Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
Итак, важнейшая роль среди этих двухосновных групп микроорганизмов принадлежит бифидо- и молочнокислым бактериям которые благодаря своей антагонистической активности по отношению к условно-патогенным бактериям подавляют жизнедеятельность последних. При этом они полностью контролируют численность условно-патогенных и гнилостных бактерий и поддерживают ее на уровне, безопасном для физиологии человека. Симбионтная микрофлора делится на пристеночную и внутри полостную. Пристеночные бактерии размножаются на поверхности эпителия, а внутриполостные прикрепляются к твердым остаткам пищи, так как многим видам бактерий для того, чтобы они размножались (делились, нужно прикрепиться к какому нибудь твердому субстрату. К внутри полостным относятся энтеробактерии и некоторые штаммы бифидо- и лактобактерий. Антагонистическая активность бифидо- и молочнокислых бактерий по отношению к условно-патогенной микрофлоре (бактериостатическое и бактерицидное действия) проявляется в виде факторов ее подавления образования молочной и других органических кислот (муравьиная кислота, токсичных для условно-патогенных и гнилостных микроорганизмов. Одновременно эти кислоты снижают pH кишечного содержимого (закисляя его, что также неблагоприятно сказывается на жизнедеятельности последних образования пероксидных соединений, при расщеплении которых выделяется атомарный кислород, подавляющий клетки условно-патогенной микрофлоры образования антибиотикоподобных веществ (бактериоцинов: ацидофилина, колицинов и др, подавляющих метаболизм ус ловно-патогенных и гнилостных бактерий, взаимодействуя с клеточной мембраной и вызывая лизис клеток • способности прикрепляться к эпителию кишечника, образуя на его поверхности плотную биопленку (за счет интенсивного размножения, что является препятствием для фиксации патогенных микроорганизмов изменения окислительно-восстановительного потенциала среды , что создает неблагоприятные условия для размножения условно-патогенных и гнилостных микроорганизмов. Совокупность этих факторов в целом подавляет избыточное развитие условно-патогенной и гнилостной микрофлоры. Состоянием икроэкологической системы толстого кишечника, когда молочнокислые бактерии превалируют в численности над услов- но-патогенными и гнилостными бактериями, называется эуби о зом или эубактериозом. И наоборот, состояние, при котором численность би фи дои молочнокислых бактерий снижается, а гнилостных и условно-патогенных соответственно возрастает, называется дисбактериозом. Избыточное размножение гнилостных микроорганизмов будет вызывать интоксикацию макроорганизма, включая порочный круг явлений, когда у ослабленного человека возникают и развиваются дополнительные инфекции. Более того при этом условно-патогенные микроорганизмы способны сами вызывать развитие дисбактериоза. Какие причины ведут к развитию дисбактериоза Одна из них — попадание в организм человека группы веществ с антибактериальной активностью. Среди таких веществ первое место принадлежит антибиотикам. Конечно, антибиотики, как раньше, таки сейчас, играют колоссальную роль в терапии больных с инфекциями разного рода, спасении сотен миллионов жизней, ноу них имеется негативный эффект они не выбирают между мутуалистиче- скими штаммами (молочнокислые бактерии, патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Антибиотики широкого спектра действия подавляют всю микрофлору Ж КТ, в том числе и молочнокислые бактерии. Их подавление ведет к тому, что по завершении лечения условно-патогенные бактерии и гнилостные микроорганизмы начинают доминировать над молочнокислыми бактериями. Дело в том, что в клетках гнилостных и условно-па- тогенных бактерий чаще встречаются плазмиды, определяющие устойчивость к тем или иным антибиотикам, которые передаются от клетки к клетке. В результате популяция условно-патогенных и гнилостных микроорганизмов становится устойчивой к действию тех или иных антибиотиков. Кроме антибиотиков в организм человека с пищей попадают вещества, которые вводят в пищу специально для предотвращения ее порчи гнилостными микроорганизмами. Это так называемые консерванты, которые сами по себе обладают антибактериальной активностью. В пище могут содержаться и антибиотики которые применяют в животноводстве и птицеводстве для лечения заболевших животных и птица также для стимулирования их роста и развития. Пища (особенно растительная) может содержать гербициды и пестициды, обладающие антибактериальной активностью. Развитию дисбактериоза способствует изменение гормонального статуса макроорганизма (вовремя полового созревания, беременности, при половом угасании. Физиологическое состояние макроорганизма влияет на жизнедеятельность, размножение и поддержание симбионтной (в частности, пристеночной) микрофлоры. С возрастом количество пристеночной микрофлоры (молочнокислых бактерий) уменьшается, происходит изменение гормонального статуса. При этом возможно очень быстрое слущи- вание пристеночной микрофлоры — слизистая обнажается и становится доступной для условно-патогенных и гнилостных микро организмов. Оказывается, что если человек испытал сильный стресс, то у него наследующий день может появиться диарея и связано это с изменением гормонального статуса под влиянием стресса. А если этот стресс хронический, тотем самым создаются условия для развития дисбактериоза. Препараты пробиотиков предназначены для профилактики и лечения дисбактериоза. В России производят в основном монова лентные препараты бифидумбактерин (на основе Bifidobacterium bifidum), апилак (на основе Lactobacillus acidophillus), колибакте- рин (на основе кишечной палочки ЕМ, лактобактерин на основе Lactobacillus plantarum, fermentum). Комплексные препараты, например бификол (Bifidobacterium и ЕМ. За рубежом — поливалентные (комплексные) препараты симбиофтор (Enterococcus faecium + Е. coli), бификор (Bifidobacterium longum + + Enterococcus faecfium), примадофилюс (содержит комплекс микроорганизмов симбионтов) и другие — энтерол (на основе дрожжей, гастрофарм (Lactobacillus bulgarius не является симбионтом и поэтому действует какое-то короткое время. Существуют препараты, которые содержат живые клетки микроорганизмов сим бионтов, но при этом не являются пробиотиками, например бак тисуптил (на основе культуры Bacillus cereus, мутантного штамма IP Особенно широко применяют пробиотики в клинике детских болезней (при острой дизентерии, сальмонеллезе, эшерихиозе, вирусных диареях, диатезе и др. Известно, что в детском организме еще не сформировалась микроэкологическая система ЖКТ, поэтому у детей часто наблюдаются диспепсия и диарея. В этом случае применение препаратов пробиотиков оказывается очень эффективным. Изучение длительного применения препаратов про биотиков в детских коллективах показало, что дети, систематически получавшие данные препараты и кисломолочные продукты, содержащие пробиотические штаммы, реже болеют не только кишечными инфекциями, но и ОРЗ, лучше растут и развиваются, легче переносят любые детские инфекции. Препараты про биотиков также применяют в комплексном лечении кишечных инфекций (при колитах; бактериальных кольпитах, вызванных стафилококком и кишечной палочкой энтероколитах на фоне нарушения микрофлоры с дефицитом или полным отсутствием бифидофлоры и др.). По завершении лечения антибиотиками необходимо обязательно провести лечение пробиотиками для восстановления нормальной микрофлоры. Пробиотики назначают также ослабленным людям при соматических заболеваниях. Нередко возникает порочный круг, когда сама ослабленность является причиной дисбактериоза, а он в свою очередь усугубляет течение соматического заболевания. Препараты пробиотиков назначают и лицам преклонного возраста, так как у них в связи с изменением гормонального статуса уменьшается количество бифидо- и лактобактерий. Поэтому для нормализации микрофлоры нужно периодически (а в преклонном возрасте — постоянно) потреблять диетические пищевые продукты наряду с препаратами пробиотиков. Например ацидофилин, который получают на основе ацидофильной закваски, бифидумбактерин. Какова технология процесса получения таких препаратов Во первых, необходимо иметь штаммы микроорганизма симбионта. Их выделяют из кишечного содержимого здоровых детей и взрослых, например штамм Enterococcus faecium был выделен из кишечника ребенка. Во-вторых, выделенные штаммы обязательно надо идентифицировать. Дело в том, что для получения пробио тиков разрешены штаммы только определенных видов микроорганизмов. Эти штаммы должны обладать следующими свойствами эффективной антагонистической активностью, обеспечиваемой в свою очередь синтезом органических кислот, которые штамм должен активно продуцировать. При выделении штаммов бифидобактерий важным антагонистическим началом продуктов метаболизма являются муравьиная и молочная кислоты. Желательно также, чтобы эти штаммы продуцировали пероксиды и антибио тикоподобные вещества эффективной способностью прикрепляться к эпителию кишечника, если речь идет о пристеночных микроорганизмах не гидролизовать кишечную слизь, которая обладает протек тивным действием. Некоторые микроорганизмы продуцируют мукополисахариды, которые разрушают (гидролизуют) эту слизь не повреждать клетки кишечного эпителия (холециты). Отобранные штаммы обязательно проверяют на патогенность и токсичность in vitro на культуре клеток холецитов, на чувствительных животных. Побочные эффекты у пробиотиков не должны проявляться даже при их избыточных дозах. Для проверки препарат вводят в организм чувствительных животных в больших количествах, иногда до нескольких граммов на килограмм веса. Штаммы должны быть технологичны, те. хорошо расти и размножаться на искусственных питательных средах. Их обрабатывают методом лиофилизации замораживают до низких температур и затем высушивают при низком давлении. Соответственно, отобранные штаммы должны быть криорезистентны и выдерживать процедуру высушивания. Удовлетворяющие всем этим требованиям штаммы поступают в контрольный институт, откуда их передают в фармацевтическое производство с соответствующими документами, в которых отражены их характеристики. В заводских лабораториях штаммы высеивают на искусственные питательные среды, проверяют их соответствие паспортным данным (род, вид, биологические свойства И только после этого используют для получения препаратов про биотиков. В условиях промышленного производства эти штаммы рассеивают и получают отдельные колонии, которые затем пересевают на агаризованные или жидкие питательные среды (например, молочнокислые бактерии хорошо растут в обезжиренном молоке). И бифидобактерии, и лактобациллы, и энтерококки — это ауксотрофы, те. для своего роста они нуждаются в ряде питательных веществ и микроэлементов, не могут сами синтезировать аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины их должна содержать питательная среда. Для культивирования этих бактерий используют такое сырье, которое разрешено к применению в пищевой промышленности, так как препарат, выращенный на этих средах, впоследствии используется для внутреннего применения. Источником аминокислот обычно служит белок молока (казеин, который гидролизуют с помощью ферментов (трипсина и пепсина) и получают, соответственно, триптол или пептол. Как источник витаминов, а также пиримидиновых и пуриновых оснований используют дрожжевой экстракт, который получают из дрожжей рода Saccharomyces (пивных либо пекарских. В качестве микроэлементов используют соли магния, марганца, цинка, которые добавляют в питательную среду для культивирования молочнокислых бактерий. Источником энергии, как правило, служит лактоза или глюкоза. Обычно молочнокислые бактерии культивируют от 8 до 16 ч довольно короткая ферментация. Собирают штаммы в той фазе роста, при которой выживание клеток культуры будет наиболее длительным, что в свою очередь, при дальнейшем получении препарата, обеспечивает его длительное хранение. Все это определяется экспериментальным путем и часто является ноу-хау фир- 191 мы-производителя. Как правило, выбирают конец логарифмической фазы или начало стационарной, в зависимости от культуры штамма. По завершении процесса культивирования получают бактериальную суспензию, содержащую в 1 мл 1 0 9 и более клеток Эти клетки собирают, используя поточные центрифуги или сепараторы, в которых образуется похожая на сметану с кремовым оттенком масса со специфическим запахом кислого молока (напоминает прессованные дрожжи. Раствор криопротекторов (вещества белковой природы — обезжиренное молоко или желатин углеводы — лактоза, сахароза) добавляют в проточную массу и получают густую суспензию клеток, которую разливают в ампулы Затем их замораживают в жидком азоте и подвергают лиофильной сушке. Сухая масса приобретает пузырчатый вид. Ее измельчают и определяют титр, в соответствии с которым вносят во флаконы стеклянные, пластмассовые) или смешивают с культурой другого штамма. В последнем случае получают несколько видов микроорганизмов симбионтов. Форма выпуска — флаконы (бифидумбактерин) или ампулы (бификол, содержащий бифидобактерии и кишечную палочку или капсулы (индийский препарат «Нутролин В, содержащий штаммы лактобацилл, или пакетики (бифидумбактерин фирмы Партнер, Россия. Ферменты Ферменты или энзимы (fermentum — закваска, enzyme — в дрожжах) — высокомолекулярные соединения белковой природы, являющиеся катализаторами биохимических реакций в живых организмах и вне их. К настоящему времени найдена лишь одна ферментативная реакция небелковой природы, когда молекула РНК катализирует собственное разрезание на части. В живой клетке присутствует множество разнообразных соединений, но реакции между ними не беспорядочны, а образуют строго определенные метаболические пути, характерные для данной клетки. Индивидуальность клетки в большой степени определяется уникальным набором ферментов, который она генетически запрограммирована производить. Отсутствие даже одного фермента или какой-нибудь его дефект могут иметь очень серьезные отрицательные последствия для организма. Все ферменты относятся к глобулярным белкам, причем каждый фермент выполняет специфическую функцию, связанную с присущей ему глобулярной структурой. Однако активность многих ферментов с большой молекулярной массой — от 1 0 кДа до МДа и более (для сравнения молекулярная масса глюкозы 180, диоксида углерода 44, аминокислот от 75 до 204) зависит от небелковых низкомолекулярных соединений, называемых кофак торами. Молекулярный комплекс белковой части (апофермента) и кофактора называется холоферментом. Роль кофактора могут выполнять ионы металлов (Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, K+, Na+) или сложные органические соединения. Органические кофакторы обычно называют коферментами, некоторые из которых являются производными витаминов. Связи между ферментом и коферментом могут быть разными. Иногда они существуют отдельно и связываются только вовремя реакции. В других случаях кофактор и фермент связаны постоянно и иногда прочными ковалентными связями (тогда небелковую часть фермента называют простетической группой. Важнейшими коферментами являются производные витаминов, кофакторами — минералы (макро- и микроэлементы. При дефиците витаминов и минералов активность ферментативных реакций резко падает, с чем связаны многие патологические процессы в организме. Ферменты делятся на простые и сложные. Простые состоят только из аминокислота сложные (их большинство) помимо белка включают небелковую группу (кофактор или кофермент). Особенностью ферментов является их исключительно высокая активность (они ускоряют реакции в миллиарды раз. Так, одна единственная молекула фермента может катализировать при обычной температуре превращение от тысячи до миллиона молекул вещества в минуту. Эта скорость катализа недостижима для небио логических катализаторов. Другое, не менее важное, свойство ферментов — специфичность (избирательность) их действия в отношении структуры субстрата, типа реакций и условий ее проведе ния. Ферменты, обладая высокой специфичностью, направляют превращение вещества в строгое русло. Они катализируют реакции в мягких условиях, те. при обычном давлении, небольшой температуре и значениях pH, близких к нейтральным, весьма чувствительны к сдвигам pH среды и изменению температуры. Так как максимальная активность фермента обусловлена оптимальной конформацией молекулы фермента в целом и активного центра в частности, то даже небольшие изменения окружающих условий, которые затрагивают связывание субстрата или конформацию третичной структуры белка, будут соответственно влиять на скорость ферментативной реакции. Оптимальное pH для каждого фермента означает, что состояние его ионизации соответствует наилучшей комплементарности. Изменение температуры вызывает противоречивый эффект с одной стороны, при повышении температуры до 37 — 40 С скорость ферментативной реакции увеличивается, что закономерно для катализа с другой стороны, при температуре более 50 Сна пинается денатурация фермента. Ферментативные процессы не дают побочных реакций, для них характерен 1 0 й выходце левого продукта. Ферменты регулируемы, те. могут изменять свою активность под воздействием ряда факторов, при этом выход целевого продукта будет разным. Этим обеспечивается скоординированность всех метаболических процессов во времени. Скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству фермента, поэтому недостаток фермента в организме означает низкую скорость превращения какого-либо соединения, и наоборот, одним из путей приспособления организма к изменениям внешней среды является увеличение количества требуемого фермента. Известно более 6 ООО ферментов, многие из которых катализируют только одну реакцию 150 из них выделены в кристаллическом виде. Энзимы классифицируются не как индивидуальные вещества а как катализаторы определенных химических превращений или групп химических превращений, в соответствии с этим их подразделяют на шесть основных классов оксидоредуктазы — катализаторы окислительно-востановитель- |