Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
2.2 . Геном человека. Проект Геном человека» Полное секвенирование генома человека (несколько миллиардов пар нуклеотидов и идентификация генов всех сорока восьми хромосом) — задача качественно более трудная, чем секвениро вание генома прокариот и низших эукариот. Вначале х гг. был обнародован Международный проект Геном человека, целью которого было решение указанной выше кардинальной проблемы с привлечением сил и средств ряда стран, в том числе и России. В 2003 г. этот проект был успешно завершен. Ученые описали все 25 ООО генов, присутствующих в хромосомах каждой клетки. За это время были созданы базы ДНК из образцов генов десятков тысяч людей. В самой общей форме коснемся некоторых предварительных заключений. Если раньше утверждалось, что геном человека содержит порядка ста тысяч генов, то сейчас указывается на значительно меньшее их число. Также в ДНК генома человека обнаружены многочисленные некодирующие последовательности. Вначале к ним прилагалось условное определение мусор, под которым подразумевались отходы излишки, накапливающиеся по мере эволюции генома. Однако в настоящее время обнаружено, что некодирующие последовательности в геноме человека неслучайны. Любопытные факты установлены в последние годы при сопоставлении генома человека и человекообразных обезьян. Ожидалось, что эти различия по сравнению с парадигмой дарвинизма о том, что человек произошел от обезьяны, окажутся довольно значительными и что наш общий предок весьма отдален от нас, а дивергенция произошла очень давно. Однако это сходство оказалось весьма близким, увеличивая количество загадок. К их числу относится постоянное присутствие в геноме человека последовательностей вирусного происхождения (своего рода насыщенность генома современного человека молекулами вирусных ДНК Также было обнаружено отличие между геномами представителей разных наций. Это очень деликатный вопрос, учитывая еще совсем недавние трагические страницы истории человечества. Тем не менее закрывать глаза на объективные факты и з-за несовершенства человеческого общества было бы неразумно, тем более что познание собственного генома дает человечеству в новом тысячелетии предпосылки для своего совершенствования, над которыми не довлеют ни религиозные догмы, ни разрушительная революционная демагогия .2 .2 . Генотерапия Сравнивая гены, ученые смогут выявить связи разных генетических вариаций и мутаций со всевозможными заболеваниями. Прогресс в познании человека привел к возникновению такого важного практического приложения геномики к медицине, как генотерапия. С ее помощью можно лечить многие наследственные заболевания, которые дифференцируются на моно- и полигенные Моногенные заболевания на молекулярном уровне сводятся к дефекту какого-либо одного белка в клетке — фермента транспортного или структурного белка. Во-первых, белка может не хватать, а, во-вторых, его функции могут быть нарушены. Так, мутация, в результате которой изменяется активность того или иного фермента, может приводить или к накоплению токсичного субстрата, или к дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки мутация в гене, кодирующем структурный белок, — к серьезным нарушениям клеток, тканей или органов. Кроме того, мутация в гене, экспрессирующемся водной ткани, может сказаться самым серьезным образом на другой ткани и привести к появлению множества симптомов. Например, мутация в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, в результате которой блокируется превращение фенилаланина в тирозин, приводит к повышению уровня эндогенного фенилаланина в крови, неправильному формированию миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных клеток ЦНС и, как следствие, — к тяжелой умственной отсталости. Полигенность заболевания означает, что несколько белков в клетке обладают теми или иными дефектами. В каждой ткани организма экспрессируется свой набор из всей совокупности генов, но есть мутации, которые приводят к болезням, затрагивающим буквально все органы и ткани мышцы, глаза, печень, кости, сердце и т.д. Отметим, что такие болезни, как раки гипертония считаются полигенными. Некоторые ненаследственные и инфекционные болезни, в частности вирусной этиологии, также причисляются к полигенным. Вполне естественно, что проведение генотерапии при моногенных заболеваниях показывает лучшие результаты. При этом ген, с которым ведется работа, должен быть не только картирован, но и идентифицирован (должна быть известна его функция. К настоящему времени картировано около одной тысячи генов, включенных в процесс возникновения и развития моногенных наследственных заболеваний, из которых идентифицировано всего несколько сотен. При генотерапии требуются предварительное создание рекомбинантной генетической конструкции с нормальной здоровой копией дефектного гена, а также создание для этой конструкции вектора, переносящего ее в клетки организма. Для нормального функционирования гена необходимы специфические для каждого гена цис- и трансрегуляторные последовательности. Первые цис) локализованы в той же хромосоме и могут быть непосредственно сцеплены с геном или находиться на некотором расстоянии от регулируемого ими гена, выступая в качестве промотора вторые (транс) располагаются в других хромосомах Методы введения генов в клетки-мишени при генотерапии весьма разнообразны, нов большинстве случаев недостаточно эффективны. Это связано с встраиванием чужеродной ДНК в геном только небольшого процента клеток ткани, а также с разрушением ее нуклеазами и т.д. Обнадеживающие результаты получены при использовании генов, упакованных в липосомы. В настоящее время наиболее перспективным путем переноса генов при генотерапии является включение их в векторы, построенные на основе ретро- или аденовирусов. Конечно, здесь прежде всего возникает вопрос о безопасности подобных векторов. Вирусы генетически модифицируются так, чтобы при сохранении способности проникать в клетку они теряли бы способность к автономной репликации. Для направленной доставки сконструированной последовательности учитывается различный тропизм разных вирусов к определенным видам тканей. Так, представители аденовирусов высоко- тропны в отношении клеток эпителия дыхательных путей, вирус герпеса высокотропен в отношении нейронов ЦНС и т.д. В перспективе планируется проводить генотерапию с помощью целых рекомбинантных хромосом, что позволяет оперировать рядом генов и их регуляторных последовательностей одновременно. Современная генотерапия направлена только на соматические, а не на половые (зародышевые) клетки. Генотерапия ex vivo (вне организма) означает, что нормальная копия гена вводится в соматические клетки, предварительно извлеченные из организма пациента. Исправленные клетки наращиваются и вводятся пациенту трансфузией или трансплантацией. При этом рекомендуется использовать клетки именно от этого больного и их исправленное потомство возвращать ему же, что снимает проблему отторжения клеток за счет врожденного иммунитета. Тем не менее использование только аутологичных клеток сужает возможность генотерапии, поэтому разработаны разные методы защиты от иммунного ответа и неаутологичных клеток, которые включают, в частности, применение иммуносупрессо ров. При генотерапии in vivo доставка нормального гена осуществляется непосредственно в ткани человека (в клетки определенных тканей. При этом промотор гена должен быть трансспецифичен. Перечень наследственных болезней, связанных с недостаточностью того или иного фермента, возрастает по мере раскрытия их биохимического механизма. Соответственно и подходы к реализации теоретических возможностей генотерапии привлекают все большее внимание и конкретизируются. В качестве примера можно привести использование генотерапии влечении муковисцидо- за. Ген муковисцидоза — муковисцидозный трансмембранный регулятор (МТР) кодирует мембранный белок — муковисцидозный 50 трансмембранный регулятор проводимости (М ТРП). Основная функция М ТРП — создание регулируемого циклическим аде- нозинмонофосфатом (цАМФ) хлорного канала. Мутации в гене ведут к изменению количества или структуры данного белка, что нарушает транспорт ионов хлора и воды через мембраны клеток эпителия ряда органов. Выделяемая при этом экзокриновыми железами слизь обезвоживается, и вязкость ее повышается. Это приводит к воспалению и размножению инфекционных агентов (вторичная патология. При муковисцидозе наиболее сильно поражаются легкие (бронхи). Предпосылками для применения генотерапии при муковисци дозе послужили положительные результаты, полученные на клеточных культурах. Введения только одной копии нормального гена в клетку с дефектным геномом было уже достаточно для нормализации ионного транспорта. Еще более обнадеживало, что достаточно было исправить 10% общего числа клеток в монослое, чтобы добиться нормализации транспорта хлора во всем монослое (вероятно, за счет обмена ионами между соседними клетками. Оказалось, что особенно строгая регуляция функций нормального чужеродного гена, кодирующего белок М ТРП, ненужна этот белок (при его избыточном синтезе) не токсичен. После подробных доклинических исследований генотерапия муковисцидоза была апробирована в клинике. Нормальный ген в составе модифицированных аденовирусов доставлялся в клетки эпителия легких с помощью липосом. Однако результаты геноте рапии в клинике оказались не столь блестящими из нескольких сотен случаев только отдельные опыты оказались удачными. Тем не менее сам по себе переход от экспериментов в области геноте рапии муковисцидоза к клинике является большим успехом. По- видимому, на практике генотерапия муковисцидоза будет в перспективе сочетаться с антибиотике- и ферментотерапией, которые в настоящее время хотя и продлевают жизнь больного, ноне ведут к полному излечению. Генотерапия постепенно начинает привлекать все большее внимание научно-популярных изданий и СМИ. Несколько десятков технологий генотерапии разных заболеваний прошли апробацию на тысячах больных и добровольцах в США, Англии, Франции и других странах. В ряде клиник испытания прошли благополучно. Первая фаза клинических испытаний, как известно, направлена на проверку безопасности нового средства (метода) лечения. Имеются сообщения о нескольких случаях возникновения лейкемие подобных заболеваний после клинической апробации некоторых технологий генотерапии. Отмечается, что во всех таких случаях использовались векторы на основе ретровирусов. Сообщается также об отдельных случаях, когда введенный ген экспрессировался не столь длительно, как было запланировано Однако несмотря на то, что первые испытания в клинике прошли менее успешно, чем ожидалось на основе данных доклини ческих испытаний, а применение некоторых видов технологий генотерапии в их сегодняшнем виде временно остановлено, в целом эти испытания продолжаются и технологии совершенствуются. Тем более что при безнадежном состоянии больного врач с согласия или по требованию последнего может проводить испытания технологий даже при определенных сомнениях, возникших входе их доклинической апробации. Антисмысловые олигонуклеотиды Известно, что некоторые заболевания (как наследственные, таки ненаследственные) могут быть связаны нес дефицитом конкретного белка или его дефектом, а наоборот, с гиперпродукцией нормального функционально активного белка. Отсюда следует задача частичного или полного подавления продукции такого белка с разной вариабельностью. Иначе говоря, необходимо избирательно подавлять экспрессию гена, кодирующего этот белок, или гена фермента, участвующего в посттрансляционной модификации данного белка и превращении его в активную форму. В соответствии с этим была выдвинута концепция создания инновационных лекарственных средств, получивших общее название антисмысловые олигонуклеотиды. Предполагается получать комплементарную для ДНК каждого гена (его участка) последовательность нуклеотидов, которая за счет водородных связей будет реагировать с ДНК гена или с информационной РНК, матрицей для которой служит указанная ДНК. В первом случае подавление образования избыточного белка при связывании с геном будет происходить на стадии транскрипции, а во втором (при связывании с информационной РНК) — на стадии трансляции. Специфичность антисмысловой последовательности нуклеотидов (избирательность воздействия на выбранный ген) достигается при длине цепочки 15 — 20 нуклеотидов (отсюда название «олигонуклеотиды»). Для реализации идеи использования антисмысловых олигонук леотидов как лекарственных средств должен быть преодолен ряд трудностей необходимо решить проблему направленной доставки их к клеткам — мишеням в организме человека, должна быть обеспечена защита антисмысловых олигонуклеотидов от расщепляющих их нуклеаз. Предлагаются модификация таких нуклеотидов в соответствующих лекарственных препаратах, мешающая воздействию на них нуклеаз, ноне препятствующая реагированию с ДНК- или РНК-мишенью; упаковка этих нуклеотидов в липосомы и т.д. 52 2 .2 .4 . Конформационные болезни Обобщающее название конформационные болезни появилось в научной печати в самое последнее время. Оно может охватывать множество еще неописанных, принципиально новых по своей природе заболеваний. Непосредственной причиной его появления в литературе стали наблюдения над необычными инфекционными заболеваниями как у животных, таки у людей. Возбудитель передается от животных человеку. Болезнь приводит к неминуемому смертельному исходу. Гистопатологическая картина демонстрирует губкообразное состояние серого и/или белого вещества головного мозга (трансмиссивная губкообразная энцефалопатия. Ввиду отсутствия лекарственных препаратов, а также мер борьбы с болезнью, названной коровье бешенство, правительства разных стран ограничиваются запрещением вывоза мясных продуктов из определенного региона и уничтожением зараженных животных. Случаи заболевания человека относительно редки, но частота появления их сильно варьирует в разных странах и местностях. Особый интерес вызывает не только степень опасности болезни, но и принципиальная новизна относящихся к ней молеку- лярно-биологических данных. Исследования последнего времени показали, что открыт новый мир неизвестных ранее инфекций, которые назвали конформационные болезни. Причем рядом авторов подчеркивается все, что известно о конформационных болезнях к настоящему времени, может быть лишь надводной частью айсберга». Вначале это заболевание отнесли к вирусным инфекциям, однако вскоре выяснилось, что причиной болезни скрепи (scrapie) у овец, которые были завезены из Германии в Исландию для развития каракулеводства, является инфекционный агент, не содержащий нуклеиновых кислот, что полностью ломало привычные представления биологов и медиков. Сходное заболевание под названием «куру», при котором инфекционный агент также не содержит нуклеиновых кислот, было обнаружено у живущих в труднодоступных местностях Новой Гвинеи племен аборигенов, не потерявших обычаев каннибализма. К настоящему времени известны четыре разновидности болезни со столь необычным инфекционным агентом у людей (в частности, болезнь Крейцтфельдта—Якоба, куру) и несколько разновидностей у диких, сельскохозяйственных и домашних животных. Обнаружена корреляция между распространением болезни у людей и употреблением в пищу мяса сельскохозяйственных животных, молодняк которых откармливался с использованием мя сокостной муки и других субпродуктов убоя овец, в частности овечьих голов. Щадящая технология обработки субпродуктов (для повышения их питательной ценности) усиливает опасность возникновения эпидемии. Инфекционный агент был выделен и оказался низкомолекулярным белком (27 — 30 кДа). Он получил название инфекционный прионный белок. В качестве инфекционной единицы предложено название «прион». Это слово образовано из анаграммы английских слов Proteinaceous infectious (particle), те. подчеркивается, что этот белок обладает самоинфицирующей способностью. Размножение приона происходит за счет не синтеза «de novo», а изменения конформации предшественника нормального белка. Обнаруживается такой нормальный белок, в основном в нервной ткани, где экспрессия его гена враз выше, чем в других тканях. Этот белок регулирует циркадные — суточные ритмы активности и участвует в передаче нервных импульсов. Изменение прионом конформации нормального белка ведет к тому, что сам измененный белок превращается в прион. В результате содержание в клетке нормального белка падает, а содержание приона, соответственно, увеличивается, что приводит к ее гибели. Схематично данный процесс выглядит следующим образом + PrPc (г) 2PrPsc; 2PrPsc + 2PrPc (г) 4PrPsc; 4PrPsc + 4PrPc (r) 8PrPsc где PrPsc — прион (sc — scrapie), PrPc — нормальный белок клетки (с — Некоторыми авторами высказывается предположение, что гибель нейронов при губкообразной энцефалопатии происходит путем апоптоза. Попытки профилактики и лечения губкообразных энцефалопа тий самыми разнообразными соединениями делались неоднократно. Для этого использовались стероиды, арахисовое масло, амфоте- рицин В, декстран-сульфат, некоторые из антрациклинов и т.д. Однако эти попытки ник чему серьезному не привели, кроме некоторого замедления развития клинических симптомов заболевания за счет удлинения инкубационного периода, что не свидетельствует об избирательном действии на прион. Отметим PrPc и PrPsc — изоформы одного белка антитела на прионы не образуются, что существенно затрудняет лабораторную диагностику, иммунопрофилактику и иммунотерапию прионных болезней. Согласно официальному мнению экспертов ВОЗ создание высокоэффективных избирательных средств лечения прионных болезней должно исходить из использования данных о трехмерной структуре прионов. Подвергающийся изменению нормальный белок (PrPc) содержит четыре а-спиральных домена, соединенных дисульфидными мостиками. В молекуле же приона (PrPsc), являющейся инфекционной изоф ормой, только два домена остаются а-сп иральн ы ми, а два других становятся спиральными. Возможно, что это происходит в результате точечных мутаций в гене, кодирующем белок РгРс. Например, было установлено, что некоторые конститутивные белки могут изменяться по форме и превращаться в смертельно опасные прионы. В борьбе с прионны ми болезнями предлагается использовать антисмы словые олигонуклеотиды для подавления экспрессии соответствующих генов. Другой потенциально возможный путь — создание своего рода молекулярного клея, который, проникая через гематоэнцефалический барьер, связывал бы гидрофобную сердцевину РгРс, те. стабилизировал бы а-сп и рали и предотвращал переход РгРс в PrPsc. Как альтернативный вариант предполагается создание клея, который взаимодействовал бы с при- оном (PrPsc), окутывая его, и предотвращал взаимодействие с РгРс. Эти предложения пока еще достаточно абстрактны, но демонстрируют современные подходы к лечению недавно открытых и необычных заболеваний. |