Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
§ кольцо Цефемовое ядро Г h o o c - c h - ( c h 2)3- c o t N H - c h - x : h 1 ^ с н h 2 ч/ Беталактамное i Дигидротиазиновое кольцо СООН кольцо У пенициллинов с беталактамной структурой сконденсировано пятичленное кольцо, содержащее серу, ау цефалоспоринов — шестичленное. К грибам относится продуцент еще одного антибиотика, применяемого в медицинской практике. Представитель рода Fusidium, а именно Fusidium coccineum, образует антибиотик стероидной структуры — фузидиевую кислоту: Н3СЧ С НС Н Н2С I Н2С. СО ОН bсbНеобходимо отметить еще один ценный лекарственный препарат, образуемый грибами. На рубеже 1970— х гг. из гриба рода Tolypocladium был выделен циклопептид, проявлявший слабую антимикробную активность, поэтому забракованный как антибиотик. Однако он оказался высокоэффективным в качестве иммуносупрессора. Циклопептид, получивший название циклос порин (точнее циклоспорин G), широко используется при пересадке органов и тканей, а также при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний. Название «актиномицеты» отражает распространенное ранее неправильное представление об этих микроорганизмах как о лучистых грибах. Установлено, что актиномицеты стоят гораздо ближе к бактериям, чем к грибам. Они являются прокариотами. Их геном не заключен в ядро, а представляет кольцевую хромосому, не отделенную от цитоплазмы ядерной мембраной. Клетки актиномицетов не содержат также и митохондрий. Их клеточная стенка построена из гетерополимера — пептидоглика на. Все это сближает актиномицеты с бактериями. Однако актино мицеты в отличие от истинных бактерий (эубактерий) являются многоклеточными организмами со сложным циклом развития обычно за 5 —6 сут. Актиномицеты образуют спороносцы и спо ры. Актиномицеты являются продуцентами огромного количества около 4000) разнообразных антибиотиков. Актиномицетами образуется большинство антибиотиков, применяемых в медицинской практике. Ряд видов, относящихся к родами, образуют (например Streptomyces griseus и Micromonospora рифигеа) антибиотики ами- ногликозидной структуры к которым принадлежат стрептомицин, гентамицин, неомицин, канамицин и ряд других антибиотических веществ с широким спектром антибактериального действия, получивших широкое распространение в клинике. Как видно из структурных формул двух представителей ами- ногликозидов — стрептомицина: Стрептамин и гентамицина (под последним названием промышленностью выпускается не индивидуальное вещество, а комплекс трех близких веществ — гентамицина С ь гентамицина С а, гентамицина Св молекуле аминогликозидов обязательно присутствуют остаток щестичленного аминоциклитола; • остатки сахаров и/или аминосахаров. Кроме природных аминогликозидов в медицинской практике в настоящее время используются и полусинтетические аминогли козидные антибиотики, те. продукты химической модификации природных аминогликозидов. Виды, относящиеся к роду Streptomyces (Streptomyces aureo- faciens, Streptomyces rimosus и др, образуют широко известные антибиотики тетрациклиновой структуры — тетрациклин: ОН О оно bхлортетрациклин (при С, окситетрациклин (при С5—ОН). Все они близки по спектру антибактериального действия, все всасываются при приеме внутрь, однако некоторыми преимуществами (лучшей переносимостью) обладает тетрациклин. Как видно из их формул, они содержат структуру из четырех циклов и разнятся только по верхней, ноне по нижней периферии молекулы Верхняя периферия тетрациклиновой молекулы была модифицирована химическим путем, что позволило получить полусинтетические тетрациклины — доксициклин, миноциклин и метацик- лин (первый из них длительно циркулирует в крови, второй обладает повышенной антибактериальной активностью): Н N(CH3)2 c o - n h ОН О Метациклин Доксициклин Миноциклин R, Н Н — N(CH3)2 R2 — СН2— н Н — СН2— СН3 н R 4 ОН он н Широко известны образуемые актиномицетами антибиотики макролидной структуры, содержащие макроциклическое лактон ное кольцо и сахара и/или аминосахара. В частности, к ним относится эритромицин А (продуцент Streptomyces erythraeus): з D-дезозамин (СН3)2 ОСН3 L-кладинозил Н Эритронолид 110 и близкий к нему олеандомицин, образуемый Streptomyces anti- Эти антибиотики хорошо всасываются при приеме внутрь. Они высокоэффективны только против грамположительных бактерий так как являются антибиотиками узкого спектра действия. Из актиномицета, первоначально названного Streptomyces mediterranei, а позднее отнесенного к виду Nocardia mediterranea, выделены антибиотики сложной анзамициновой структуры. У них имеется нафталиновое ядро и длинная алифатическая цепь соединенная с ароматической частью эфирной и амидной связями. Наибольшую известность из них получил рифампицин, или рифампин, который является, однако, полусинтетическим анти биотиком: С НО Рифампицин успешно применяется влечении туберкулеза. Ак тиномицеты, помимо антибактериальных антибиотиков, образуют также и антибиотики, подавляющие рост грибов и дрожжей в том числе патогенных. Представители рода Streptomyces, например, Streptomyces nourasei, являются продуцентами противогрибковых антибиотиков, относящихся к полиеновым макролидам Макроциклическое лактонное кольцо содержит у этих антибиотиков ряд сопряженных двойных связей. Наиболее известны ам- фотерицин В (гептаен): и нистатин (тетраен-диен): В молекулу полиеновых антибиотиков входят и аминосахара. Полиеновые антибиотики широко известны в медицинской практике. Вследствие их высокой токсичности полиены применяются в основном наружно или перорально. Нередко при пероральном применении их используют вместе с антибактериальными антибиотиками для того, чтобы предотвратить быстрое размножение дрожжей после подавления роста бактерий. Актиномицеты образуют ряд противоопухолевых антибиотиков. Из них свыше десяти нашли применение при лечении некоторых форм рака. Так, Streptomyces verticillius образует антибиотик блеомицин сложного гликопептидного строения. Наиболее важной в настоящее время считается группа антрациклинов, 112 к которой принадлежат дауномицин (Ri = R2= СН3), адриамицин (Ri= СН3; R2 = СН2ОН), карминомицин^, = Н R2= СН3): О ОН и их полусинтетические производные. Продуцентами антрацик- линов являются разные виды рода Как видно из приведенной формулы, антрациклины содержат структуру частично сходную с таковой у тетрациклинов, а также остаток аминосахара. Однако ни по спектру антибиотического действия, ни по областям применения в клинике антрациклины и тетрациклины не сходны. Аэробные спорообразующие грамположительные бактерии (бациллы) относятся к собственно бактериям. Как и все бактерии они не имеют ядра. Их кольцевая хромосома имеет меньшие размеры, чему актиномицетов. Их геном соответственно более прост те. содержит меньшее, чему актиномицетов количество генов и тем более, у грибов. Бактерии не имеют митохондрий. Их клеточная стенка близка по составу к клеточной стенке актиномице тов и состоит из пептидогликана. Жизненный цикл бактерий значительно короче жизненного цикла грибов и актиномицетов — около полутора суток. Открыто более тысячи антибиотиков бактериального происхождения. Большинство из них представлены пептидами и цикло пептидами. Еще вовремя Второй мировой войны был внедрен в лечебную практику (для обработки ран) циклический декапептид — грамицидин С: L-Вал —► L-Орн —►L-Jleft—► Фен Ь-Проbt Про — D-Фен-*—L-Лей — L-Орн -*— Вал Продуцентом антибиотика является Bacillus brevis. 113 Как видно из приведенной формулы, кроме аминокислот валина, орнитина, лейцина, пролина, антибиотик содержит также и D -фенилаланин. Позднее из другого вида почвенных споровых бактерий (Bacillus polymyxa) был выделен также нашедший применение в медицинской практике антибиотик полимиксин В — представитель ряда полимиксинов, в который входят свыше 20 соединений, разнящихся по отдельным аминокислотным остаткам, а также по входящему в их молекулу остатку жирной кислоты. В структуре поли- миксина В присутствуют три фрагмента циклопептид, линейный трипептид, остаток 6-метилоктановой кислоты (непептидная часть молекулы): Фен / ДМ К Лей ДМ К * Тре ДМ К \ ДМ К Здесь ДМ К — остаток а,у-диаминомасляной кислоты МОК — остаток 6-метилоктановой кислоты. В отличие от грамицидина полимиксин В используется не только для местного, но и для внутримышечного введения. В целом антибиотики, образуемые почвенными споровыми бактериями не столь разнообразны, как антибиотики актиномицетов, ив медицинской практике они играют меньшую роль. Механизмы биосинтеза антибиотиков Три основных обстоятельства определяют особенности биосинтеза, общие для всех антибиотиков антибиотики не относятся к прямым продуктам трансляции или вообще матричного синтеза антибиотики как вторичные вещества образуются из первичных метаболитов биосинтез молекулы любого антибиотика происходит суча bbстием ряда ферментов. Д М К — Тре f МОК ДМ К Координация действия ферментов, те. обеспечение правильной последовательности ферментативных реакций, обеспечивается разными путями. Один путь, доказанный на примере биосинтеза цик лопептидных и некоторых других антибиотиков, связан стем, что синтез или сборка антибиотической молекулы происходит в муль- тиферментных комплексах с упорядоченно расположенными ферментами. Первичные метаболиты входят в мультиферментный комплекс, в котором происходит ряд их превращений. Из комплекса выходит или завершенная молекула антибиотика, или ее крупный фрагмент, например, специфический агликон того или иного антибиотика и т. п. При сборке углеродного скелета молекулы антибиотика могут происходить различные реакции метилирование или деметилирование; карбоксилирование или декарбоксилирование аминирование или дезаминирование. Предшественниками беталактамных антибиотиков являются аминокислоты. Началом формирования беталактамной молекулы является синтез так называемого LLD-трипептида из трех аминокислот первичных метаболитов — L-аминоадипиновой кислоты, цистеина и валина СН------СН2 СН, I I / С = 0 С H -C H -C H ! п I \ __ 1 0 СООН СНз SH / NH—СН— СН с н н С с —N— СН—СН I II I \ __ R о СООН СНз LLD-трипептид Моноциклический беталактам В образовании последнего принимает участие фермент, замыкающий пептидные связи, а также фермент, превращающий валин в его оптический антипод — валин. Это уже специфические ферменты биосинтеза антибиотика, не принадлежащие к ферментам, катализирующим превращения первичных метаболитов в обычных метаболических циклах. Затем LLD-трипептид превращается в моноциклический бета лактам, те. происходит замыкание беталактамного кольца Следующий этап — появление пятичленного серусодержащего кольца, сконденсированного с беталактамным. Все это означает участие в биосинтезе антибиотика новых ферментов. В случае образования бензилпенициллина необходимо присутствие фенилук- сусной кислоты (в активированной форме, в результате чего освобождаются аминоадипиновая кислота и кофермент А. Во втором случае происходит экспансия — расширение пятичленного кольца до шестичленного, что катализируется специфическим ферментом, получившим название «экспандаза». Далее в результате еще ряда реакций формируется молекула цефалоспо- рина С. Вышеперечисленные реакции биосинтеза демонстрируются как пример, чтобы еще раз подчеркнуть основополагающий тезис молекула любого антибиотика синтезируется с обязательным участием ряда (5 — 10 и более) ферментов. На основании анализа структурных формул аминогликозидов — стрептомицина и гентамицинов и других можно предположить что их предшественником является глюкоза. Действительно, как показали многочисленные исследования, из глюкозы синтезируются не только остатки сахаров в молекулах аминогликозидов, но и их аминоциклитольный фрагмент. Два других фрагмента молекулы стрептомицина — пентоза (стрептоза) и L-глюкозамин также образуются из глюкозы за счет ряда ферментативных реакций Наконец, сборка молекулы стрептомицина из трех компонентов — стрептидина, стрептозы и L-глюкозамина (замыкание между ними гликозидных связей) требует специфических ферментов. В биосинтезе стрептомицина и большинства других аминогликозидных антибиотиков участвуют не менее 20 ферментов. Описывая ферментативные реакции биосинтеза тетрациклиновой структуры, обычно проводят аналогию с биосинтезом первичных метаболитов — жирных кислот, из остатков ацетатных или пропионатных единиц по принципу голова к хвосту, когда формируется связь между углеродом карбоксильной группы и углеродом метальной группы (или метиленовой группы) следующей единицы. В этих ферментативных реакциях участвует кофермент А. Существуют и принципиальные отличия между синтезом жирных кислот и антибиотиков — вторичных метаболитов. При биосинтезе антибиотиков не происходит восстановления карбонильных групп после реакции конденсации или такое восстановление происходит до образования гидроксильной группы или двойных связей. При полном восстановлении образуются ароматические структуры при неполном — макроциклические лактоны. Таким образом, имеется определенная связь между биогенезом таких соединений, как тетрациклины и антибиотики-макролиды. Скелет молекулы тетрациклинов строится из одной малонамидной единицы и восьми малонатных. Основа структуры лактонного макроциклического кольца эритромицина образуется как результат ферментативной полимеризации одной единицы пропионата и шести единиц метилмалоната. Сахара эритромицина происходят из глюкозы за счет ряда ферментативных превращений. В биосинтезе участвуют ферменты сборки молекулы из макроциклического лактона и сахаров. Методы генной инженерии с успехом используются при создании продуцентов рекомбинантных белков, так как белки — 116 прямые продукты трансляции. В целом остается справедливым правило один ген — один белок, те. один структурный ген определяет структуру (последовательность аминокислот) одного белка. Антибиотики не являются прямыми продуктами трансляции в отличие от ферментов биосинтеза антибиотиков. Количество таких ферментов достигает нескольких десятков. Таким образом в биосинтезе молекулы антибиотика принимают участие десятки структурных генов. Биотехнология антибиотиков Фактически ни один продуцент, выделенный из почвы или другого природного источника, непосредственно в производстве использован быть не может. Природный штамм образует лишь незначительные количества антибиотиков. Обработкой мутагенами и многоступенчатым отбором (селекцией) активных вариантов обычно удается повысить активность штамма, так как количество образуемого им антибиотика увеличивается в тысячи и даже десятки тысяч раз. Например, у продуцента пенициллина в результате десятков лет селекционной работы во многих лабораториях разных стран мира активность повысилась от десятков микрограм мов до десятых долей грамма антибиотика в миллилитре среды. У промышленных мутантных штаммов (рабочий термин «су перпродуценты») антибиотик, образуемый в огромном количестве, не должен влиять на собственный биосинтез жизнедеятельность своего продуцента. Как известно, избыточное образование метаболита ведет к прекращению его биосинтеза по принципу обратной связи. В случае суперпродуцентов механизм обратной связи исключен. Жизнедеятельность суперпродуцентов сохраняется в результате разных причин максимум концентрации антибиотика достигается, когда рост культуры либо завершается, либо практически уже завершен антибиотик синтезируется в местах клетки, отделенных от мест локализации жизненно важных метаболических процессов после выхода антибиотика из мицелия в среду вновь в мицелий он не проникает, те. транспорт антибиотика через оболочку продуцента имеет одностороннее направление. Однако свойство образовывать избыточные количества антибиотиков нестойко. Оно легко теряется полностью или частично поэтому промышленные продуценты хранят в особых условиях периодически проверяя их активность. При необходимости их рассевают на отдельные колонии, из которых затем отбираются наиболее активные При разработке биотехнологии антибиотиков учитываются общие свойства продуцентов, а также, что каждый антибиотик является конечным продуктом длинной цепи специфических ферментативных реакций. Продуценты большинства антибиотиков, в том числе важнейших для медицинской практики, являются аэробами или (реже факультативными анаэробами. В связи с этим впервые годы после получения пенициллина, грамицидина Си некоторых других веществ их продуценты выращивали на поверхности жидкой питательной среды в стационарных условиях в микробиологических матрацах или колбах, помещаемых в термостат или термостатные комнаты. Культура продуцента росла только на поверхности среды. Этот способ был трудоемок, не экономичен и не позволял нарабатывать антибиотик в больших количествах. Очень скоро поверхностная ферментация была заменена на глубинную. Через питательную среду пропускали воздух и среду непрерывно перемешивали. Это позволило использовать для роста продуцента весь объем среды. Только глубинная ферментация создала возможность современного биотехнологического производства с выпуском конечного продукта в большом количестве. |