Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
ных реакций трансферазы — реакции переноса отдельных групп с одной молекулы на другую гидролазы — гидролитическое расщепление связей (с участием воды лиазы (синтазы) — реакции соединения или расщепления молекул (присоединения-отсоединения воды, аммиака, диоксида углерода и т.д.); • изомеразы — взаимопревращение изомеров (изменение строения внутри одной молекулы лигазы (синтетазы) — образование связей в реакции конденсации двух разных соединений с участием энергии АТФ. Осознание ключевой роли ферментов во всех клеточных процессах привело к широкому их применению в разных отраслях, в том числе при производстве лекарственных средства также в медицинской практике в качестве лечебных и диагностических препаратов. В настоящее время четко определились три основных направления исследований в области медицинской энзимологии энзимо- патология, энзимодиагностика и энзимотерапия. Энзимопатология. Как известно, из более чем двух тысяч наследственных болезней человека молекулярный механизм развития выяснен только у двух-трех десятков. Чаще всего развитие болезни непосредственно связано с наследственной недостаточностью или полным отсутствием синтеза одного-единственного 194 фермента в организме больного. Типичный пример подобной связи болезни с отсутствием синтеза в печени специфического фермента — фенилпировиноградная олигофрения — наследственное заболевание, приводящее к гибели в раннем детстве или к развитию тяжелой умственной отсталости. Фермент фенилала- нин-4-монооксигеназа, катализирующий реакцию превращения незаменимой аминокислоты фенилаланина в тирозин, неси н тезируется в клетках печени. Лечение в основном сводится кис bbключению из питания ребенка (в том числе и из молока матери аминокислоты фенилаланина. Аналогично развитие другого тяжелого наследственного заболевания — галактоземии (непереносимость молочного сахара) связано с отсутствием синтеза в клетках печени фермента, катализирующего превращение галактозы в глюкозу. Следствие подобной аномалии — накопление галактозы в тканях и развитие катаракты в раннем детстве, поражение тканей печении мозга, нередко приводящее к гибели ребенка лечение в этом случае сводится к исключению из диеты молочного сахара. Помимо наследственных заболеваний энзимопатология успешно решает и проблемы патогенеза соматических болезней, в задачу которых входит выяснение молекулярных основ, например, злокачественного роста клеток, атеросклероза или ревматоидных артритов. Энзимодиагностика. О степени поражения органов, биомемб ран клеток и субклеточных структур, о тяжести патологического процесса можно судить по появлению (или резкому- повышению уровня) органотропных ферментов и изоферментов в сыворотке крови больных, что составляет предмет диагностической энзимо- логии. В настоящее время известно более 30 ферментов, активность которых повышается в крови при повреждении клеток различных органов в период острого и хронического заболеваний. Определение активности большинства из этих ферментов в сыворотке крови используется для диагностики и контроля лечения многих заболеваний. Для каждого из этих ферментов определены контрольные величины (уровни) активности и пределы колебания в норме как в сыворотке крови, таки в самом органе. В качестве примера можно сослаться на результаты определения активности трансаминаз — аспартатаминотрансферазы и ала- нинаминотрансферазы; активности этих ферментов в сыворотке крови в норме составляют 5 — 40 ME. При сердечной недостаточности и ишемической болезни сердца активность обеих трансами наз в сыворотке крови больного незначительно повышается, однако при наступлении инфаркта миокарда уже через 2 0 мин активность обеих трансаминаз в сыворотке крови резко (в десятки и сотни раз) превышает уровни контрольных величин в крови здорового человека Кроме трансаминаз сыворотки крови при инфаркте миокарда весьма информативными диагностическими ферментными пробами являются лактатдегидрогеназный и креатинфосфокиназный тесты, относящиеся также к так называемым некротическим ферментным методам. При повреждении и распаде части сердечной мышцы вследствие закупорки коронарной артерии тромбом из обескровленной зоны вымываются в кровь продукты распада включая ферменты. При благополучном исходе болезни уровни ферментов в сыворотке крови возвращаются к норме уже ко вто- рому-третьему дню после инфаркта. Но при повторном инфаркте миокарда, наступающем обычно в течение первой недели болезни, электрокардиограмма обычно не улавливает его, тогда как ферментные тесты реагируют повторными резким повышением уровня их в сыворотке крови. Диагностическая ценность ферментов существенно повысилась после внедрения в клиническую практику методов определения изоферментов. В этой связи отметим диагностическую значимость двух ферментов, определение изоферментных спектров которых внедрено почти во всех клинических лабораториях мира. Первый из них — лактатдегидрогеназа (ЛДГ), катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную Подчеркнем, что ЛДГ является ключевым ферментом анаэробного обмена углеводов во всех живых организмах, определяя скорость образования энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ Широко распространенный фермент ЛДГ синтезируется почти во всех клетках организма человека. Различают два типа ЛДГ: так называемый сердечный Нот англ. heart — сердце) и мышечный М-тип (от англ. muscle — мышцы каждый из них состоит из четырех субъединиц. При органическом поражении сердечной мышцы, например инфаркте миокарда, в сыворотке крови резко повышается уровень общей лактатдегидрогеназы, что преимущественно обусловлено изоферментами 1 и 2 (это очень важно для точности диагноза). При поражениях скелетной мускулатуры, а также при воспалительных процессах (гепатиты) или при вирусных поражениях ткани печении, наконец, при отравлении тетрахлоридом углерода или другими ядами, когда преимущественно поражается печень, вызывая некроз ткани, уровень изоферментов 3 и 4 ЛДГ резко повышается при почти неизмененном уровне 1 и 2 изоферментов. Естественно, что методы лечения будут резко отличаться в выборе метода немалую роль играет изоферментный спектр ЛДГ Н- или М-типа. Второй фермент, диагностическая ценность которого еще выше особенно при инфаркте миокарда, — креатинфосфокиназа (КФК), катализирующая биосинтез креатинфосфата из креатина и АТФ Креатинфосфокиназа — ключевой фермент биосинтеза макроэр- 196 гического субстрата — креатинфосфата, играющего наряду с АТФ выдающуюся роль в биоэнергетике сердечной мышцы и всего организма. Молекула КФК также состоит из субъединиц двух типов — мышечного (Ми мозгового (Вот англ. brain — мозг выделены и охарактеризованы три изофермента КФК. Диагностическая энзимология достигла значительных успехов при постановке диагноза болезней не только указанных органов но и других, в частности почек, поджелудочной железы, желудка, кишечника и легких. Одним из первых тестов на поражение печени является определение активности щелочной фосфатазы — фермента, катализирующего отщепление фосфатной группы от органических соединений — эфиров фосфорной кислоты. Активность данного фермента значительно повышается при первичных и вторичных новообразованиях печени, печеночном холестазе, циррозе печени Также в клинической практике широко используют, например определение трансамидиназы в сыворотке крови — фермента, открытого только в ткани почек и поджелудочной железы или определяют активность фермента гистидазы, обнаруженного только в клетках печении эпидермиса кожи. При органических поражениях этих органов, воспалительных процессах, травмах, хирургических вмешательствах в сыворотке крови больных появляются указанные ферменты, в норме в ней отсутствующие. Энзимотерапия. В настоящее время для фармацевтических целей применяется свыше 40 ферментных препаратов животного растительного и микробного происхождения. Получен ряд препаратов протеолитического действия (трипсин, химотрипсин и др специальные фибринолитические препараты (фибринолизин, стрептолиаза и др препараты, уменьшающие вязкость гиалуроновой кислоты (лидаза, ронидаза) и др. Эти препараты часто используются при лечении заболеваний, сопровождающихся гной но-некротическими процессами, при тромбозах и тромбоэмболи ях, нарушениях процессов пищеварения и др. Ферментные препараты находят также применение при лечении онкологических заболеваний (аспарагиназа). Новые перспективы успешного применения ферментных препаратов открывает разработка новых лекарственных форм — иммобилизованных ферментов (стрептоде- каза). Одновременно стал расширяться круг лекарственных средств действие которых связано с инактивированием ферментов. К ним относятся ингибиторы протеолитических ферментов (пантрипин, ингитрил и др, широко применяемые при лечении острых пан креатитов и других заболеваний избирательно действующие ингибиторы фибринолиза (аминокапроновая кислота и др, применяемые в качестве антигеморрагических средств также большая фуппа антихолинэстеразных препаратов ингибиторы моноами- 197 ноксидазы, применяемые как психотропные средства ингибиторы карбоангидразы, используемые в качестве диуретиков. Эффективность аллопуринола при гиперурикемии связана с ингибированием им фермента ксантиноксидазы, действие тетурама при лечении алкоголизма — с угнетением им фермента ацетальдеги- доксидазы. Важную группу лекарственных веществ составляют реактива торы ферментов, восстанавливающие инактивированную функцию ферментов (реактиваторы холинэстеразы). Микробиологическим синтезом для медицинских целей получают следующие ферментные препараты солизим — гидролизующий жиры липолитический фермент который применяется при хронических заболеваниях ЖКТ; • а-амилаза — сахаролитический фермент, гидролизующий крахмал, используется в составе лечебного препарата «фестал» при недостаточной функции поджелудочной железы террилитин — протеолитический фермент, который рекомендуется для лечения гнойных ран ожогов, трофических язв стрептокиназа — фибринолитический фермент, эффективный при лечении тромбозов; • галактозидаза — сахаролитический фермент, хорошо зарекомендовавший себя при лечения лактазной недостаточности. Традиционные биотехнологии, основанные на переработке тканей животных, поставляют в медицинскую практику трипсин, химотрипсин — протеолитические ферменты, используемые для рассасывания рубцов и спаечных процессов урокиназу — протеолитический фермент, предназначенный для лечения тромбозов; • пепсин — протеолитический фермент, незаменимый при расстройствах пищеварения. Те же традиционные биотехнологии, но основанные на переработке растительного сырья, дают такие протеазы, как броме лин, папаин, фицин, которые используются в заместительной терапии при нарушении пищеварения ив серологической диагностике для выявления резус-фактора. Лекарственные формы на основе ферментов характеризуются большим разнообразием — это таблетки, капсулы, мази, аэро золи. В нашей стране и за рубежом первое место по объему выпускаемых ферментных препаратов занимают протеолитические наиболее глубоко изученные среди всех известных ферментов Протеазы в числе первых белков были получены в высокоочи- щенном кристаллическом состоянии. Расшифрована первичная структура таких ферментов, как химотрипсин, трипсин, папа ин, субтилизин. К настоящему времени известно четыре класса протеаз сериновые, карбоксильные, цистеиновые и металлопро- 198 теазы. Классификация основана на специфическом строении активных центров этих ферментов, которые представляют уникальное сочетание определенных аминокислотных остатков, расположенных в разных точках полипептидной цепи. Для идентификации определенных реакционных групп используют специфические ингибиторы. Класс сериновых или щелочных протеаз объединяет группу протеолитических ферментов, содержащих в активном центре триаду аспарагин серин гистидин. Специфическими ингибиторами этих ферментов, чья максимальная активность проявляется в диапазоне pH 7,5— 12,5, являются фенилметилсульфонилфторид и диизопропилфторфосфат. К щелочным протеазам относятся ферменты из животного сырья трипсин и химотрипсин, которые широко используются в медицинской практике как для местного и парентерального применения. Их применяют ив виде аэрозолей при воспалительных заболеваниях дыхательных путей — трахеитах, пневмонии, атак же в виде внутримышечных инъекций при остеомиелитах, тром бофлебитах и разных формах пародонтоза. По отношению к здоровым тканям эти препараты неактивны и безопасны в связи с наличием в этих тканях ингибиторов трипсина. Из различных штаммов микроорганизмов Bacillus subtilis выделены и детально изучены внеклеточные щелочные протеиназы. Субтилизины — одни из немногих белков, для которых определена трехмерная структура и построена модель молекулы. Благодаря широкой специфичности действия, эти ферменты гидролизуют до 80 связей в белках. Они обладают эстеразной и амидазной активностями стабильны в диапазоне pH 5 — 10, однако оптимум действия проявляют при pH 9 — 10. По механизму действия и субстратной специфичности субтилизины близки к трипсину и хи мотрипсину, несмотря на отсутствие какого-то бы ни было сходства в структуре между ними. В биотехнологической промышленности щелочные протеазы из бактериальных культур задейству ются для гидролиза белков с последующем использованием гидролизатов в качестве компонентов питательных сред, поставляемых в клинико-бактериологические лаборатории. Основными представителями класса карбоксильных или кислых протеаз являются пепсин, химозин и протеазы из грибов Первичная структура пепсина расшифрована и включает 300 аминокислотных остатков. Пепсин продуцируется клетками слизистой оболочки желудка в виде зимогена — неактивной формы фермента, которая активируется под действием другого фермента-акти ватора, отщепляющею в молекуле зимогена аминокислоту с конца В активном центре зимогена содержатся две карбоксильные группы аспарагиновой кислоты. Специфическим ингибитором протеаз данного класса является природный пепстатин. Для кислых протеаз характерны некоторые общие признаки. Они стабильны в кислой среде (pH 2,0—5,0); оптимум действия при pH 1,5 —5,0 и быстро инактивируются при нейтральном значении pH. Пепсин и химозин не имеют а-спиралей, но характеризуются наличием антипараллельной структуры. Японские исследователи полагают, что устойчивость кислых протеаз при низких значениях pH связана именно с этой особенностью их вторичной структуры. Тиолзависимые или цистеиновые протеазы в медицинской практике представляют папаин из дынного дерева, фицин из латекса растений, бромелин из плодов ананаса и ряд ферментов из микроорганизмов. Цистеиновые протеазы содержат в активном центре триаду аминокислот — цистеин-гистидин-аспарагиновая кислота. Активность тиоловых протеаз подавляется специфическими блокаторами сульфгидрильных групп (йодацетатом, йодацетамидом, П-хлор- меркурибензоатом, ионами тяжелых металлов. Их максимальная активность проявляется при pH 6 ,0—9,5. Папаин и химопапаин устойчивы к действию температуры. Отличительная особенность этих ферментов — высокая устойчивость к денатурирующим веществам, например в 6 — 8 М мочевине или в 70% метиловом спирте их активность не изменяется. При изучении их гидролитической активности было показано что эти ферменты расщепляют белки глубже по сравнению сфер ментами животного и бактериального происхождения. Так, папа ин способен гидролизовать практически любые пептидные связи Кроме пептидных связей тиолзависимые ферменты гидролизуют амидные и эфирные связи. Бромелин, папаин и фицин используются в медицине для лизирования нежизнеспособных некротических тканей при лечении гнойно-воспалительных процессов. В результате энзима тического очищения ран сроки заживления сокращаются в 1,5 — 2,0 раза. Бромелин, папаин и фицин применяются в заместительной терапии при нарушении пищеварения, а также в акушерской практике при выявлении и предотвращении резус-конф- ликтных ситуаций. Класс нейтральных или металлопротеаз составляют ферменты в основном микробного происхождения. Нейтральные протеазы в активном центре содержат ионы Са2+ и Zn2+. Эффективные при нейтральных значениях pH металлопротеазы проявляют строго эндопептидазную активность и не расщепляют пептидные связи, образованные аминокислотными остатками со свободной NH 2- и СООН-группами. Нейтральные протеазы гидролизуют казеин, желатин, яичный альбумин ив отличие от субтилизинов не обладают эстеразным действием. В медицинской практике широко используется террилитин из Aspergillus terricola для лечения острых гнойных заболеваний и трофических язв. Ингаляциями террилитином лечат воспалительные процессы в легких. Другая нейтральная протеаза микробного происхождения — коллагена за применяется в глазной хирургии для рассасывания рубцовой ткани. Несмотря на то, что уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов — рибонуклеазы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома С, трудно ожидать, что синтетическое получение ферментов получит широкое распространение в ближайшие десятилетия ввиду сложности и дороговизны, поэтому единственным способом получения ферментов остается выделение их из биологических объектов. Выделяют ферменты также, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, заключающийся в осаждении и быстром обезвоживании (при температуре не выше 10 С) тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К числу таких методов относится и получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента Адсорбционный метод выделения и очистки ферментов разработан детально. Одна из его модификаций — аффинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему вещества выходят стоком проявителя. Изменяя характер проявителя нужный фермент элюирует с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноступенчатую (аффинная сорбция — элюция) схему выделе |