Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
средства Успехи генетической инженерии привели к тому, что свыше 100 белков человека (биорегуляторов, корректоров гомеостаза, факторов врожденного и приобретенного иммунитета) могут сохранять свою видоспецифичность. Они нарабатываются как лекарственные средства путем микробиологического синтеза. При этом технология рекомбинантной ДНК позволяет их совершенствовать повышать физиологическую активность, снижать вероятность побочных реакций после введения и т.д. Основным при получении рекомбинантных белков является решение проблемы дефицита сырья, так как из человеческих тканей в промышленном масштабе получать их, естественно, невозможно. При выборе микроорганизма (как продуцента чужеродного белка предполагаемого лекарственного препарата) необходимо • наиболее полно изучить геном подробно исследовать метаболизм на уровне вида чтобы микроорганизм обладал умеренной патогенностью (виде але предполагается ее полное отсутствие чтобы микроорганизм был способен расти в условиях производства на недефицитных и экономически доступных средах. Избранные в качестве предполагаемых продуцентов микроорганизмы оцениваются и изучаются уже на уровне конкретных штаммов. При необходимости штаммы-биообъекты (как носители чужеродного генетического материала и продуценты чужеродного белка) могут быть усовершенствованы методами генетической инженерии, что позволяет свести к минимуму вероятность протео- лиза чужеродных белков, гидролиза чужеродной информационной РНК и исключения чужеродных генов из генома. Таким образом, в данном случае общей целью является ограничение активности способствующих гомеостазу клетки систем репарации, включающих нуклеазы и протеазы. Иногда чужеродный белок может откладываться в клетке продуцента в виде белковых гранул (в недоступной для протеаз форме, что характерно, например, для Е. Особое внимание привлекает проблема секреции чужеродных белков, так как выделение целевого белка в высокоочищенном виде из культуральной жидкости — задача гораздо более легкая, чем выделение его из клетки. Как известно, секретируемые белки отличаются от несекретируемых тем, что имеют на N -терминусе так называемую лидерную последовательность аминокислотных остатков, которая способствует переносу их через мембрану клетки в среду. На последней стадии контакта секретируемого белка с поверхностью образовавшей его клетки лидерная последовательность отделяется от основной полипептидной цепи. В соответствии с этим вводимый в микробную клетку чужеродный ген (точнее оперон) подвергается модификации либо его нуклеотидная последовательность целенаправленно увеличивается таким образом, чтобы в чужеродном белке оказывалась лидерная последовательность аминокислот, либо конструируются гибридные опероны с общим промотором, включающие ген чужеродного белка и ген секретируемого белка, лидерная последовательность которого извлекает из клетки чужеродный белок. Далее два белка разделяются принятыми химическими или ферментативными методами. В качестве продуцентов рекомбинантных белков человека чаще других в настоящее время используются Escherichia coli (кишечная палочка, Bacillus subtilis (сенная палочка, Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи. Первые два микроорганизма — прокариоты, последний — эукариот. Эти организмы достаточно безопасны, однако попадание их (как продуцентов того или иного человеческого белка) в окружающую среду по ряду причин нежелательно. В связи с этим существуют принятые и тщательно соблюдаемые правила работы с рекомбинантами. Безопасность должна соблюдаться на генетическом и на физическом уровнях. Безопасность на генетическом уровне означает, что в геном продуцента чужеродного белка (помимо чужеродных генов) вносится еще одно изменение — из него удаляются некоторые гены, например, участвующие в синтезе аминокислоты, существенной для роста микроорганизма. Иными словами, организм делается зависимым от наличия в среде этой аминокислоты. Если же клетки данного микроорганизма оказываются вне среды, то они не размножаются, те. опасность заражения территории предприятия культурой рекомбинанта значительно уменьшается. Нельзя не отметить, что продуценты чужеродного белка не отличаются высокой способностью к выживанию в природных условиях. Точнее, они утрачивают способность образовывать ненужный им чужеродный белок, так как потеря этой способности ускоряет размножение клеток медленно же размножающиеся клетки, которые продолжают синтезировать чужеродный им белок, постепенно исчезают из популяции. Меры безопасности принимаются и на физическом уровнена всех местах выброса газа устанавливают микробиологические фильтры. По завершении рабочего цикла без разъединения системы, что может привести к понижению давления во всех емкостях, где могут оказаться клетки рекомбинанта, так как вследствие нарушения герметизации воздух вместе с чужеродными клетками будет втягиваться в систему, оборудование стерилизуют. И последнее — на производстве должны соблюдаться все требования Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств (Все перечисленное в равной мере относится к производству любых рекомбинантных белков. В качестве примера можно взять производство рекомбинантного инсулина. На первом месте по объему производства и стоимости продукции рекомбинантного белка как лекарственного средства находится хорошо известный гормон — инсулин, контролирующий уровень глюкозы в крови. Промышленное производство рекомбинантного инсулина было впервые начато в 1982 г. В настоящее время его годовой оборот составляет около одной трети общего оборота всех рекомбинантных белков, используемых в медицине. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей. Цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, а цепь В — 30 аминокислотных остатков. Между собой цепи Аи В связаны двумя дисульфидными ( — S — S —) связями. Еще одна такая связь имеется между остатками цистеина, находящимися вцепи. Общая стереоструктура молекулы поддерживается этими тремя дисульфидными связями и любое изменение в ней ведет к исчезновению гормональной активности инсулина. Традиционный источник инсулина — поджелудочные железы сельскохозяйственных животных — свиней и крупного рогатого скота. Но используется не вся железа, а лишь ткань так называемых островков Лангерганса». Российский рынок ежегодно потребляет примерно одну тонну инсулина. Подсчитано, что для получения такого количества инсулина требуется приблизительно 35 млн голов свиней. Известно также, что количество лиц, нуждающихся в систематическом введении инсулина, ежегодно возрастает на несколько процентов, поэтому проблема дефицита сырья применительно к инсулину животного происхождения существует до сих пор. Однако не только этим обстоятельством обусловлен интерес к рекомбинантному инсулину, получаемому путем микробиологического синтеза. Инсулин, выделяемый из поджелудочной железы свиней, отличается от инсулина человека на один аминокислотный остаток. Инсулин крупного рогатого скота — натри. Это означает, что при введении их человеку он получает белок (полипеп тид) иной видоспецифичности. Следовательно, существует определенный процент случаев проявления аллергии. Также при парентеральном введении (особенно у детей) может наблюдаться болезненность. Одновременно приходится сталкиваться с проблемой передозирования, поскольку в случае аллергии инсулин (как антиген) частично нейтрализуется и, соответственно, вводить его необходимо больше. Кроме того, предшественник инсулина при его биосинтезе в животной ткани, так называемый проинсулин, содержит еще одну полипептидную цепь (пептид С. Позднее эта цепь отделяется от зрелой (завершенной) формы гормона, однако при выделении инсулина из животных клеток от примеси проинсулина избавиться трудно. Как разв пептиде С видовые различия аминокислотной последовательности гораздо более велики (по сравнению с самим инсулином, те. побочные эффекты инсулина Животного происхождения в значительной степени обусловлены чужим пепти дом. Рекомбинантный инсулин, синтезируемый в микробной клетке, лишен указанных недостатков, поскольку аминокислотная последовательность двух его цепей кодируется генами человека. В принципе, он идентичен инсулину из человеческой ткани. Правда, его выделение и очистка требуют особой тщательности, так как в этом случае необходимо освобождаться от микробных липо- и гликопротеинов. Их примеси в рекомбинантном инсулине вследствие токсичности могут вызвать нежелательные побочные эффекты. Однако это уже относится к качеству отдельных серий препарата и культуре производства на данном предприятии В настоящее время в производстве рекомбинантного инсулина конкурируют две принципиально разные технологии. Согласно первой в клетки микроорганизма-хозяина вводят плазмиду, содержащую последовательность нуклеотидов, соответствующую проинсулину (цепи А С-пептиду, цепи В и далее лидерному пептиду и промоторному участку. В дальнейшем С-пептид отделяется. Особенность второй — раздельное получение цепи Аи цепи В в двух микробных культурах, которые впоследствии объединяются. В лабораториях одной из зарубежных фирм разработана схема получения рекомбинантного инсулина, основанная на раздельном биосинтезе двух его цепей каждая цепь синтезируется вот дельной культуре Е. coli. Предварительно на основе плазмид конструировались векторы (один — для гена цепи А другой — для гена цепи В К каждой последовательности присоединялся триплет, соответствующий метионину и нуклеотидам гена индуци- бельного фермента бетагалактозидазы, включая оперон. Таким образом, между нуклеотидными последовательностями цепей А, В и бетагалактозидазой оказывался метиониновый триплет. Это обстоятельство является очень важным для завершающей стадии работы. Ферментация двух культур с вектором, несущим цепь Аи вектором, несущим цепь В проводилась на среде с лактозой (индуктором синтеза бетагалактозидазы). Если не расщепить глюкозу, то она может быть использована организмом как источник энергии. Поскольку бетагалактозидаза и цепь А (или В имели в векторе общий промотор, накопление бетагалактозидазы сопровождалось накоплением больших количеств связанной с ней цепи А (В По окончании ферментации из двух культур выделялись два белка цепь А плюс бетагалактозидаза и цепь В плюс бетагалакто зидаза. Метиониновый остаток, связывающий каждую инсулино вую цепь с бетагалактозидазой, разрушался с помощью BrCN, а инсулиновые цепи при этом освобождались и выделялись. На последнем (чисто химическом) этапе работы происходило объединение цепей Аи В в молекулу инсулина (за счет двух дисульфидных связей третья дисульфидная связь формируется между остатками цистеина вцепи А). Гормон роста (соматотропин). В клинике испытан еще один рекомбинантный белок, полученный методом микробиологического синтеза, — гормон роста человека, который секретируется передней долей гипофиза и содержит 191 аминокислотный остаток. В организме человека этот гормон необходим для роста костей. При внутриутробном развитии он ненужен, однако его недостаточность резко проявляется в позднем детском возрасте и приводит к карликовости. Ген гормона роста человека клонирован в Е. coli. Биологическая активность выделенного белка была идентична образцу, полученному из гипофиза. Интенсивно ведутся работы по повышению избирательности действия гормона роста (уменьшению его связывания с рецептором пролактина. . Эритропоэтин. Этот гликопротеин необходим для созревания дифференцировки) эритроцитоидных клеток. Белок видоспеци фичен, вырабатывается в почках. Эритропоэтин нужен при анемии, вызываемой почечной недостаточностью, а также при ане миях, которые могут наблюдаться при гемотрансфузии, облучении и химиотерапии опухолей, те. всюду, где может происходить угнетение кроветворения. В США свыше 100 тыс. человек получают по две инъекции эрит- ропоэтина в неделю (ампулы эритропоэтина в цитратном буфере по 2000—4000 ЕД содержат также сывороточный альбумин. Отметим и такой своеобразный факт вовремя олимпийских игр и других международных соревнований спортсменов, злоупотребляющих эритропоэтином, дисквалифицируют. Способ получения рекомбинантного эритропоэтина (необходимо подчеркнуть гликопротеина) имеет важную особенность — ген эритропоэтина человека встраивается не в микробные, а в животные клетки (яйцеклетки китайского хомячка, где белок может быть гликозилирован. При этом продуцентом эритропоэти на является монослойная культура этих клеток. Пептидные факторы роста тканей. Эти многочисленные био регуляторы обладают как видовой, таки тканевой специфичностью. Иногда применительно к ним используется определение гормоны, образуемые вне желез внутренней секреции. Их наработка для медицинской практики возможна лишь путем микробиологического синтеза, те. как рекомбинантных белков. В настоящее время подробно изучены эпидермальный фактор роста (ЭФР) и некоторые другие. Исследования в этом направлении продолжаются, но уже сейчас получены положительные результаты в экспериментах (например, ускорение заживления ран при использовании ЭФР), однако остается нерешенным вопрос о полной гарантии невозможности злокачественного перерождения тканей. Рекомбинантные белковые факторы врожденного иммунитета К числу используемых в качестве лекарственных средств видоспе цифических белков относятся интерфероны — факторы врожденного иммунитета, открытые в свое время как белки, вырабатываемые клетками, зараженными вирусами. Они индуцируют локальные и системные противовирусные реакции в других клетках и, соответственно, используются как противовирусные препараты. Потенциально интерфероны представляют интерес и как противоопухолевые агенты. Их принято делить натри группы ар и у из разных типов клеток). До недавнего времени интерфероны из человеческих клеток были доступны лишь в малых количествах. Как медицинский препарат использовался, главным образом, лейкоцитарный интерферон. Его источником служила кровь, получаемая из родильных домов. В настоящее время ген лейкоцитарного интерферона получен химическим синтезом. Затем он был включен в плазмиды, которые в свою очередь были введены в клетки кишечной палочки и дрожжей, ставшие таким образом продуцентами лейкоцитарного интерферона человека. Ген интерферона из фибробластов человека был клонирован в клетках кишечной палочки. Также ведется работа по созданию методами генной инженерии гибридных интерферонов с большей противораковой активностью, чему природных. Это относится к получению гибридов между интерферонами аи а Вообще возможность получения и использования в медицине иммуномодифицированных рекомбинантных белков привлекает все большее внимание. Можно отметить, в частности, цикл исследований основного или главного катионного белка нейтрофилов, который обладает одновременно бактерицидной активностью и способностью нейтрализовать эндотоксин грамотрицательных бактерий вследствие повышения проницаемости внешней мембраны последних (шифр белка BPI — bactericidal permeability increasing). Этот белок имеет молекулярную массу 55 кДа и обладает исключительно высоким сродством к липиду А (эндотоксину) внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Использование его как химиотерапевтического препарата, вводимого извне в помощь нейтрофилам своего организма, является весьма перспективным. Рационально использовать BPI человеческого происхождения во избежание аллергических реакций, нов данном случае, естественно, возникает проблема дефицита сырья. Отметим, что данный белок, являясь ингибитором воспалительных реакций, на уровне эндотоксина конкурирует с одним из белков острой фазы (образуемых печенью, который стимулирует противоспалительные реакции. В настоящее время BPI получен генно-инженерными методами, причем его молекулярная масса значительно меньше в лекарственной форме, так как в этом случае используется лишь N -терминальная часть рекомбинантного белка с молекулярной массой 21 кДа (так называемый rBPI2t). 1.5. Инженерная энзимология. Иммобилизованные биообъекты Биотехнология с момента зарождения была основана на ферментативных процессах. Однако вплоть до XX в. сведения о катализаторах белковой природы были минимальны. Лишь в наше время биотехнолог получил возможность опираться на глубокие знания структуры ферментов и механизмов ферментативных реакций С одной стороны, использование в биотехнологическом производстве ферментов в изолированном виде резко повысило его уровень в целом, а также предсказуемость результатов на каждой производственной стадии. Однако при этом пришлось решать проблему нестабильности многих ферментов. Дело в том, что изолированные ферменты не защищены системами клеточного гомеостаза, и большинство их в таком виде относительно быстро теряет активность, которая зависит даже от незначительных физико-хи мических изменений среды. С другой стороны, при цикличности производственных процессов требуется постоянно повторяющаяся наработка высоко- очищенных ферментных препаратов, что связано с большой затратой сил и средств. Проблема была решена путем создания так называемых промышленных биокатализаторов — иммобилизованных ферментов. В данном случае под иммобилизацией подразумевается связывание фермента с нерастворимым носителем при сохранении функциональной, те. каталитической активности фермента. Получение и использование иммобилизованных ферментов в промышленности, в том числе ив фармацевтической, составляет основу инженерной энзимологии. Иммобилизация ферментов не только существенно повышает их стабильность, но позволяет длительно использовать одну партию или серию промышленного биоката лизатора. За последние десятилетия параллельно с иммобилизацией ферментов развивалось и другое направление — иммобилизация целых клеток (прежде всего микробных) для осуществления многостадийного метаболического процесса, например биосинтеза антибиотика. Такие клетки после иммобилизации могут работать неделями и месяцами, не теряя при этом жизнеспособности. Понятие иммобилизация биообъекта» означает физическое разделение биокатализатора и растворителя, при котором молекулы субстрата и продуктов реакции могут свободно проникать из жидкой среды в твердую, и наоборот. Иными словами, субстрат в токе растворителя подводится к биообъекту, связанному с нерастворимым носителем, а продукт реакции в токе растворителя удаляется от биообъекта и используется как целевой продукт. В качестве нерастворимого носителя используются неорганические и органические вещества, последние, в свою очередь, могут быть как природными, таки синтетическими. Биообъект иммобилизуется на носителе адсорбцией за счет образования с ним ковалентных связей включением в формируемый этим носителем гель. В перечень материалов, применяемых для адсорбции биообъ ектов, входят оксид алюминия, карбонат кальция, бентонит уголь, целлюлоза, коллаген, ионообменные смолы, силикагель и т.д. При ковалентном связывании ферментов используют агарозу, декстрин, целлюлозу, сополимеры полиакриламида, полиурета ны и т.д. В ряде случаев ковалентное связывание с носителем требует его предварительной активации, в результате которой на поверхности носителя образуются высокореакционноспособные электрофильные группы с нуклеофильными группами на белке например, амино- и При иммобилизации включением биообъекта в гель используют разные полисахариды, например гель альгината кальция (аль- гинат — гетерополисахарид из морских водорослей, полиакриламид (полиакриламидный гель) и другие полимеры. Весьма важным параметром при иммобилизации является максимальная нагрузка носителя, те. максимальное количество фермента, которое может быть иммобилизовано на определенном количестве носителя. Каждый метод иммобилизации имеет свои преимущества и недостатки. Адсорбция — относительно мягкий метод связывания с нерастворимым носителем (без резкого снижения активности фермента. Однако фермент может связываться сносите лем недостаточно прочно и легко десорбироваться при незначительных изменениях условий протекания каталитического про цесса. Связывание биообъекта с носителем за счет ковалентных связей, естественно, более прочно. Использование в производстве иммобилизованных биообъектов разных типов зависит от конкретных целей, стоящих перед биотехнологом. Например, если необходим катализ какой-нибудь одной ферментативной реакции, то, как правило, используется фермент либо изолированный, либо находящийся в интактной клетке, либо в клетке с повышенной проницаемостью оболочки если же необходим полный биосинтез целевого продукта, то используется комплекс ферментов в интактной клетке включенных в многоэтапный биохимический процесс и, наконец, если необходим биосинтез целевого продукта сего последующей трансформацией, то используются системы, открытые для усложнения (клетка + фермент и т.п.). В качестве биообъектов для иммобилизации могут быть использованы ферменты без кофермента (например, гидролазы и изо- меразы) с прочно связанной с апоферментом простетической группой. Однако ферменты с диссоциирующими, расходуемыми в эквимолярном отношении к субстрату коферментами малопригодны для иммобилизации (требуется регенерация последних при непрерывно протекающей реакции. Трудности, связанные с применением таких ферментов в промышленности, снимаются, если используется фермент не изолированный, а содержащийся в жизнеспособной клетке (в этом случае обеспечены одновременно и доставка, и регенерация кофермента). Если же целевой продукт является внутриклеточным, то для его извлечения из клеток приходится разрушать всю систему, поэтому возникает вопрос о целесообразности использования иммобилизации биообъекта. Однако в этом случае методами генетической инженерии может быть сконструирована и введена в продуцент система транспорта целевого продукта из клетки в среду. Активность изолированного (и иммобилизованного) фермента, несмотря на все усилия по подбору оптимальных условий для его функционирования, остается ниже его активности в целой клетке. Поэтому для катализа конкретной реакции целесообразно применять фермент, сохраняющийся в клетке. Но это возможно лишь при условии, что и субстрат, и целевой продукт не будут подвергаться воздействию других ферментов клетки. Иногда этого воздействия можно избежать, регулируя температуру, величину pH и некоторые другие условия, в которых протекает нужная биотехнологу ферментативная реакция. Вместе стем эффективность работы фермента внутри клетки может быть лимитирована ее оболочкой, ограничивающей доступ субстрата к ферменту. Проницаемость оболочки клетки можно увеличить за счет кратковременной обработки ее органическими растворителями, например, 5 % раствором диметилсульфоксида. При этом важно избежать неблагоприятного воздействия на внутриклеточный фермент, катализирующий нужную реакцию. В результате клетка должна быть «пермеабилитированной» (от англ. permeability — проницаемость, те. иметь повышенную проницаемость оболочки, но сохранять при этом жизнеспособность. Включение в гель живых клеток, осуществляющих многостадийные ферментативные процессы, требует мягких условий иммобилизации и применения относительно малотоксичных носителей. Во-первых, должна быть обеспечена диффузия как молекул субстратов и частиц носителя в клетку, таки целевого продукта из клетки. Во-вторых, иммобилизованные клетки дышат, следовательно, для них должна быть сохранена возможность газообмена. В тоже время носитель должен быть достаточно прочным. Существуют разные методы включения клеток биообъекта в гель например, суспензия клеток смешивается с раствором альгината натрия, после чего в полученную смесь вносится раствор хлорида кальция (в избытке. В результате образуется гель альгината кальция с включенными в ячейки геля клетками. Процесс затвердевания заканчивается в течение примерно 20 мин. В настоящее время активно разрабатываются подходы к созданию систем, открытых для усложнения. В этом случаев одном биореакторе иммобилизуются синтезирующий определенное вещество продуцент и фермент, трансформирующий это вещество В качестве примера можно привести одновременную иммобилизацию микроорганизма Penicillium chrysogenum продуцента бензилпенициллина и выделенного из Escherichia coli фермента пени- циллинацилазы. В результате из синтезированного пенициллина образуется продукт его ферментативного гидролиза 6-ам инопе- нициллановая кислота (ключевое соединение для синтеза новых пенициллинов). Система может быть вновь усложнена включением в нее еще одного иммобилизованного фермента, катализирующего присоединение к 6-аминопенициллановой кислоте нового радикала взамен отщепленного. В итоге при использовании такой совокупности промышленных биокатализаторов можно получать практически совершенно новые полусинтетические пени циллины (рис. Для работы с промышленными биокатализаторами используют биореакторы разных конструкций. Простейший биореактор колоночного типа (риса пригоден для использования, когда иммобилизованным биообъектом является только фермент, те. в реакторе происходит одностадийное превращение субстрата. Колонка заполняется сферическими частицами нерастворимого носителя со связанным ферментом. При малом диаметре частиц увеличивается площадь поверхности, улучшается диффузия субстрата и продукта реакции. Однако при этом возрастает перепад давления по высоте колонки. Поэтому в каждом конкретном случае подбираются оптимальные размеры частиц носителя с учетом таких параметров, как площадь поверхности, перепад давления и равномерность заполнения колонки. Если биообъектом являются Рис. 4. Использование системы, открытой для усложнения в получении полусинтетических пенициллинов 34 Целевой продукт Частицы твердого носителя Раство ритель Раство ритель Клапан для выхода ] газообразных продуктов Сетка Целевой продукт Частицы твердого носителя Рис. 5. Реакторы, используемые при иммобилизации биообъектов: а — колоночного типа б — тоже, модифицированный, в — с мешалкой иммобилизованные живые клетки с активным дыханием, то особое внимание обращается на диффузию газов. Применение простейшего реактора колоночного типа здесь нецелесообразно, поэтому используется его модификация. В верхней части такого реактора расположен патрубок для выхода газа (преимущественно С 0 2), а ниже — прочно закрепленная сетка с таким размером ячеек, при котором перемешивание и вспучивание частиц носителя сводится к минимуму (рис. 5, б Третий тип — биоре актор с мешалкой (рис. 5, в Однако в этом случае необходимо помнить о возможности разрушения частиц носителя лопастями мешалки. При иммобилизации целых клеток, осуществляющих многостадийный синтез целевого продукта, на этот процесс влияют биосинтез целевого вещества, происходящий на фоне роста и размножения клеток продуцента • питательная среда, на разных стадиях биосинтеза меняющаяся по физико-химическим показателями составу отдельные ферментации или ферментационные циклы, варьирующие по количеству целевого продукта, а также примесей в культуральной жидкости, которые необходимо удалять. В заключение можно привести примеры успешного применения методов инженерной энзимологии при производстве одной из важнейших групп лекарств микробного происхождения — бе талактамных антибиотиков, а также — на производстве, выпускающем аминокислоты. Процесс получения полусинтетических цефалоспоринов включает как классические биосинтез и оргсинтез, таки две ключевые стадии, в которых участвуют иммобилизованные ферменты — гидролаза из Pseudomonas sp. и синтетазы из Xanthomonas sp. и Е. coli. На рис. 6 показано последовательное применение ряда иммобилизованных ферментов при получении из цефалоспорина С малоценного в практическом отношении природного цефало спорина) полусинтетических оральных и инъекционных цефалоспоринов с разными спектрами действия, обладающих высокой эффективностью в клинике. В нижней части рис. 6 показаны различия в субстратной специфичности синтетаз из Е. coli и Xanthomonas sp. Первую целесообразно использовать для синтеза цефалотина, цефалоридина и цефазолина, а вторую — для получения цефалоглицина и цефоперазона. Иными словами, приза мещении разными радикалами аминогруппы в 7-амино цефало- спорановой кислоте (7АЦК.) каталитическая активность сравни- Рис. 6. Получение полусинтетических цефалоспоринов с помощью иммобилизованных ферментов в аем ы х си н тет аз варьирует неодинаково в зависимости от структуры радикала Несмотря напр и н ц и пиал ь но е сходство ключевых стадий при получении разными фирмами полусинтетических пенициллин о вносите ли для промышленных биокатализаторов могут быть разными. Обычно для иммобилизации как ферментов, таки клеток используют уже готовые коммерческие препараты активированных носителей матриц. В России разработан препарат пенициллина ц ила з ы , состоящий из клеток, включенных в полиакриламид н ы й гель в США фирма) используется его аналог пенициллина ц ила за из почвенной споровой бактерии, сорбированная наб е н тоните в Швеции фирма) используется пенициллина ц ила за из Е. c o li, ковалентно связанная сак т ив и ров ан н ы мн оси теле м полисахарид ной природы В производстве аминокислот широко применяют иммобилизованные амин о а ц ила з ы в качестве реагентов длят ран с формации биологически активных веществ например -аи ила мин о кислот. Известно, что аминокислоты, получаемые химическим синтезом, представляют смесь- и D изомеров рацемата организм человека способен утилизировать только изомеры изомеры накапливаются вор га ни змеи могут оказывать вредное воздействие. Для разделения- и D изомеров вами но кислотном рацемате существуют разные химические способы, нона ибо лее простыми точным является ферментативное деление с помощью амин о а ц ила зы . Этот фермент, обладая уникальной способностью гидролизовать ацильные производные всех природных аминокислот (за исключением пролина, проявляет свойство стерео специфичности, теги др о ли зу е т связь СО только в ацильных производных изомеров. Например е N ацетильного производного аминокислоты рассмотрим реакцию С НС О — N H — D , L аминокислота+ н 20 — Аминоацилаза > L - аминокислота- аминокислота+ С НС ООН И с пользу яра з н ы ера створ им ости, разделяют аминокислоту и Маце т ила мин о кислоту при этом оказываются в растворе одна, а во садке другая составляющая смеси. С помощью микробной амин о а ц ила з ы получают, например- фенилаланина мин о кислота, которая входит в состав препарата -до фа, используемого для лечения болезни Парки нс она- изомеры аминокислот применяют при производстве пана н г и на и ква дев и та, аи з оме р ы — при получении некоторых полусинтетических химиотерапевтических средств. В частности фенил глицин используют при изготовлении полусинтетического антибиотика ампициллин а. Э коном ические преимущества использования иммобилизованных биообъектов в условиях производства несомненны. Применение иммобилизованных систем позволяют сделать условия биосинтеза более стандартными, а все производство более компактным. Полученный биообъект работает длительно. При этом на единицу продукции расходуется меньше сырья. В случае производства фармацевтических препаратов целевое вещество не будет содержать компонентов культуральной жидкости (мицелия, продуктов частичного лизиса клеток, компонентов комплексной питательной среды и т.д .), что значительно облегчает задачу выделения и очистки целевого продукта, гарантирует отсутствие в получаемом препарате отсутствие белковых и других вредных прим есей. Значительны также и экологические преимущества сокращаются количество отходов, а также число нестандартных операций, например, когда и з-за нестерильности среды большие объемы культуральной жидкости сливаются в канализацию Контрольные вопросы. Какова роль биообъекта в биотехнологическом производстве Что может быть использовано в качестве биообъектов в биотехнологии. Какие свойства биообъекта можно использовать для его совершенствования в целях создания эффективного и безопасного производства лекарственных средств. Что означает репарация биообъекта для биотехнологического производства лекарственных препаратов. Как реализуются мутагенез и селекция в получении более продуктивных биообъектов? 5. Какие виды мутаций существуют. В чем заключается принципиальное отличие методов клеточной инженерии от генной. Что является ключевым моментом в создании новых рекомбинантных структур. Какие факторы обусловливают выбор микроорганизма-продуцента при промышленном получении рекомбинантных белков. Какие виды иммобилизации биообъектов наиболее перспективны. Биореакторы каких типов используются для работы с промышленными биокатализаторами Глава |