Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
риды, липопротеиды, фосфолипиды и специфические белки — порины (от слова пора тримеры этих белков формируют поры или водные каналы, через которые из внешней среды в клетку диффундируют низкомолекулярные питательные вещества (аминокислоты, небольшие пептиды, м оно, ди -, трисахара, неорганические ионы и т.п.). Пориновые каналы «осциллируют», те. находятся тов открытом, тов закрытом состоянии. В бедной среде канал в открытом состоянии находится дольше, чем в богатой среде. Этими же по риновыми каналами пользуются и антибиотики при проникновении в клетку. Антибиотики, быстро проникающие через водные каналы по ринов, относятся к препаратам широкого спектра действия — подавляют рост и грамотрицательных, и грамположительных бактерий. Антибиотики, молекула которых имеет большие размеры например, эритромицин, через пориновые каналы не проникают и поэтому неэффективны против грамотрицательных бактерий, хотя высокоактивны против грамположительных. Отметим что на проникновение молекулы влияют не только ее размеры но истерические особенности, включая те, которые обусловливают ее гибкость. Учитывается не только диаметр водных каналов, но и свойства формирующих их белков-поринов. Существуют катионоселективные и анионоселективные каналы. Применительно к антибиотикам это означает, что в случае бактерии у которой во внешней мембране преобладают катионоселектив ные каналы, в клетку лучше будут проникать антибиотики основной природы. Примером является бензилпенициллин. Его относительно небольшая молекула очень слабо проникает через пориновые каналы кишечной палочки, так как у этого организма, как и у многих других грамотрицательных бактерий, пориновые каналы катио носелективны. В тоже время у относительно небольшой группы грамотрицательных кокков пориновые каналы анионоселективны, что способствует проникновению в их клетку бензилпенициллина. Отсюда следуют общеизвестные врачам факты бензилпенициллин непригоден для лечения кишечных инфекций, но высокоактивен при лечении гонореи. Катионо- и анионоселективность пориновых каналов определяется средой обитания вида бактерии. Так, катионо- селективность пориновых каналов у кишечной палочки позволяет этой, обитающей в кишечнике, бактерии избежать неблагоприятного действия поступающих в кишечник желчных кислот. Не только размеры молекулы антибиотика, стерические особенности и заряд определяют возможность и скорость ее проникновения через пориновые каналы. Так как каналы заполнены водой, большое значение имеет степень гидрофобности молекулы — при высокой гидрофобности проникновение антибиотика заметно снижается. Кроме пориновых каналов — главного пути проникновения антибиотиков через барьер внешней мембраны в клетку — существуют и другие возможности транспорта за счет специфической системы первичного метаболита, если молекула антибиотика сходна по структуре или является аналогом метаболита за счет липидных участков внешней мембраны бактерий, если это липофильные вещества (в том числе и антибиотики). Некоторые антибиотики нуклеозидной природы используют специфические системы транспорта нуклеозидов через внешнюю мембрану. Например, был получен полусинтетический цефало- спорин с катехолоподобной группировкой, который в соответствии с размерами своей молекулы не должен был проникать через пориновые каналы. Однако благодаря наличию вышеуказанной группировки, он образовывал комплексы с ионами железа и проникал в грамотрицательную клетку, используя специфическую систему транспорта железа. Иными словами, данный цефалоспо- рин, имитируя переносчик железа, преодолевал барьер мембраны тем же путем, что и переносчик. Вместе стем антибактериальная активность определенных полусинтетических липофиль- ных пенициллинов и тетрациклинов обусловлена их проникновением через липидные участки внешней мембраны. Изучение механизмов антибиотикорезистентности штаммов грамотрицательных бактерий, выделенных из клинического материала, показало, что нередко резистентность обусловлена уменьшением количества пориновых белков в мембране, и, соответственно, количества пориновых каналов. В результате проникновение антибиотиков в клетку замедляется. Еще один механизм резистентности связан с изменением уже самих пориновых белков и сужением диаметра пориновых кана лов. В обоих случаях резистентность является неспецифической и ослабляется, хотя ив разной степени, при проникновении в клетку антибиотиков, диффундирующих через пориновые каналы. Но полного прекращения проникновения антибиотиков в клетку при указанных механизмах резистентности произойти не может, поскольку пориновые каналы жизненно необходимы для транспорта в нее питательных вещества их полное исчезновение в мембране привело бык гибели клетки. Показано, что уровень резистентности бактерий за счет изменений в их внешней мембране ниже, чем, например, при наличии защитных, инактивирующих антибиотики ферментов. Однако среди штаммов, выделяемых в клинике, часто обнаруживаются такие, у которых выявляются сразу два механизма резистентности ослабление проникновения антибиотика через внешнюю мембрану и ферментативная инактивация антибиотика. В этом случае уровень антибиотикорезистентности особенно высок. Одна из основных причин, вызывающих потребность в создании и внедрении в медицинскую практику новых беталактамных антибиотиков, — распространение среди патогенных микроорганизмов способности продуцировать ферменты, катализирующие расщепление беталактамного кольца у пенициллинов и цефалоспоринов, внедрённых в медицинскую практику. Они получили название пенициллиназ и цефалоспориназ в соответствии сих субстратной специфичностью и избирательностью действия на пенициллины или цефалоспорины. Ферментативное расщепление (гидролиз) беталактамного кольца ведет к полной инактивации беталактамного антибиотика. Это было показано на примере бензилпенициллинов еще в х гг. Э. Чейном, впервые очистившим пенициллин. Продукт ферментативного расщепления бензилпенициллина — пенициллоиновая кислота: полностью неактивна. Это легко объяснимо, так как механизм действия беталактамных антибиотиков связан именно с расщеплением беталактамного кольца и ацилированием гидроксильной группы серина в активном центре ферментов-мишеней. В случае же пенициллиназ и цефалоспориназ беталактамное кольцо также расщепляется, и антибиотик быстро освобождается из активного центра этих ферментов с присоединением атома водорода и гид роксила. В настоящие время пенициллиназы и цефалоспориназы составляют обширную группу одинаковых по механизму действия, но разнящихся по субстратной специфичности ферментов, объединенных под общим названием «беталактамазы». Известно, что бе- талактамазы произошли от транспептидаз и 0,0-карбоксипепти- 136 даз пептидогликана, те. из ферментов-мишеней в бактериальной клетке, необратимо инактивируемых беталактамами. Гены беталактамаз, особенно цефалоспориназ, локализуются как в бактериальной хромосоме, таки в плазмидах, которые не находятся под столь строгим регуляторным контролем в клетке как хромосомный генетический материал, и могут существовать во многих копиях, что повышает количество генов беталактамаз и уровень самих ферментов в клетке. Между хромосомами и плазми дами нередко происходит обмен генами, в частности беталакта маз. Очень важно, что гены беталактамаз, локализованные в плаз миде, могут передаваться при конъюгации вместе с плазмидой в другую клетку. Это означает, что плазмидные гены быстро распространяются по клеточной популяции, для чего ненужно даже деления клеток. Возможен и межвидовой перенос плазмидных генов беталактамаз, например, из клетки кишечной палочки в клетку сальмонеллы и т.п. Беталактамазы могут быть как конституитивными (у одних штаммов бактерий, таки индупибельными (у других штаммов Иногда водной клетке могут оказаться две разных беталактама зы, причем одна из них образуется постоянно, те. конституитив- но, тогда как другая обнаруживается, когда клетка попадает в среду с беталактамным антибиотиком. Способность к индукции беталактамаз является отрицательным свойством беталактамных антибиотиков с позиций медицинской практики, поэтому новые беталактамные структуры оцениваются при изучении их свойств не только на устойчивость к ферментативной инактивации, но и на способность индуцировать беталак тамазы. Последняя зависит оттого, с какой мишенью, тес каким из PBPs связывается беталактамный антибиотик, так как именно PBPs являются сенсорами, запускающими сложный механизм индукции беталактамаз. Схематически этот механизм выглядит следующим образом беталактамный антибиотик, находящийся в среде, реагирует с одним из белков, принадлежащих к PBPs. Его взаимодействие с белком ведет к изменению конформации этого белка. Меняются биофизические параметры белка, сигнал об этом передается на специальный трансмембранный белок, молекула которого пересекает цитоплазматическую мембрану и выходит на ее внешнюю поверхность. Далее сигнал последовательно передается на первый и второй цитоплазматические белки, включенные в систему индукции ферментов и, наконец, на белок-репрессор, уже непосредственно регулирующий экспрессию именно гена беталакта мазы. В результате репрессор перестает подавлять экспрессию этого гена. Соответственно, начинаются его экспрессия и синтез молекул информационной РНК, которая далее поступает в рибо- 137 сомную систему, где на ней как на матрице синтезируются молекулы беталактамазы. Система индукции беталактамаз специфична на своем начальном участке PBPs являются первичными сенсорами в отличие от других белков мембраны, а наконечном участке — белок репрессор специфичен только для гена беталактамазы. Среди беталак- тамных антибиотиков обнаружены как очень активные индукторы беталактамаз, таки малоактивные, которые более предпочтительны для использования в клинике. Ввиду несомненного сходства многих беталактамаз сих фер ментами-мишенями был предпринят поиск специфических ингибиторов беталактамаз. Среди природных беталактамов и продуктов их химической трансформации были отобраны ингибиторы беталактамаз, воздействующие и на беталактамазы, и на транс пептидазы пептидогликана, те. обладающие антибактериальной активностью. Практическая ценность ингибиторов беталактамаз обусловлена тем, что их используют вместе с беталактамными антибиотиками, которые чувствительны к беталактамазам. Ингибиторы бе талактамаз защищают эти антибиотики от ферментативной инактивации. Широкую известность получили такие ингибиторы, как клавулановая кислота (слева) и сульбактам (справа): и некоторые другие. Однако необходимо учитывать, что любой конкретный ингибитор не может воздействовать на все многочисленные типы беталактамаз. Спектр действия каждого ингибитора ограничен беталактамазами лишь нескольких типов, распространенных среди бактерий. За рубежом выпускаются смесь полусинтетического пенициллина (ампициллина) с сульбактамом (2 : 1) под фирменным названием «уназин», а также препарат сультамициллин — химическое соединение ампициллина с сульбактамом. Получил практическое применение и препарат аугментин, являющийся смесью амоксициллина (полусинтетического пенициллина) с клавулано- вой кислотой. При подборе комбинаций ингибиторов беталакта маз с беталактамными антибиотиками важно иметь ввиду и соблюдать следующее условие фармакокинетика ингибитора и антибиотика должна быть сходной. Иными словами, их распределе- 0 = С С НС ООН ние по органами тканям организма, пути выведения (например преимущественно с мочой или с желчью, время циркуляции в организме должны быть близкими. Ингибитор не сможет выполнять свою защитную роль, когда его концентрация в местах лока лизаций антибиотика окажется низкой или если он будет выводиться из организма гораздо быстрее, чем антибиотик. Ферментативная инактивация аминогликозидов — наиболее часто встречающийся механизм резистентности к этим антибиотикам. Ферменты, инактивирующие аминогликозиды, существенно отличаются от беталактамаз. Во-первых, они не являются гидролазами, те. их активность выявляется непросто вводной среде а требует для своего проявления более сложной реакционной смеси Во-вторых, если часть беталактамаз — грамположительных микроорганизмов относится к внеклеточным ферментам, что облегчает их обнаружение, то ферменты, катализирующие инактивацию аминогликозидов, практически всегда имеют только внутриклеточную локализацию. Ферменты, инактивирующие аминогликозидные антибиотики, относятся по современной номенклатуре и классификации ферментов к классу трансфераз. Это означает, что они не расщепляют молекулу аминогликозидных антибиотиков, а переносят (англ. transfer) на нее определенные фрагменты, катализируя замещение гидроксильных группу аминогликозидов остатками фосфорной или адениловой кислоты, а аминогруппы аминогли козидов замещают остатками уксусной кислоты. Таким образом инактивирующие аминогликозиды ферменты включают фосфотрансферазы, аденилтрансферазы, ацетилтрансферазы. Важнейшее свойство данных ферментов заключается в том, что каждый фермент катализирует замещение только одной функциональной группы в молекуле аминогликозидного антибиотика. Однако обычно этого бывает достаточно для потери антибиотиком своей активности. Донором переносимых на аминогликозидные антибиотики остатков фосфорной и адениловой кислоты является широко известное макроэргическое соединение аденозинфосфорная кислота АТФ. В реакционной смеси АТФ должна присутствовать вне клетки (в среде) ферменты не могут играть защитную роль, так как для проявления их активности необходима АТФ в высокой концентрации. Для проявления активности аминогликозид-ацетил- трансфераз необходимо присутствие в реакционной смеси уксусной кислоты, кофермента Аи АТФ (или, вместо двух первых компонентов, одного ацетилкофермента А). Воздействующие на аминоглинозиды ферменты обычно локализованы в цитоплазматической мембране бактерий, а в случае грамотрицательных бактерий — в периплазматическом пространстве — между клеточной стенкой и внешней мембраной. Такая локализация ведет к инактивации аминогликозидов вовремя их проникновения в клетку и защищает от них мишени (рибосомы). Гены ферментов, катализирующих фосфорилирование, ацетилирование или аденилирование аминогликозидов, как правило локализованы у бактерий в R-плазмидах. Локализация таких генов в бактериальных хромосомах встречается крайне редко. Таким образом, и здесь наблюдается отличие от беталактамаз, гены которых встречаются как в плазмидах, таки в бактериальных хромо сомах. После установления механизмов ферментативной инактивации аминогликозидных антибиотиков резистентными к ним бактериями начались попытки целенаправленной трансформации молекул аминогликозидов с целью сделать их «нечувствительньми» к инактивирующим ферментам. Так, в молекуле канамицина группа N H в первом положении в аминоциклигольном фрагменте молекулы была замещена остатком L-y-амино-а-оксим асляной кислоты. Это привело к общему изменению конформации природной молекулы, при сохранении у нее почти всех функциональных групп. Сохранилась антибактериальная активность, но была в тоже время потеряна чувствительность ко всем ферментам, распространенным среди резистентных микроорганизмов инактивирующим аминогликозиды. Полученное производное названное «амикацин», оказалось высокоэффективным против штаммов бактерий, имеющих фосфотрансферазы, ацетилтранс- феразы и аденилтрансферазы, инактивирующие исходный кан- амицин. В настоящее время амикацин — наиболее эффективный полусинтетический аминогликозидный антибиотик, поскольку он подавляет рост микроорганизмов, резистентных к природным ами- ногликозидам, за счет ферментативной инактивации последних как наиболее распространенного механизма резистентности Резистентность микроорганизмов к антибиотикам тетрациклиновой группы тетрациклину, окситетрациклину, хлортетрацик- лину получила широкое распространение в связи сих многолетним использованием в медицине, а также в животноводстве в качестве ростстимулирующих добавок к кормам сельскохозяйственных животных. В настоящее время в медицинской практике используется в основном тетрациклина в животноводстве — все три указанных выше антибиотика. Изучение механизмов резистентности бактерий к тетрацикли- нам привело к результатам, резко отличающимся от тех, что были выявлены в случае беталактамов и аминогликозидов. Так, ферментативной инактивации тетрациклинов резистентными к ним микроорганизмами обнаружено не было. В редких случаях резистентность была связана с защитой или экранированием от тетрациклинов (ингибиторов белкового синтеза) рибосом. У резистентных штаммов был найден белок, предотвращающий доступ тетрациклинов к местам их связывания на рибосоме. Наиболее часто встречающийся механизм тетрациклинорезис- тентности обусловлен изменениями, происходящими в оболочке, точнее в цитоплазматической мембране бактериальной клетки. Известно, что в клетках резистентных штаммов тетрациклины не накапливаются. При этом в цитоплазматической мембране присутствуют несколько новых белков, которые отсутствуют в мембране тетрациклиночувствительных штаммов. Эти новые белки появляющиеся в цитоплазматической мембране при тетрацикли- норезистентности, являются белками, составляющими систему активного выброса тетрациклинов, проникающих в клетку. Иными словами, тетрациклины проходят через оболочку бактериальной клетки, в том числе и через цитоплазматическую мембрану однако они не успевают прореагировать с рибосомами, так как быстро удаляются или выбрасываются в среду. В настоящее время в медицинскую практику внедрено несколько продуктов химической трансформации природных тетрациклинов. Наиболее важным из них является доксициклин (6-дезокси-5-ок- |