Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
Максимально высокая скорость синтеза достигается при создании оптимальных условий выращивания высокоактивной биомассы Для этого в ферментере поддерживаются определенные (оптимальные) концентрации источников углерода, аммонийного азота минеральных солей, ростовых факторов, pH и температура. Рис. 17. Схема биосинтеза лизина у коринебактерий 179 Все процессы с высоким уровнем накопления аминокислоты (порядка 50— 100 гл) ведутся при дробной подаче субстратов — источников углерода и азота. В качестве источников углерода при биосинтезе аминокислот используют углеводы или органические кислоты например, ацетата в качестве источника азота, необходимого для построения аминогруппы, — аммонийные соли и аммиак. Несмотря на то, что аминокислоты в целом нейтральны, в процессе их биосинтеза происходит сильное закисление среды вследствие нарушения ионного баланса культуральной жидкости. Дело в том, что микроорганизмы-продуценты преобразуют ионы аммония NHJ, присутствующие в питательных средах в форме аммонийных солей (NH 4 CI, (NH 4 ) 2 S 0 4 и др.), в аминные группы аминокислоты. При этом в среде остаются несбалансированными лишние радикалы С, SO 4 ". Для поддержания в среде оптимальной концентрации ионов аммония и оптимальной величины pH биосинтез аминокислот ведут при автоматическом рН-статирова- нии аммиаком. Оптимальную концентрацию источников углерода в среде можно поддерживать, подавая в ферментер раствор углеводов стой скоростью, которая отражает темп потребления сахаров культурой продуцента. При промышленном производстве аминокислот широко применяют также автоматический режим подачи углеводов по сигналу от датчика pH. При этом рН-статирование ведут не аммиаком или аммиачной водой, а смесью аммиачной воды и углеводов При правильном выборе соотношения между ними на постоянном уровне поддерживается концентрация не только ионов аммония, но и источников углерода. Для ауксотрофов типа продуцента лизина чрезвычайно важным параметром является начальная дозировка в среде источников ростовых факторов (тех аминокислот, которые штамм немо bbжет синтезировать самостоятельно. Их избыток приводит к угнетению биосинтеза при их дефиците концентрация клеток продуцента в ферментере будет недостаточна для обеспечения высокой скорости накопления аминокислоты. Поэтому у продуцентов, аналогичных продуценту лизина, существует оптимальная концентрация ростовых факторов. Эта величина непостоянна. Она может варьировать в зависимости от сырья, аэрационных возможностей аппаратуры, температуры культивирования. Процессы биосинтеза аминокислот являются энергоемкими в связи с чем ферментация при получении аминокислот обязательно должна проводиться в аэробных условиях при интенсивной аэрации и перемешивании, обеспечивающих скорость растворения кислорода 3 — 7 гл ч). После образования в ферментере активной биомассы, синтезирующей аминокислоту, необходимо создать условия, при которых клетки микроорганизмов работали бы как можно дольше В процессе биосинтеза по разным причинам они теряют жизнеспособность, и для продления активного участка ферментации применяют разные методы. В частности для ауксотрофных продуцентов аминокислот (например, продуцента лизина) продолжительность биосинтеза и выход целевой аминокислоты могут быть увеличены, если походу ферментации в питательные среды вносить подпитки, содержащие источники углерода в смеси с источниками ростовых факторов (белковыми гидролизатами). Синтез целевой аминокислоты может прекращаться из-за воздействия на продуцент токсичных метаболитов синтезируемых самим же продуцентом. Примером сказанному может служить биосинтез фенилаланина продуцентом Bacillus subtilis. Бациллярные продуценты в процессе роста на средах с углеводами синтезируют ацетоин и бутандиол — вещества, необходимые клеткам для образования спор. При этом клетки начинают лизировать, споро ваться и прекращают вырабатывать фенилаланин. Избежать накопления побочных примесей удается, если процесс ферментации ведут, лимитируя источник углерода. Раствор сахара, служащий для этого продуцента источником углерода подают в среду с постоянной скоростью, но меньшей, чем скорость его утилизации культурой. Вследствие этого в культураль ной среде поддерживается очень низкая фоновая концентрация источника углерода, и весь подаваемый сахар расходуется на синтез фенилаланина. В результате рабочий цикл ферментации возрастает в 1,5 — 2 раза, а доля примесей (не только ацетоина, но и побочных аминокислот) снижается. При этом выход фенилаланина и конверсия источника углерода в целевую аминокислоту увеличивается почтив два раза. Эффективность использования субстрата при биосинтезе целевой аминокислоты зависит также от продуктивности биомассы Если синтез аминокислоты разобщен с ростом биомассы (как у продуцента лизина, то эффективность использования субстрата будет тем выше, чем дольше культура будет работать после остановки роста. Если же синтез идет параллельно росту (как у продуцента треонина, то продуктивность биомассы можно увеличить перераспределив потоки субстратов внутри клетки, расширяя поток предшественников на биосинтез аминокислоты, одновременно сужая все остальные потоки. Однако не всегда этого удается достичь с помощью таких технологических приемов, как в примере с продуцентом фенилаланина. Для этой цели наиболее действенны методы генетической инженерии — введение в клетку микроорганизма многокопийных гибридных плазмид, содержащих гены, контролирующие биосинтез аминокислоты, что приводит к увеличению количества соответствующих ферментов в клетке. У генно-инженерных продуцентов ферментативная система действует наподобие вакуумного насоса, мобилизующего все ресурсы клетки на образование целевой аминокислоты в ущерб росту биомассы и синтезу других клеточных компонентов При введении гибридных плазмид побочные примеси, как правило автоматически исчезают, при этом продуктивность биомассы и коэффициент использования субстрата существенно возрастают. Пробиотики П робиотики — живые организмы и/или вещества микробного или иного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, а также на биохимические и поведенческие реакции организма хозяина, оптимизируя его микробиологический статус. С имбионт — участник симбиоза совместного проживания организмов разных видов водной и той же экологической нише Симбиоз многоклеточных организмов с одноклеточными — древнейшее явление в эволюции. Оно возникло в тот момент, когда появились многоклеточные организмы. Известно, что в соответствии с научными представлениями жизнь на Земле возникла около 3 —4 млрд лет назад в силу естественных причин. При этом первыми живыми существами были микроорганизмы. По некоторым данным их эволюция продолжалась около миллиарда лет. Именно за это время сформировалось все многообразие биохимических реакций, которые лежат в основе центрального метаболизма всех живых существ. Многоклеточные организмы возникли на основе одноклеточных в мировом океане (водной и той же экологической нише) и симбиоз многоклеточных организмов с одноклеточными наблюдался с самого начала их возникновения. Известно, что в процессе эволюции у многоклеточных организмов сформировались механизмы, обеспечивающие переменчивость внутренней среды, и типы взаимодействия многоклеточных организмов с одноклеточными На сегодня известны следующие формы симбиоза мутуализм — взаимовыгодный симбиоз паразитизм — один из партнеров получает одностороннюю выгоду за счет другого комменсализм — один из партнеров получает одностороннюю выгоду, не нанося при этом никакого ущерба другому организму нейтрализм — партнеры не оказывают заметного влияния один на другого. Все эти формы наблюдаются при рассмотрении симбиоза одноклеточных микроорганизмов с многоклеточными. Когда говорят конкретно о симбиозе человека с микроорганизмами, имеют ввиду, что кожные покровы, слизистые оболочки и полости человеческого тела, сообщающиеся с внешней средой , заселены огромным количеством микроорганизмов — симбионтов. П р им еры ж елудочно-киш ечны й тракт (Ж КТ) — от полости рта до прямой кишки органы дыхания — от носоглотки до альвеол толстый кишечник. О собен ном ного микроорганизмов в толстом кишечнике, где насчитывается до родов и более 1 0 0 видов микроорганизмов обладающих огромной метаболической активностью. По этой активности микроорганизмы толстого кишечника сравнивают иногда с печенью, где метаболическая активность считается наивысшей Естественно, что микроорганизмы толстого кишечника существенно влияют на физиологию человека (рис. 18). Микрофлора толстого кишечника участвует в процессе переваривания пищи — попадающие туда белки, углеводы и другие компоненты пищи расщепляются ферментами, продуцируемы мим икроорганизмам и симбионтам и. Они также способны продуцировать так называемые целлюлазы — комплекс ферментов, который позволяет расщеплять клетчатку. Для человека эта функция сим бионтной микрофлоры играет небольшую роль, у некоторых же организмов (Травоядных и жвачных животных) усвоение клетчатки осуществляется только благодаря микроорганизмам -сим бионтам . Микроорганизмы толстого кишечника могут осуществлять гидролиз (способствовать усвоению) других компонентов пищи. В частности, молочнокислые бактерии расщепляют лактозу до молочной кислоты. Микроорганизмы -сим бионты способны также расщеплять некоторые другие попадающие с пищей соединения. Например, они могут восстанавливать нитраты до нитритов и затем катализировать их. Нитриты могут обладать мутагенными и аутогенными (онкогенными свойствами, поэтому, нейтрализуя их, микроорганизмы предотв- Рис. 18. Функции симбионтной микрофлоры ращают воздействие этих потенциально активных аутогенных (онкогенных) факторов на организм человека. Но следует отметить что некоторые микроорганизмы-симбионты могут активировать некоторые проканцерогенные вещества. Микроорганизмы-симбионты обеспечивают организм человека некоторыми питательными веществами, например витаминами (К, группы В, в меньшей степени каротиноидами и другими жирорастворимыми витаминами. Кроме витаминов они способны продуцировать органические кислоты (молочную, уксусную янтарную, муравьиную, которые всасываются и усваиваются макроорганизмом. Некоторые из этих микроорганизмов могут продуцировать незаменимые аминокислоты, в частности лизин, триптофан, треонин. Одновременно микроорганизмы симбионты обеспечивают утилизацию микроэлементов, образуя комплексы, которые более эффективно всасываются стенками кишечника, что особенно важно, когда этих микроэлементов в пище оказывается недостаточно. Симбионтная микрофлора является также стимулятором не специфического иммунитета (антигенным стимулятором) и обеспечивает неспецифическую резистентность макроорганизма. И последнее заселив ЖКТ (резидентная микрофлора, мик- роорганизмы-симбионты препятствуют поселению здесь посторонних микроорганизмов, в том числе и патогенных. В окружающей среде существует огромное количество микроорганизмов, которые нашли бы в кишечнике человека благоприятные условия для своего развития (это и обилие питательных веществ, и постоянная температура, и влажность. Однако патогенные микроорганизмы (гнилостные, а также продуцирующие разные токсины и токсические соединения, например, Clastridium butulinum) не размножаются в кишечнике человека. Почему же этого не происходит Потому что экологическая ниша занята микроорганизма ми-симбионтами, препятствующими поселению в ней посторонней микрофлоры. Функции симбионтной микрофлоры в основном были установлены в течение прошлого века. Главную роль сыграли эксперименты на стерильных животных (гнотобионтах). Гнотобиология — область биологии, которая занимается изучением стерильных животных, в организм которых вводят тот или иной микроорганизма затем исследуют влияние микрофлоры на жизнедеятельность организма животных и птиц. Например, для получения стерильного цыпленка куриное яйцо тщательно обрабатывают антисептиками, убивая все микроорганизмы на поверхности ив порах скорлупы, и помещают его в термостат. Через 21 день вылупляется цыпленок, которого помещают в стерильную камеру, куда подается стерильный воздух кормят стерильной пищей и поят стерильной водой Стерильных животных также можно получать кесаревым сечением. Например, беременной свинье делают кесарево сечение затем половину числа поросят помещают в стерильные условия а остальных — в обычные и сравнивают. На основании подобных опытов было установлено: •стерильные животные живут несколько дольше, чем нестерильные. Вначале прошлого века И. И. Мечников выдвинул гипотезу, что одна из причин старения — отравление организма человека гнилостной микрофлорой, обитающей в толстом кишечнике. Идея И. И. Мечникова о том, что существуют гнилостные микроорганизмы, с которыми можно бороться с помощью других микроорганизмов, которые подавляют рост первых, получила свое дальнейшее развитие и на ее основе были созданы препараты пробиотиков; • эти животные нуждаются в большом количестве питательных веществ, витаминов, органических кислот, хуже усваивают некоторые органические соединения; •они чрезвычайно чувствительны к любой слабовирулентной и даже условно-патогенной инфекции. Попавшие в стерильную среду условно-патогенные бактерии сразу же заселяют ЖКТ и, не находя там никакой конкуренции, проникают в кровоток, вызывая инфекцию и быструю гибель животного. Это связано с отсутствием у таких животных реакций неспецифического иммунитета которые индуцируются симбионтной микрофлорой. Какие же микроорганизмы-симбионты обитают в ЖКТ? Классификация их постоянно меняется, поэтому рассмотрим основные группы микроорганизмов, присутствующих в ЖКТ. Первая группа — бифидобактерии (Bifidobacterium bifidum , longum, infantis, breve) и молочнокислые бактерии (Lactobacillus acidophilus, plantarum) — грамположительные, анаэробные микроорганизмы (строгие анаэробы, обычно лишенные каталазы неспорообразующие. Это самая многочисленная группам икроор- ганизмов-симбионтов. В процессе метаболизма они продуцируют молочную кислоту (иногда только ее) и другие органические кислоты (уксусную и т.д.). В кишечном содержимом ребенка, находящимся нагрудном вскармливании, бифидобактерии составляют до 99 % всех микробных популяций. Их титр доходит до 10" — 10'2 в 1 г кишечного содержимого. Это сметанообразная масса, из которой состоят экскременты ребенка, находящегося нагрудном вскармливании. Сна чалом прикорма к содержимому кишечника ребенка присоединяются другие микроорганизмы. Среди них важная роль принадлежит лактобактериям или молочнокислым бактериям. Количество лактобацилл у здоровых людей в 1 г кишечного содержимого колеблется, составляя (5—50)- Большинство из вышеперечисленных бактерий относится к совершенно безвредным микроорганизмам. Они ни при каких уело виях не вызывают патологические процессы . Существует вид Lactobacillus plantarum — растительная палочка (млечный сок на срезах растений, которая также присутствует в кишечнике человека. Этот микроорганизм не относится к совершенно безвредным лактобактериям. У людей с различными видами иммунодефицита СПИД, аутоиммунные заболевания и т.д.) Lactobacillus plantarum находят даже на клапанах сердца при эндокардитах. Следующий род молочнокислых бактерий кишечника — энте рококки, которые сравнительно недавно были выделены из рода Streptococcus. Существуют два важнейших вида энтерококков: Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis. Среди последнего вида культур часто встречаются штаммы, которые могут вызывать патологические процессы. Вторая группа бактерий — условно-патогенные и гнилостные бактерии (в принципе, это одни и те же микроорганизмы, и это деление носит условный характер. Условно-патогенные (следует из названия) бактерии при определенных условиях могут вызывать патологические процессы. Эти бактерии постоянно присутствуют в организме человека и поражают его, когда он либо ослаблен, либо в том случае, когда численность условно-патоген ных бактерий возрастает до очень высоких значений. В последнем случае они вызывают вялотекущие воспалительные процессы в ЖКТ (энтероколиты и дизентероподобные заболевания. Также они могут заселять и нетипичные для них области, например протоки поджелудочной железы и желчного пузыря, а также сам желчный пузырь, вызывая там патологические процессы (в нормальном состоянии в этих областях микроорганизмов-симбионтов нет — они стерильны). Наконец, у ослабленных людей условно-патогенные микроорганизмы могут поступать в кровь и вызывать очаговые воспалительные процессы (эндокардиты, артриты, гнойничковые заболевания — вплоть до сепсиса. Важнейшая по значению группа (не по численности) — семейство энтеробактерий — кишечная группа микроорганизмов. К ней относятся как явные патогены, например некоторые виды сальмонелл — возбудители таких инфекционных заболеваний, как тиф, паратиф (Sallm onella typhi и Sallmonella paratyphi) и дизентерия (Shigellae), таки большое количество условно-патогенных бактерий. К числу последних относятся кишечная палочка, протеи, сальмонеллы, стафилококки и др. Второй по численности род микроорганизмов обитателей кишечника (после бифидобактерий) — бактероиды. Это грамотрицательные микроорганизмы, строгие анаэробы. Их титр водном грамме кишечного содержимого составляет Ю 0 — 10". Среди этих микроорганизмов есть и муколитические штаммы, выполняющие полезные функции, однако у ослабленных людей эти штаммы могут вызывать патологические процессы Следующая группа — кластридии (Clastridium). Эти микроорганизмы выполняют важную экстралитическую функцию (именно кластридии продуцируют экстралитические ферменты одновременно при определенных условиях они могут вызывать и патологические процессы, например при попадании в брюшную полость К кластридиям также относятся и некоторые патогены (возбудители газовой гангрены, столбняка, ботулизма). В кишечнике (также как ив других полостях организма) встречаются дрожжи рода Candida (условно-патогенные микроорганизмы, которые при избыточном размножении вызывают молочницу. При применении антибиотиков широкого спектра действия резидентная микрофлора кишечника уничтожается, атак как эти антибиотики не действуют на дрожжи рода Candida, то естественно, что в отсутствие конкуренции эти микроорганизмы избыточно размножаются. |