотрицательные неферментирующие бактерии. Возрос интерес к присущей всем этим микроорганизмам внешней мембране. Основные компоненты последней липополисаха- |