Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
Контрольные вопросы. В чем отличие таргетного скрининга от традиционного при поиске и отборе новых лекарственных средств. В чем отличие метода исследования в геномике от метода исследования в протеомике? 3. Как можно сопоставить геномику и протеомику в части поиска и создания новых лекарственных средств. Как классифицируется геномика согласно поставленным в этой области задачам. Что означает термин обратная генетика. Каково в настоящее время практическое значение достижений в области геномики для фармации. Что означает понятие существенности гена. В чем отличие генотерапии ex vivo от in vivo? 9. Что такое антисмысловые олигонуклеотиды? 10. В чем необычность конформационных болезней Глава МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ РЕГУЛЯЦИИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ. Индукция и репрессия синтеза ферментов В соответствии со своей специализацией любая клетка (микробная, растительная, животная) поддерживает гомеостаз и совершает свой цикл развития, обслуживая те или иные потребности многоклеточного организма. Биотехнолог, преследуя задачу максимальной наработки целевого продукта, воздействует на эти процессы в соответствии с интересами производства. Современное биотехнологическое производство лекарственных средств наряду с совершенствованием продуцента требует и постоянной оптимизации условий самого процесса ферментации. Известно, что микробная клетка как продуцент лекарственных веществ содержит несколько тысяч ферментов и часто используется как основа создания продуцентов-рекомбинантов. Значительную часть ферментов микробной клетки составляют конститутивные ферменты, которые всегда присутствуют в ней в строго определенной концентрации, характерной для каждого отдельного фермента, например фермента гликолиза. Однако эволюция жизни на Земле и необходимость приспособления организмов (микроорганизмов) к разнообразными часто меняющимся условиям внешней среды привели к возникновению так называемых адаптивных или индуцибельных ферментов. Гены, кодирующие такого рода ферментные белки, экспрессируются лишь когда в среде появляется относительно редкий субстрат, который может быть использован как источник энергии. Индуцибельные ферменты довольно часто образуются в клетке при появлении в среде антимикробных веществ, структура которых может подвергаться ферментативной инактивации. Индукция фермента — резкое увеличение скорости его синтеза (в миллионы раз за несколько секунд) в ответ на появление индуктора. Схематически механизм индукции может быть представлен, исходя из предложенной в х гг. Ф. Жакобом и Ж. Моно концепции регуляции индукции и репрессии синтеза ферментов (рис. 7). Одновременно авторами концепции была разработана и модель оперона, в соответствии с которой в систему регуляции синтеза ферментов на генетическом уровне входит несколько компонен- 56 б Рис. 7. Схема индукции аи репрессии б фермента — репрессор Q — индуктор Q | — индуктор связывает (уводит) белок- репрессор тов. Первым следует назвать структурный ген, кодирующий структуру ферментного белка иногда это могут быть несколько последовательно расположенных структурных генов, которые кодируют участвующие в общем метаболическом процессе ферменты. В опероне структурному гену предшествует участок ДНК, именуемый оператором, который контролирует работу структурных генов. Именно с этим участком связывается белок-репрессор, структуру которого определяет ген-регулятор, который локализован вне оперона и может находиться даже в другой хромосоме, например, если это — клетка эукариота. Принципиально важно, что оператор располагается между участком, именуемым промотором и структурным геном. Молекула РНК-полимеразы садится на промоторный участок, чтобы затем двигаться по структурному гену, транскрибируя его последовательность в информационную РНК. Последняя служит в рибосомной системе матрицей для конкретного белка. Если на операторном участке находится белок-репрессор, движение РНК-полимеразы тормозится и структурный ген (или последовательно расположенные структурные гены) не считывается. Возникает явление репрессии. Для того чтобы репрессия сменилась индукцией, белок-ре прессор должен быть убран с операторного участка. Тогда РНК- полимераза получает возможность двигаться с промотора через этот участок, а затем — по структурному гену (или нескольким структурным генам Удаление репрессора осуществляется инактивацией репрессора индуктором. Вместе стем индукцию можно рассматривать и как предотвращение связывания репрессора с оператором. В целом механизмы индукции и репрессии синтеза ферментов сложны и разнообразны. Важно, что использование механизмов индукции и репрессии синтеза ферментов помогает биотехнологам в решении самых разных задач, например, позволяет поддерживать оптимальный уровень ферментных систем клетки, включенных в биосинтез целевого продукта и корректировать его в течение всего цикла ферментации. Представляет интерес конструирование продуцентов-рекомби- нантов, активность которых повышается за счет использования явления индукции. Например, в геноме микроорганизма — кишечной палочки создается оперон с общим промотором и операторным участком для двух структурных генов гена индуцибель- ной бетагалактозидазы и расположенного за ним гена цепи А или цепи В человеческого инсулина. Продуцент-рекомбинант культивируется на ферментационной среде с лактозой, утилизация которой требует быстрого синтеза бетагалактозидазы. Образующаяся быстро ив большом количестве) аминокислотная последовательность вначале соответствует бетагалактозидазе, а затем цепи А (или В) инсулина. После выделения этого гибридного белка фрагмент инсулина отделяют от фермента и используют для построения полной молекулы гормона. Ретроингибирование и преодоление этого явления Метаболические пути, ведущие к синтезу в клетке низкомолекулярных соединений — как первичных, таки вторичных метаболитов, включают, как правило, по нескольку ферментов, участвующих в сборке углеродного скелета метаболита. Перечень метаболитов и их соотношение во внутриклеточном фонде строго сбалансированы, нов случае изменения условий культивирования клетки эти параметры будут меняться на разных циклах развития клетки. Все это соответствует интересам клетки, ноне всегда совпадает с интересами и целями биотехнолога, в соответствии с которыми необходимо добиться максимального синтеза конкретного метаболита. Иногда этот метаболит является целевым продуктом, иногда — его предшественником. Чтобы добиться поставленной цели, следует преодолеть тот механизм внутриклеточной регуляции, который препятствует работе продуцента винтере сах биотехнолога. Таким выработанным эволюцией механизмом является ретроингибирование, те. подавление конечным продуктом активности первого фермента метаболического процесса Анализируя явление ретроингибирования, можно сказать, что эволюция привела к логическому решению жизненно необходимой для клетки задачи. Например, как только концентрация конечного метаболита становится достаточной для удовлетворения нужд клетки, метаболит начинает отрицательно влиять на свой собственный биосинтез. В результате подавляется активность первого фермента, что влечет прекращение образования не только метаболита, но и всех его промежуточных предшественников. Таким образом, этот механизм регуляции срабатывает очень четко если клетке в данный момент конечный метаболит ненужен, тоне нужны и его предшественники. Поскольку конечный метаболит уже прекратил свое образование, но продолжает расходоваться, естественно, что концентрация его в клетке понижается. Как только она достигает соответствующего нижнего предела, синтез метаболита быстро начинается вновь из-за того, что метаболит как ингибитор своего биосинтеза взаимодействует (за счет водородных связей) с аллостерическим центром начального фермента метаболической цепочки. Поэтому фермент сохраняет потенциальную способность вновь быстро перейти в активное состояние, что и происходит после освобождения аллостерического центра от ингибитора, вследствие понижения его концентрации. Биотехнолог может преодолеть механизм ретроингибирования и заставить клетку непрерывно нарабатывать метаболит. Во-пер- вых, можно непрерывно удалять образующийся метаболит из питательной среды и таким образом снижать его внутриклеточную концентрацию. Это достигается внесением в среду сорбента в результате концентрация растворенного метаболита (целевого продукта) снижается, и механизм ретроингибирования не включается. Во-вторых, можно использовать генно-инженерные методы — сконструировать продуцент с мутацией в аллостерическом центре начального фермента метаболической цепочки. При этом изменения в конформации аллостерического центра должны не меняться под действием ингибитора. В этом случае ретроингибирование уже не будет ограничивать синтез данного метаболита. В-третьих, необходим специальный контроль за составом сред, используемых при ферментации. В них должно быть ограничено количество метаболита (целевого продукта, что предотвратит возможность его отрицательного влияния на собственный биосинтез в клетках продуцента. Весьма иллюстративен пример неудачи при биосинтезе пенициллина (продуцент Penicillium chrysogenum) на комплексной, богатой лизином среде, используемой в качестве добавки к некоторым дешевыми недефицитным комплексным средам. Лизин является первичным метаболитом, пенициллин — вторичным. Одним из предшественников лизина является аминоадипиновая кислота, входящая в состав так называемого LLD-трипептида, из Рис. 8. Схема подавления лизином образования пенициллин а: Ф, — начальный фермент метаболической цепочки Ф, Ф, Ф — ферменты, включенные в метаболическую цепочку 1, 2, 3 — предшественники аминоади- пиновой кислоты которого в результате ряда последующих реакций формируется молекула пенициллина. Поэтому лизин, подавляя собственный биосинтез по механизму ретроингибирования, одновременно подавляет и биосинтез аминоадипиновой кислоты, а следовательно, и пенициллина (рис. 8). Таким образом, для биотехнологов, работающих в антибиотической промышленности, возникает актуальная задача по подбору сред с ограниченным количеством лизина или создания производственных штаммов Penicillium chrysogenum с нарушенным механизмом ретроингибирования по лизину. Строгий аминокислотный контроль метаболизма микроорганизмов и его значение при получении лекарственных средств С одной стороны, структура многих лекарственных препаратов включает модификации отдельных аминокислот. С другой стороны, эти препараты можно рассматривать как производные пуринов и пиримидинов, те. азотистых оснований нуклеиновых кислот Все чаще в биотехнологическом производстве используются сконструированные методами генетической инженерии микроорганизмы — рекомбинанты, продуцирующие видоспецифические для человека белки, играющие роль биорегуляторов, факторов неспецифического иммунитета и т.д. Поэтому при биосинтезе вышеперечисленных лекарственных препаратов биотехнологу приходится учитывать явление так называемого строгого аминокислотного контроля метаболизма клетки и уметь использовать его в своих целях. Строгий аминокислотный контроль метаболизма клетки позволяет ей быстро приспосабливаться к меняющимся внешним условиям или выживать, или не только выживать, но и быстро размножаться (накапливать биомассу культуры. Строгий аминокислотный контроль осуществляется с участием рибосомы, но уже не как машины для синтеза белка, а как своеобразной сенсорной органеллы и многофункционального биорегулятора гуано- зин-тетрафосфата, играющего здесь ключевую роль. В молекуле этого, образно говоря, «перефосфорилированного» гуанозина два гидроксила в рибозе ОН и ОН замещены дифосфатными остатками . Гуанозин-тетрафосфат выполняет принципиальную роль при переключении метаболизма клетки, переносимой, например, с бедной питательной среды на богатую, и наоборот. Перенос клеток с бедной среды на богатую обеспечивает быстрый рост культуры и быстрое накопление ее биомассы, а перенос клеток с богатой среды на бедную приводит к условиям, когда не может поддерживаться ни быстрое размножение культуры, ни накопление биомассы. На биохимическом уровне при замене бедной среды богатой в клетках уже за несколько минут резко усиливается синтез рибосомальной РНК, формируются рибосомы и после этого возрастает суммарный синтез белка. Растет биомасса, начинается быстрое деление клеток. С биологической точки зрения это целесообразно, так как соблюдается нормальный баланс макромолекул. При переносе клеток с богатой среды на бедную сразу же резко сокращается синтез РНК. Прекращается образование рибосома затем и синтез белка. Клетка как бы застывает в покоящемся, но при этом жизнеспособном состоянии и относительно благополучно переносит условия голодания баланс макромолекул сохраняется на таком уровне, при котором хаотических нарушений метаболизма не происходит. Это обеспечивается именно за счет механизма строгого аминокислотного контроля. На бедной среде в рибосомно-матричную систему поступают молекулы не амино- ацил тРН Ка пустые или не загруженные молекулы тРНК, поскольку среда бедная и аминокислот во внутриклеточном фонде клетки начинает не хватать. Пустые молекулы тРН К реагируют с акцепторным местом, однако синтеза полипептидной цепи не происходит, и синтез белка прерывается. У нормальных, так называемых Ле1+-клеток (имеющих ген rel А, происходит превращение рибосомы в сенсорную органеллу, те. активируется ассоциированный с рибосомой белковый (продукт гена rel А) фактор строгого контроля, который является пирофосфат-трансферазой. Как отмечалось, гуанозин-тетрафосфат может функционировать как биорегулятор. Установлено, что он связывается с РНК-по- лимеразой и при этом, что принципиально важно, по-разному изменяет ее сродство к промоторам различных генов. Экспрессия одних генов усиливается, других — подавляется. Подавляются гены, включенные в синтез рибосомной РНК, и как следствие — резко падает количество РНК в клетке на бедной среде, а затем и количество белков. Наряду с негативным гуанозин-тетрафосфат способен и к позитивному контролю, в рамках которого активируются, в частности, триптофановый, гистидиновый, треониновый опероны клетки под влиянием голодания по аминокислотам, используя гуанозин-тетрафосфат, мобилизуют свои возможности синтеза аминокислот. Биотехнолог обязательно должен учитывать это обстоятельство при получении лекарственных агентов на основе аминокислот. Помимо падения синтеза РНК под влиянием гуанозин-тетра- фосфата подавляется активность некоторых ферментов, участвующих в синтезе нуклеотидов, а также в транспорте нуклеотидов в клетку. При этом в клетке не только не образуется рибосомальная РНК, но уменьшается и содержание ее предшественников. Иначе говоря, происходит координированное многостороннее изменение клеточного метаболизма, которое имеет приспособительный характер. Поэтому роль гуанозин-тетрафосфата в Яе1+-клетках, которые биотехнолог стремится сделать сверхпродуцентами аминокислот, становится еще более «позитивной». Если целью биотехнолога является наработка нуклеотидов (пуринов и пиримидинов), производными которых являются многие лекарственные агенты, например, противоопухолевые антибиотики, то роль гуанозин-тетрафосфата должна рассматриваться в целом как негативная. В данном случае одним из подходов к решению этого вопроса может быть получение Ке1+-клеток продуцента с уменьшенным количеством фактора строгого аминокислотного контроля или полным его отсутствием. При конструировании микробных продуцентов чужеродного белка также необходимо учитывать роль гуанозин-тетрафосфата. Целевой белок должен быть стабилен и не подвергаться в клетке действию протеолитических ферментов, активность которых должна быть ограничена. Если же целевым продуктом является цик лопептид и тем более если часть его аминокислотных остатков находится в D -форме, как, например, у широко известного иммунодепрессанта циклоспорина А, опасность внутриклеточного протеолитического расщепления резко падает ив этом случае большое значение будет иметь позитивный эффект гуанозин-тетра- фосфата — активация оперонов некоторых аминокислот. Естественно, чтобы использовать механизмы внутриклеточной регуляции для производственных целей, необходимо знать их действие на генетическом, биохимическом и физиологическом уровнях. Необходимо также знание видовых особенностей продуцента и особенностей его штамма. Но даже при наличии последних прогнозировать конечный результат при вмешательстве в регуляционные процессы, учитывая их многочисленность и взаимозависимость, очень и очень сложно. Поэтому, несмотря на быстрые успехи фундаментальных наук, подбор среди условий ферментации все еще нередко носит эмпирический характер. Регуляция усвоения азотсодержащих соединений Известно, что в земной атмосфере количественно явно доминирует азот, однако эволюция жизни на нашей планете не пошла по прямому усвоению его клетками млекопитающих, растений и большинства микроорганизмов. Азот воздуха могут использовать только клубеньковые бактерии, развивающиеся в ризосфере бобовых растений, и некоторые свободно живущие азотфиксаторы, что, в свою очередь, обусловливает появление в почве аммонийных солей и оксидов азота. Многие микроорганизмы усваивают органические соединения азота, однако из широкого многообразия таких соединений наиболее легко и быстро микроорганизмами усваиваются хлорид и сульфат аммония. Центральными при синтезе азотсодержащих веществ являются реакции метаболизма с участием доноров аминогрупп глутамата, глутамина и аспартата: Глутамат + N H 3 + АТФ —» Глутамин + АДФ + Ф Глутамин + а-Кетоглутарат + НАДФН —> 2-Глутамат + НАДФН+ Глутамат + Оксалоацетат —» Аспартат + а-Кетоглутарат где Ф — фосфор неорганический. На примере глутаминсинтетазы — важнейшего начального фермента азотного метаболизма, катализирующего переход аммиака в амидную группу (первая реакция, можно показать всю сложность регуляторных взаимодействий в сильно разветвленном метаболическом пути. Амидная группа глутамина является источником азота при биосинтезе шести соединений двух ароматических аминокислот — триптофана и гистидина, а также АМФ, ЦТФ, глюкозамина-6-фосфата и карбамилфосфата. В опытах на клетках микроорганизма Е. сой показано, что любой из конечных метаболитов, находясь в насыщающей концентрации (имеются ввиду потребности микроорганизма, может действовать по принципу ретроингибирования. Однако вызываемое при этом ингибирование неполно. Вместе стем приросте числа метаболитов (в насыщающей концентрации) проявляется аддитивность, те. ингибирование фермента усиливается почти до полного исчезновения его активности, что получило название кумулятивного ретроин гибирования. Также установлено, что все метаболиты-ингибито ры глутаминсинтетазы связываются с ферментом в своем определенном месте. Таким образом, при связывании они не мешают один другому, что имеет принципиальное значение для регуляции активности глутаминсинтетазы. Однако существует и другой механизм регуляции этого сложного, состоящего из 12 субъединиц (молекулярная масса 12 кДа у каждой, фермента. С одной стороны, если культура микроорганизма оказывается в среде крайне бедной источниками углерода и энергии, нос избытком ионов аммония и глутамина, то активность глутаминсинтетазы резко снижается за счет более радикального механизма. Каждая из 12 субъединиц аденилируется, ковалентно связывая по одному остатку АМФ. Активность фермента практически полностью исчезает, что благоприятно для выживания микроорганизма. С другой стороны, при переносе микроорганизма на среду, обедненную легко усваиваемым источником азота, глутаминсинтетаза деаденилируется и мобилизует свою ак тивность. У некоторых микроорганизмов система регуляции глутамин синтетазы усложняется за счет того, что этот фермент существует в двух изоформах: в случае одной изоформы в систему регуляции включаются аденилирование — деаденилирование, в случае другой — обратимая избытком аммиака инактивация. Наряду с перечисленными механизмами регуляции активности глутаминсинтетазы существует также еще один механизм внутриклеточной регуляции, позволяющий некоторым микроорганизмам бороться с недостатком азота в питательной среде за счет усиления экспрессии гена глутаминсинтетазы. Ферменты, участвующие в усвоении азотсодержащих соединений, в большинстве случаев индуцибельны и подвержены закономерностям азотной репрессии, которая проявляется после превращения этих соединений в глутамин. При синтезе глицина и аланина а-аминогруппа глутамина реализуется с участием транс- аминаз. При этом степень обеспеченности клетки азотом определяется соотношением глутамина с а-кетоглутаратом. Также на разных клетках эукариот было показано, что дефицит источников углерода и энергии в питательной среде ведет к заметной протеолитической деградации ферментов, включенных в использование азотсодержащих соединений. Регуляция усвоения азотсодержащих соединений у эукариот, прежде всего грибов, включая дрожжи, имеет много общего с прокариотами, хотя есть и отличия. Например, для грибов предпочтительнее использовать в качестве источника азота соли аммония и глутамин. В задачи биотехнолога входит интенсификация реакций биосинтеза глутамина, глутамата и аспартата, что достигается генетическими методами или подбором питательных сред. При получении ряда первичных метаболитов, предшественниками которых и являются указанные вещества, интенсификация этих реакций благоприятно сказывается на производственных процессах. Известно, что первичные метаболиты составляют основу разнообразных классов лекарственных агентов. Вместе стем, так как вторичные метаболиты, как правило, являются модификацией первичных, интенсификация биосинтеза последних положительно сказывается и на биосинтезе вторичных метаболитов, например, многих антибиотиков, особенно тех, в структуру которых входят пептиды .5. Катаболитная репрессия в создании и производстве лекарственных средств Быстро усваиваемые источники углерода и энергии (прежде всего глюкоза) вызывают значительное и быстрое накопление биомассы у микроорганизмов. Однако биосинтез многих целевых продуктов биотехнологического производства, таких как вторичные метаболиты и ряд ферментов, при этом резко снижается. Явление, вначале называвшееся глюкозным эффектом, в дальнейшем получило название катаболитной репрессии. Применительно к этому явлению введено понятие транзиен- тной репрессии, когда привнесении глюкозы в микробную культуру, растущую на источнике углерода и энергии, который ассимилируется медленнее глюкозы, происходит временное, но резкое подавление синтеза соответствующего катаболического фермента. Позднее, поскольку в среде присутствует глюкоза, фермент снова начинает синтезироваться, нос невысокой скоро стью. Другое понятие, которым оперируют применительно к ката болитной репрессии, — исключение индуктора. Глюкоза предотвращает поступление индуктора (менее эффективно используемого субстрата) в клетку. Еще одно понятие — катаболитное ингибирование, которое относится к подавлению активности ряда ферментов продуктами быстрого катаболизма глюкозы. Установлено, что катаболитная репрессия наступает в результате быстрого снижения в клетках содержания циклического 3,5- аденозинмонофосфата (цАМФ) под влиянием внесения глюкозы в среду. И наоборот, при удалении глюкозы из среды количество цАМФ в клетках увеличивается. Поскольку образование цАМФ из АТФ катализируется ферментом аденилатциклазой, поэтому для того чтобы изменить активность этого фермента, необходимо получить мутации в гене, кодирующем данный фермент. Катаболитная репрессия — неблагоприятное явление, с которым приходится считаться биотехнологам, работающим в антибиотической промышленности, при получении методом микробиологического синтеза ферментов медицинского назначения, некоторых рекомбинантных белков. Несмотря на обилие накопленных фактов, связь катаболитной репрессии со многими метаболическими процессами, в частности, транспортом углеводов в клетку и экскрецией их из клетки, до конца не изучена. Поэтому помимо подбора сред с ограниченным содержанием глюкозы много внимания уделяется работе с продуцентами, когда, используя методы мутагенеза, селекции и генетической инженерии, получают мутанты, нечувствительные к катаболитной репрессии. Транспорт веществ через мембранные структуры клетки и его регуляция Наиболее общим компонентом клеточной оболочки, присущим клеткам микроорганизмов, растений и животных, является цитоплазматическая мембрана — двухслойная фосфолипидная субклеточная структура с включенными в нее разнообразными по функциям белками. У микроорганизмов (как и у растений) над цитоплазматической мембраной клетки располагается клеточная стенка, представляющая жесткий полимер, состоящий у высших растений из целлюлозы, у эубактерий и актиномицетов из пепти догликана, ау грибов из слоев хитина, глюкана и маннопротеина те. из разных полимеров). У грамотрицательных бактерий помимо цитоплазматической мембраны имеется и другая мембрана, называемая внешней, так как она располагается над клеточной стенкой. Внешняя мембрана имеет иную структуру, чем цитоплазматическая, которую в случае наличия внешней мембраны называют внутренней. Внешняя мембрана асимметрична, ее наружная поверхность, обращенная в среду, состоит в основном из липополисахаридов, молекулы которых координируются ионами магния поверхность, обращенная к клеточной стенке, состоит из фосфолипидов. Внешнюю мембрану пересекают белки-порины. Их тримеры формируют через нее сквозные водные каналы. Пространство между внешней и внутренней мембранами, в котором находится клеточная стенка, имеет структуру геля и называется периплазматическим. Животные клетки имеют только цитоплазматическую мембрану. Так как цитоплазматическая мембрана присуща всем клеткам, то из этого следует, что системы регуляции транспорта из среды в клетку необходимых клетке веществ и системы выброса ненужных веществ из клетки в среду обязательно связаны с цитоплазматической мембраной. Клеточная стенка не играет существенной роли нив транспорте низкомолекулярных метаболитов, нив регуляции этого процесса. Однако внешняя мембрана грамотрицательных бактерий и, особенно, периплазматическое пространство содержат ряд ферментов, участвующих в процессах транспорта низкомолекулярных соединений. Процессы транспорта через клеточную оболочку подразделяют на пассивную диффузию, облегченную диффузию и активный транспорт. При пассивной диффузии, те. в соответствии с градиентом концентрации, когда в среде концентрация выше, чем внутри клетки, в клетку проникают вода, углеводороды, молекулы кислорода, азота, водорода. В случае облегченной диффузии необходимые клетке вещества переносятся из среды в клетку с помощью пермеаз — особого класса белков, содержащихся в мембране. Переносимое вещество реагирует с пермеазой на наружной стороне мембраны и освобождается после переноса через мембрану внутри клетки. При облегченной диффузии проникающее в клетку вещество продвигается по градиенту концентрации. Затрат энергии на этот процесс не требуется, как и при пассивной диффузии. При активном транспорте вещества в клетку, требующем затраты энергии, движение переносимого вещества может происходить против градиента концентрации. При этом концентрация накапливающегося в клетке соединения может превзойти в сотни и тысячи раз его концентрацию в среде в связи стем, что когда мембранный переносчик обращен к наружной поверхности мембраны, он высокоспецифичен к переносимому им субстрату, когда же он обращен внутрь клетки, сродство резко снижается в результате диссоциации субстрата и переносчика. Если энергодающие реакции блокируются, например ферментными ядами, реагирующими с функциональными группами белковой части ферментов, то активный транспорт в клетку низкомолекулярных веществ прекращается. Источником энергии для активного транспорта очень часто является трансмембранный электрохимический потенциал ионов водорода. Переносчики, имеющие места связывания протонов и молекул субстрата, используют мембранный потенциал для переноса внутрь клетки ионов водорода и питательных веществ. Переносчик, связавшись с протоном, повышает свое сродство к субстрату. Освободившись от протона на поверхности мембраны, обращенной внутрь клетки, переносчик снижает сродство к субстрату. Таким образом, фактически здесь происходит перенос двух субстратов водном направлении. Подобного рода транспорт получил название «симпорт». Если переносчик осуществляет перенос только одного субстрата, используется термин «унипорт». Наконец, механизм транспорта одними тем же переносчиком двух субстратов, нов противоположных направлениях, именуется «антипорт». АТФ-зависимые системы активного транспорта используют энергию АТФ. В такие системы входят расположенные в периплаз- матическом пространстве белки с высоким сродством кряду метаболитов, принадлежащим к пептидам, аминокислотам, сахарами др. Они препятствуют выходу в среду ряда метаболитов из цитоплазмы. Сих помощью в пери плазматическом пространстве накапливаются определенные питательные соединения из среды. Говоря об активном транспорте веществ в клетку, нельзя не упомянуть о системах транслокации (переноса) групп. Их функционирование приводит к транспорту в клетку, например, углеводов в виде фосфатных эфиров, а внутриклеточная концентрация оказывается гораздо выше, чем в среде. Фосфотрансферазы, участвующие в работе таких систем, инициируют и ряд других реакций в клетке. Вообще транспорт многих субстратов в клетку подвержен регуляции на уровне как биосинтеза компонентов этих систем, таки функциональной активности уже синтезированных компонентов. Самостоятельный интерес представляет выведение из клетки избыточных продуктов метаболизма, в частности защитных ферментов, антибиотиков и экзоферментов, позволяющих утилизировать находящиеся в среде полимеры. Низкомолекулярные вещества могут выводиться путем пассивной или облегченной диффузии. Однако существуют и энергозависимые системы. Особый интересу биотехнологов, в том числе работающих в области получения рекомбинантных белков, вызывает проблема выведения из клетки белка, синтезируемого в цитоплазме, включая чужеродный белок, являющийся целевым продуктом. В данном случае биотехнолог идет по пути повторения выработанного эволюцией механизма секреции таких белков, как внеклеточные ферменты. Когда синтезируется такого рода белок, которому предстоит пересечь цитоплазматическую мембрану и выйти из клетки в среду, то, во-первых, его синтез происходит на рибосомах, связанных с обращенной в цитоплазму поверхностью цитоплазматической мембраны, во-вторых, покидающая рибосому полипептид- ная цепь на своем N -терминальном конце содержит сигнальный или лидерный пептид (15 — 30 аминокислотных остатков. Этот дополнительный участок в полипептидной цепи временно нужен для выведения внеклеточного белка из клетки и имеет свои особенности конечный аминокислотный остаток, положительно заряженный (облегчается взаимодействие с поверхностью мембраны, имеющей отрицательный заряд протяженный участок гидрофобных аминокислотных остатков, облегчающий прохождение через липидные слои мембраны наличие специфичного участка для действия так называемой сигнальной протеазы (или пептидазы) — мембранного фермента, катализирующего отщепление лидерного пептида от основной полипептидной цепи после выполнения функции своеобразного проводника новой белковой молекулы из клетки в среду. Таким образом, рекомбинантный белок, например, видоспе цифичный белковый гормон человека, синтезируемый в цитоплазме микробной клетки и не имеющий специфической лидер- ной последовательности, можно с помощью методов генетической инженерии снабдить лидерной последовательностью сусло вием, чтобы она могла быть субстратом для микробной сигнальной пептидазы. Отсюда следует проблема создания гибридных (хи мерных) белков с лидерной последовательностью, принадлежащей, например, к внешнеклеточной пенициллиназе. Разумеется, проблема выведения чужеродных белков не решается однозначно и только за счет присоединения лидерной последовательности, так как существует много других факторов, влияющих на экскрецию белков. В заключение этого краткого рассмотрения проблем транспорта веществ в клетку и из клетки обратим особое внимание на мутации, которые могут затрагивать ферментные системы транспорта, молекулы переносчиков, структурные компоненты цитоплазматической и внешней мембран, что дает биотехнологу богатый набор мутантов с самыми разнообразными изменениями физиологических и биохимических свойств. Особенности транспортных систему некоторых биообъектов определяют их способность воздействовать на окружающую среду в нужном для человека аспекте. Например, ряд представителей микроорганизмов рода Pseudo- monas и целенаправленно полученных от природных культур мутантов обезвреживают самые разнообразные химические соединения (кольчатые углеводороды и др, попадание которых в окружающую среду приводит к нарушению экологии в обширных географических регионах. Причем способность вышеуказанных микроорганизмов обезвреживать загрязнения обусловлена не только набором ферментов, утилизирующих экзотические вещества, но и особенностями транспортных систем, начиная с режима осцилляции пориновых каналов внешней мембраны. Молекулярные механизмы защиты продуцентов от веществ с «суицидным эффектом» Биотехнологам, создающим суперпродуценты биологически активных веществ, как правило, приходится сталкиваться с проблемой защиты продуцента от вырабатываемого в большом количестве целевого продукта. Особенно наглядно это демонстрируется при создании суперпродуцентов вторичных микробных метаболитов. С одной стороны, образуемые в почвенных биоценозах микробные метаболиты нередко выполняют функцию оружия в борьбе за существование. С другой стороны, за счет мутаций, клеточной и генной инженерии, а также подбора специальных питательных сред такие вещества начинают вырабатываться клеткой в неестественно больших для нее количествах. С позиций биотехнологии проблему защиты продуцентов от образуемых ими веществ нельзя рассматривать только применительно к антибиотикам. Однако последние являются наиболее показательным примером защиты клетки от потенциально «суицид ных» собственных веществ, способных вызывать ее гибель. Механизмы защиты продуцента от собственной сверхпродуктивности могут быть разными. В случае антибиотиков таких механизмов несколько. Роль каждого механизма защиты зависит в свою очередь от механизма биологической активности конкретного антибиотика. Известно, что наиболее распространенную группу антибиотиков, применяемых в клинике, если не считать беталактамов, составляют ингибиторы синтеза белка у бактерий на рибосомном уровне тетра циклины, аминогликозиды, макролиды и некоторые другие. Их продуцентами являются актиномицеты, те. многоклеточные бактерии, способность которых выдерживать высокие концентрации собственных антибиотиков объясняется несколькими причинами. Из них главной является особенность биосинтеза их молекул (точнее сборка углеродного скелета, который происходит особенно интенсивно и достигает максимума, когда культура продуцента замедляет скорость размножения своих клеток и переходит из тро- фо- в идиофазу. Иными словами, несмотря на потенциальную способность тормозить синтез белка, накопившийся антибиотик неспособен причинить вред своим клеткам, в которых синтез белка уже почти прекратился. Другие причины, наблюдаемые на примере некоторых групп антибиотиков — ингибиторов белкового синтеза, носят более частный характер. Исследования с антибиотиками — аминоглико- зидами на примере наиболее подробно изученного неомицина (продуцент Actinomyces fridae) показали, что в процессе или после сборки молекулы антибиотика он подвергается временной обратимой инактивации. Рибосомы продуцента неомицина, как показывают опыты с бесклеточной синтезирующей белок системой, чувствительны к антибиотику. Соответственно возникает вопрос о совмещении водной и той же клетке эндогенного ингибитора (каковым в данном случае является неомицин) с работающими рибосомами. Частично ответить на этот вопрос можно, исходя из вышеуказанной общефизиологической закономерности, характеризующей биосинтез антибиотиков максимум биосинтеза антибиотика не совпадает повремени с максимальной скоростью синтеза белка (цикл развития культуры уже завершен). Существует и специфический механизм защиты клетки продуцента от неомицина, который может быть обратимо инактивиро ван за счет фосфорилирования одной из многочисленных вами- ногликозидной структуре амино- или гидроксильных групп. Источником переносимого на антибиотик фосфатного остатка является АТФ. Обратимость инактивации обусловлена существованием в клетке продуцента локализованной в клеточной мембране щелочной фосфатазы. Этот фермент на последнем этапе выброса антибиотика в среду осуществляет его реактивацию, те. дефосфо- рилирование, после которого антибиотик уже в активном состоянии направляется в среду в силу односторонней проницаемости мембраны. Причем иногда реактивирующий фермент не справляется со своими функциями, ив среду антибиотик выделяется в неактивном виде. Если его сконцентрировать и обработать щелочной фос- фатазой, можно получить дополнительное количество антибиотика из, казалось бы, неактивной культуральной жидкости. Небезынтересно, что ген фосфорилирующего фермента находится в кластере генов биосинтеза неомицина, наглядно демонстрируя генетическую близость защитной аминогликозид-фосфо- трансферазы у продуцента с ферментами биосинтеза аминогли- козида, те. подчинение функций генов кластера единой цели — образованию антибиотика, эффективного против микроорганиз- мов-конкурентов, но безвредного для своего продуцента. Однако помимо выполнения защитной функции фосфотрансфераза может воздействовать и на фрагменты собираемой ами- ногликозидной молекулы, активируя их, те. выполнять двойную функцию (при биосинтезе — как фактор защиты от суицидного агента. Кроме фосфорилирования-дефосфорилирования существуют и другие механизмы инактивации-реактивации аминоглико зидов, например ацетилирование-деацетилирование. 71 Защита от собственных антибиотиков у актиномицетов — продуцентов макролидных структур (прежде всего эритромицина) обусловлена наличием в клетке специфической метилазы, мети лирующей определенный адениновый остаток в 23 S рибосомаль- ной РНК. В результате 50 S субъединица рибосомы продуцента эритромицина имеет конфигурацию, при которой реагирование антибиотика с пептидилтрансферазным центром рибосомы, как это происходит в случае эубактерий, невозможно. Иными словами, белковый синтезу продуцента специфически защищен от собственного антибиотика и помимо неспецифической защиты на физиологическом уровне. Механизмы защиты клетки у продуцентов тетрациклинов изучены мало. Проводить аналогию с изученными механизмами тетра- циклинорезистентности у патогенных бактерий довольно трудно. Для характеристики системы защиты продуцента от некоторых циклопептидных мембранотропных антибиотиков (например, грамицидина С) используется термин «компартментация». Место биосинтеза этого антибиотика изолировано от чувствительных к нему метаболических реакций продуцирующей его клетки. Молекула антибиотика (ее углеродный скелет) собирается в мульти- ферментных комплексах, обеспечивающих упорядоченную последовательность реакций сборки. Взаиморасположение ферментов в комплексе координируется за счет дисульфидных и водородных связей. Мультиферментные комплексы локализуются на периферии клетки продуцента. Также компартментация играет роль в защите клеток продуцентов (как правило, это актиномицеты) в случае образования ими ДНК-тропных антибиотиков (последние применяются в онкологической клинике. В тоже время антибиотики семейства рифамицинов, ингибируя синтез РНК в клетках путем взаимодействия с РНК полимеразой, не действуют на синтез РНК в клетке своего собственного продуцента. Интересно, что проблема защиты продуцента от потенциального суицидного агента отсутствует в случае продуцента пенициллина Penicillium chrysogenum даже при повышении продуктивности штамма гриба во много тысяч раз. Пенициллин проявляет антимикробный эффект, подавляя синтез пептидогликана клеточной стенки бактерий. У грибов пептидогликана как полимера клеточной стенки нет. Соответственно у них нет и фермента синтеза пептидогликана — D-аланин-транспептидазы, который является мишенью действия пенициллина при его контакте с бактериальной клеткой. |