Занятие 9. Часть 1 Надо сделать Пройти лекцию до конца к настоящему времени Вы заработали баллов 0 из 0 возможных

Название	Занятие 9. Часть 1 Надо сделать Пройти лекцию до конца к настоящему времени Вы заработали баллов 0 из 0 возможных
Дата	05.04.2023
Размер	0.78 Mb.
Формат файла
Имя файла	imm9.docx
Тип	Занятие #1039690
страница	1 из 6

1 2 3 4 5 6

Интерактивное занятие №9. Часть 1

Надо сделать: Пройти лекцию до конца

К настоящему времени Вы заработали баллов: 0 из 0 возможных.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции

В настоящее время существует 4 группы методов лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, направленных на выявление:

Вируса в биологических субстратах (кровь, пунктаты лимфатических узлов и др.) инфицированных людей с помощью вирусологических методов (ВИЧ-культура)
Вирусных антигенов (конкурентный ИФА, реакция им- муннофлуоресценции и др.)
Антител к ВИЧ: ИФА, иммуноблотинг (вестерн-блотинг), радиоиммуннопреципитация, метод агглютинации с использованием различных носителей, метод иммуннофлуоресценции и др.;
Генетического материала ВИЧ: молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция.

Наиболее широко используются методы, направленные на обнаружение антител к ВИЧ. Серологическая диагностика осуществляется в специализированных лабораториях в два этапа: на первом этапе выявляют антитела против антигенов ВИЧ с помощью твердофазного иммунноферментного анализа (ИФА). На втором этапе в качестве подтверждающего теста используют метод вестерн- блотинга/иммуноблотинга, который позволяет определить антитела к отдельным вирусным белкам.

Для того, чтобы сделать диагностическое заключение, необходимо учитывать данные эпидемиологического анамнеза, иммунологических тестов и результатов клинического обследования.

Порядок освидетельствования на антитела к ВИЧ определен Федеральным законом

В соответствии с указанными документами освидетельствование на ВИЧ-инфекцию делится на обязательное и добровольное:

Обязательное тестирование на антитела к ВИЧ

Обязательному тестированию на антитела к ВИЧ подлежат:

1.     Доноры крови и гемокомпонентов, спермы и других биологических жидкостей, тканей и органов при каждом взятии донорского материала.

2.     Врачи, средний и младший медицинский персонал центров по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями.

3.     Врачи, средний и младший медицинский персонал лабораторий по диагностике СПИДа лечебно-профилактических учреждений, которые осуществляют скрининг (обследование) населения на ВИЧ-инфекцию и исследование крови и биологических материалов, полученных от инфицированных ВИЧ.

4.     Врачи, средний и младший медицинский персонал, привлекаемый к непосредственному обследованию, диагностике, лечению, обслуживанию и к другой работе с инфицированными ВИЧ, имеющие с ними непосредственный контакт.

Добровольное медицинское освидетельствование

Процедура добровольного консультирования и тестирования на ВИЧ (ДКТ) должна быть стандартизована и предлагаться пациентам в следующих ситуациях:

при желании пациента получить помощь, касающуюся профилактики передачи или заражения ВИЧ;
при наличии медицинских показаний, выявленных при обследовании и лечении пациента;
для профилактики передачи ВИЧ от матери ребенку.

В то время как предложение пройти тестирование на антитела к ВИЧ при определенных обстоятельствах должно стать обязательным, само тестирование должно проводиться только после получения информированного согласия пациента и в условиях строгой конфиденциальности.

Процедура получения информированного согласия в различных медицинских учреждениях неизбежно будет отличаться, но ее основные компоненты неизменны:

предоставление пациенту достаточной информации о ВИЧ-инфекции;
осознание им положительных и отрицательных последствий определения своего ВИЧ-статуса;
его свободный выбор в отношении тестирования на антитела к ВИЧ.

В соответствии с Федеральным законом от 30 марта 1995 г. N 38-ФЗ «О предупреждении распространения в Российской Федерации заболевания, вызываемого вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекции)», приказом министерства здравоохранения Российской Федерации от 30 октября 1995 г. № 295 «О введении в действие правил проведения обязательного медицинского освидетельствования на ВИЧ и перечня работников отдельных профессий, производств, предприятий, учреждений и организаций, которые проходят обязательное медицинское освидетельствование на ВИЧ», СП 3.1.5.2826-10 «Профилактика ВИЧ- инфекции», постановлением Госкомстата России от 05.05.99 № 30 «Сведения о результатах исследования крови на антитела к ВИЧ» обязательному медицинскому освидетельствованию подлежат :

1.     Доноры крови, биологических жидкостей, органов и тканей.

2.     Работники отдельных профессий, производств, предприятий, учреждений и организаций (медицинские работники, военнослужащие, сотрудники лабораторий, работающие с кровью и ее компонентами)

3.     Иностранные граждане и лица без гражданства

4.     Лица, находящиеся в местах лишения свободы

5.     Больные по клиническим показаниям:

6.     Больные с подозрением или подтвержденным диагнозом наркомания (с парентеральным путем введения наркотиков);

7.     Больные с подозрением или подтвержденным диагнозом заболевания, передающиеся половым путем;

8.     Беременные

9.     Лица, обследованные при проведении эпидемиологического обследования

10.  Мужчины, имеющие секс с мужчинами.

Любой гражданин Российской Федерации может обследоваться на предмет наличия у него антител к ВИЧ:

добровольно;
бесплатно в учреждениях государственной и муниципальной систем здравоохранения;
анонимно по желанию;

с предварительным и последующим консультированием по вопросам профилактики ВИЧ-инфекции

Граждане Российской Федерации, отказавшиеся от обязательного медицинского освидетельствования, или в случае выявления у них ВИЧ- инфекции, не могут быть донорами крови, биологических жидкостей, органов и тканей.

Обязательные требования к процедуре тестирования на антитела.

Обязательные требования к процедуре консультирования и тестирования на антитела к ВИЧ:

1.     Основным методом выявления ВИЧ-инфекции является проведение тестирования на антитела к ВИЧ с обязательным до- и послетестовым консультированием. Присутствие антител к ВИЧ является доказательством наличия ВИЧ-инфекции. Отрицательный результат тестирования на антитела к ВИЧ не всегда означает, что человек не инфицирован, поскольку существует период "серонегативного окна" (время между заражением ВИЧ и появлением антител, который обычно составляет около 3-х месяцев).

2.     Тестирование и консультирование должно быть добровольным.

3.     Пациент должен дать информированное согласие на проведение тестирования. Это означает, что

ему предоставлено достаточное количество информации;
он осознает положительные и отрицательные последствия определения своего ВИЧ-статуса;
дал свое согласие в обстановке, исключающей принуждение.

4.     При проведении дотестового консультирования необходимо заполнить форму информированного согласия на проведение освидетельствования на ВИЧ-инфекцию в двух экземплярах, одна форма выдается на руки обследуемому, другая сохраняется в ЛПУ (приложение №1).

5.     При дотестовом консультировании пациенту нужно рассказать о целях и процедуре тестирования, а также о возможностях лечения ВИЧ-инфекции и доступности различных видов социальной поддержки.

6.     Результаты тестирования на ВИЧ освидетельствуемому сообщает консультант в ходе послетестового консультирования.

7.     По возможности до- и послетестовое консультирование пациента проводит один и тот же специалист.

8.     О результатах тестирования нужно сообщать конфиденциально, эта информация должна быть доступна только медицинским работникам, имеющим непосредственное отношение к оказанию помощи пациентам.

9.     Пациенты с положительным результатом тестирования должны пройти консультирование и получить направления в службы медицинской и психосоциальной помощи.

10.  Консультирование должно проводиться обученным специалистом (желательно врачом-инфекционистом, врачом-эпидемиологом и психологом).

11.  При конфиденциальном тестировании персональные данные на пациента приводятся без сокращений (по паспорту или заменяющему его документу, удостоверяющему личность обследуемого): полные Ф.И.О., полная дата рождения, гражданство, адрес места жительства, код контингента.

12.  При анонимном тестировании (без паспорта) указывается только цифровой код, включающий порядковый номер освидетельствуемого, год рождения, место жительства (субъект Российской Федерации). Фамилия, имя, отчество освидетельствуемого не указывается.

13.  Результаты исследования по телефону не сообщаются.

14.  Оказание психологического давления, принуждение, запугивание, осуждение и пренебрежительное отношение должны быть исключены из взаимодействия медицинских работников с пациентами, т.к. использование таких приемов является барьером получению медицинской помощи.

Приоритетным направлением противодействия эпидемии ВИЧ/СПИДа является активное привлечение к обследованию на ВИЧ-инфекцию групп повышенного риска заражения.

Выявление ВИЧ-инфекции среди различных категорий населения, прошедших обследование, неодинакова. Наибольшая выявляемость ВИЧ-инфекции регистрируется среди потребителей инъекционных наркотиков, лиц, находящихся в местах лишения свободы. Известно, что лица употребляющие наркотики, имеющие опыт пребывания в пенитенциарных учреждениях, являются наиболее социально неадаптированными, и наиболее труднодоступными для обследования и медицинского обеспечения, следовательно данная категория граждан и в дальнейшем будет служить резервуаром для развития эпидемии ВИЧ- инфекции.

Диагностика ВИЧ-инфекции в начальных стадиях болезни до развития СПИДа проводится на основании лабораторных исследований (выявление специфических антител или антигенов). Традиционным материалом для определения антител к ВИЧ продолжает оставаться сыворотка или плазма крови, хотя в настоящее время спектр биологических материалов расширен.

Диагностика ВИЧ-инфекции включает два этапа: установление инфицирования ВИЧ и определение стадии заболевания. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции осуществляется по четырем направлениям:

индикация ВИЧ и его АГ
обнаружение специфических АТ к АГ вируса
выявление провирусной ДНК и РНК ВИЧ
выделение вируса

Иммуноферментный анализ в диагностике ВИЧ-инфекции

Иммуноферментный анализ (ИФА, enzyme immunoassay) - является основным, наиболее широко применяемым методом определения общих антител к вирусам. Для определения АГ и АТ методом ИФА используется твердофазный вариант с иммобилизацией одного из компонентов реакции на твердой фазе (пластиковых планшетах). В частности, АГ ВИЧ зафиксированы на дне лунок планшетов; при наличии АТ к ВИЧ в сыворотке крови происходит образование комплекса АГ-АТ. Эффективность иммобилизации АГ на пластике в лунках во многом зависит от качества этого материала, учитывая, что при проведении анализа дважды осуществляется отмывка планшетов. Прочность связывания АГ ВИЧ с пластиком влияет на чувствительность ИФА (важно, чтобы при промывке сохранялась прочная фиксация комплекса АГ-АТ на стенках лунок).

Принцип метода заключается в том, что исследуемый образец сыворотки крови инкубируется одновременно с сорбированной на твердой фазе смесью АГ ВИЧ-1, ВИЧ I (О), ВИЧ-2 и ATк ВИЧ-1 АГ и с конъюгатом (та же смесь ВИЧ антигенов/антител, меченых пероксидазой хрена). При наличии в образце ATк ВИЧ-1 и /или к ВИЧ-2 формируется твердофазный комплекс АГ + AT+ меченый АГ, если в сыворотке присутствует ВИЧ-1 АГ (р 24), то образуется комплекс AT+ АГ + меченое ферментом AT. После отмывки комплекса проводится инкубация с ТМБ - субстратом. При наличии в образце анти-ВИЧ- I, анти-ВИЧ 1 группы О, антиВИЧ-2 антител и/или ВИЧ-1 антигена, развивается интенсивная окраска, при отсуютвии их окрашивания не происходит.

При постановке ИФА в случае получения положительного результата анализ проводят еще 2 раза (с той же сывороткой от больного). При получении хотя бы еще одного позитивною результата диагностика ВИЧ- инфекции продолжается более специфичным методом иммунного блотинга (ИБ), позволяющего выявить антитела к отдельным белкам ретровируса. Только после положительного результата в ИБ возможно заключение об инфицированности лица ВИЧ.

Для тест-систем ИФА важным условием эффективного использования является качество АГ ВИЧ. Часто применяются вирусные лизаты, однако более предпочтительны наборы с иммобилизацией рекомбинантных вирусных белков, позволяющие повысить чувствительность и специфичность теста. Существует четыре поколения тест-систем ИФА:

·        первое поколение (лизатные тесты): на стенки лунок пластикового планшета в качестве АГ иммобилизированы лизаты культуры лимфоцитов, зараженных ВИЧ;

·        второе поколение: в качестве АГ на планшетах используются рекомбинантные белки и/или пептиды; определяются АТ как к ВИЧ-1, так и к ВИЧ-2, эти наборы более специфичны, чем тест-системы первого поколения, чувствительность – та же;

·        третье поколение: тесты на основе рекомбинантных белков и/или синтетических пептидов; определяются IgM и IgG к ВИЧ, улучшена чувствительность и специфичность (не менее 95–97%);

·        четвертое поколение: совмещенные тесты с иммобилизацией АГ и рекомбинантных АТ. Тест-системы позволяют определять р24-АГ и АТ к нему, чувствительность и специфичность – не менее 99%.

Тесты ИФА третьего и особенно четвертого поколения позволяют сократить интервал времени от момента инфицирования пациента до момента возможности выявления АТ (высокочувствительные тест-системы). При тестировании образцов крови в тест-системах ИФА преследуются три цели:

·        обеспечение безопасности трансфузии крови и ее препаратов;

·        эпиднадзор, мониторирование распространенности ВИЧ-инфекции;

·        диагностика ВИЧ-инфекции.

Чувствительность наборов ИФА

Чувствительность наборов ИФА находится в пределах 93–99%; большинство тест-систем ИФА для определения АТ к ВИЧ, выпускаемых в странах Западной Европы, имеют чувствительность около 99%. - Алгоритм диагностики ВИЧ инфекции методом ИФА представлен на рис. 1. Результаты ИФА интерпретируются как положительные, отрицательные и неопределенные. ВОЗ рекомендует проводить дополнительный тест использованием тест-наборов ИФА с отличающейся антигенной специфичностью. Подтверждающим тестом положительных реакций в ИФА является ИБ.

Рис. 1 - Алгоритм диагностики ВИЧ-инфекции.

Диагностика ВИЧ-инфекции в центрах по профилактике и борьбе со СПИДом осуществляется в два этапа: первичный скрининг – ИФА в планшетном формате; подтверждение первичного положительного результата методом ИБ. Тест-системы ИФА–ВИЧ–АТ/АГ позволяют одновременно выявить суммарные АТ к отдельным белкам ВИЧ-1, ВИЧ-2 и АГ р24 ВИЧ. На стенки лунок пластиковых планшетов иммобилизированы рекомбинантные АГ (gр120, gр41, gр36, р24, р31) и отдельно – моноклональные АТ к АГ ВИЧ-1 р24. Тест-системы содержат белковые компоненты ВИЧ-1 трех групп: env (gp41, gp120); gag (p24); pol (p31) и АГ gp36 ВИЧ-2. ИФА-диагностикумы ИФА–ВИЧ–АТ/АГ могут быть использованы для проведения дифференциальных исследований при получении положительных результатов скрининга в тест-системах, выявляющих комплекс АГ–АТ. Возможность определения АГ р24 ВИЧ-1 раздельно и одновременно с АТ к ВИЧ позволяет сократить сроки установления клинического диагноза.

Экспресс-методы в диагностике ВИЧ-инфекции

В последнее время часто стали широко использоваться экспресс-методы диагностики, основанные на принципах ИФА. При работе с большинством наборов результаты могут быть получены в течение 10–15 мин.

Методы экспресс-диагностики ВИЧ подразделяются на 3 группы:

основанные на принципе проточной цитофлюорометрии
агглютинационные методы
с использованием капиллярого потока (иммунохроматографические)

Наиболее современные тест-системы для экспресс-диагностики основаны на принципе капиллярного потока (иммунохроматографические). При этом вирусные АГ конъюгируются с коллоидным золотом или селеном. Капля крови или другой жидкости наносится на абсорбирующую полоску, содержащую необходимые реагенты и конъюгаты. В результате капиллярного потока образца при наличии противовирусных АТ в крови или другой исследуемой жидкости на тестовой полоске возникает цветная реакция. При положительном результате правильность проведения теста подтверждает появление контрольной полоски. При отрицательном результате правильно проведенного теста появляется только контрольная полоска.

Исследование слюны на наличие АТ к ВИЧ

При необходимости обследования значительного контингента населения на наличие в слюне АТ к ВИЧ (чаще эпиднадзор для суждения о распространенности ВИЧ в конкретном регионе) используется экспресс-тест, основанный на принципе ИФА. К часто используемым тест-системам относятся Oral Specimen Collection Device (SmithKline Beecham), Omni-SAL (Saliva Diagnostic Systems), GAC ELISA (IgG antibody capture ELISA) и др. Чувствительность и специфичность тестов – около 99%. На втором этапе положительные результаты этих тестов подтверждаются ИБ.

Иммуноблот

Окончательный диагноз ВИЧ-инфекции устанавливается при положительных результатах ИБ (рис. 2). При проведении этого метода используется нитроцеллюлозная полоска с нанесенными на нее вирусными белками. После инкубации сыворотки определение наличия АТ к некоторым белкам ВИЧ проводится с использованием иммуноферментного метода. В соответствии с критериями American CDC результат ИБ считается положительным при наличии двух из трех полосок: gp41, p24, gp120/gp160; American FDA – трех полосок: р24, р31 и одной из двух – gр41 или gр120/gр160 .

Рис. 2 - Результаты иммуноблотинга ВИЧ

На сегодняшний день рекомендована следующая оценка результатов ИБ:

·        положительный результат – определение в сыворотке крови АТ к двум вирусным белкам из группы env при наличии или отсутствии белков – продуцентов gag и pol;

·        отрицательный результат - отсутствие АТ;

·        неопределенный результат - выявление в сыворотке крови АТ к белкам из групп gag и pol.

Неопределенный результат ИБ чаще обусловлен белками- продуцентами экспрессии гена gag ВИЧ-1 р15/р17, р24 и р55; в этих случаях возможен положительный или ложноположительный результат. Окончательный диагноз устанавливается при использовании высокочувствительных методов, в частности ПЦР. Также рекомендуется повторить ИБ через 1 мес. Альтернативным вариантом является использование тест-систем ИФА-ВИЧ-АТ/АГ с определением, кроме суммарных АТ к ВИЧ, р24-АГ.

При использовании ИБ могут наблюдаться ложноположительные результаты при некоторых заболеваниях и состояниях: поликлональной гаммаглобулинопатии, системных заболеваниях соединительной ткани, гипербилирубинемии, перекрестной реакции с другими вирусными АГ. Определение АГ р24 с использованием тест-систем ИФА

Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции

Проблема ранней диагностики ВИЧ-инфекции может быть решена с помощью использования двух методик – реакции ПЦР для обнаружения РНК и высокочувствительного теста для выявления р24-АГ ВИЧ-1. После инфицирования ВИЧ-маркеры, идентифицирующие инфекцию, появляются в сыворотке в следующем порядке: вирусная РНК, р24-АГ и АТ к вирусным белкам. Считается, что использование ПЦР для выявления вирусной РНК является «золотым стандартом», позволяющим обнаружить инфекцию в наиболее ранние сроки. Ограничение применения методики связано с необходимостью предварительной обработки плазмы.

При определении р24-АГ методом ИФА плазма или сыворотка крови используются без предварительной обработки. Преимуществом также является стабильность р24 по сравнению с РНК ВИЧ. Коммерческие тесты для определения р24 в основном имеют чувствительность 3–9 пг/мл. Такие тест-системы сокращают интервал серонегативного «окна» по сравнению с тестами IV поколения ИФА со средней чувствительностью 25–50 пг/мл. Созданы еще более чувствительные иммуноферментные тест-системы для выявления р24-АГ ВИЧ-1, в частности «ДС–ИФА–ВИЧ–АГ-Скрин, РФ» с чувствительностью 0,5 пг/мл. Эта тест-система позволяет значительно сократить фазу серонегативного «окна» по сравнению с тестами с более низким порогом чувствительности.

Основной белок сердцевины ВИЧ (р24) может использоваться как дополнительный маркер в диагностике ранней фазы ВИЧ-инфекции, когда АТ отсутствуют или их концентрация настолько низкая, что даже очень чувствительные тест-системы ИФА не могут их выявить. Определение р24-АГ также помогает в установлении наличия ВИЧ- инфекции в более поздних ее стадиях, когда на фоне иммунодепрессии снижается синтез АТ к вирусу и их титр находится в концентрациях ниже разрешающей способности тест-систем ИФА. Определение р24-АГ наиболее целесообразно в ранней стадии ВИЧ-инфекции и в более поздних стадиях при    отсутствии АТ по результатам ИФА и при наличии оснований предполагать ВИЧ-инфекцию. В иммуноферментных тест-системах для выявления р24-АГ с чувствительностью 0,5 пг/мл используется одностадийный сэндвич-вариант постановки с поэтапным внесением конъюгатов. При этом достигается высокий уровень чувствительности анализа за счет процесса амплификации сигнала при взаимодействии биотина со стрептавидин- пероксидазой. Тест-системы для определения р24 с чувствительностью 0,5 пг/мл способны выявлять АГ в тот же период времени после заражения, что и вирусную РНК методом ПЦР, и на 2–7 дней раньше, чем тест-системы для определения р24 с более низкой чувствительностью.

Идентификация р24 подтверждает наличие ранней стадии ВИЧ-инфекции, служит ее дополнительным маркером и показателем активации репликации вируса, позволяет повысить контроль при заготовке крови и ее препаратов. Эффективность выявления ранней ВИЧ-инфекции с использованием иммуноферментных тест-систем для обнаружения р24-АГ ВИЧ-1 с чувствительностью 0,5 пг/мл значительно выше, чем тест-систем с более низкой чувствительностью, выявляющих р24, и сравнима с тестами, определяющими вирусную РНК методом ПЦР. Важным преимуществом является непродолжительное время анализа. Так, при использовании тест- системы «ДС–ИФА–ВИЧ–АГ-Скрин» оно составляет 1 ч. 55 мин. Иммуноферментные тест-системы для определения АГ р24 с чувствительностью 0,5 пг/мл могут быть эффективно использованы для проведения скрининга донорской крови, обследования лиц из группы риска для ранней диагностики ВИЧ-инфекции.

Тест-система для выявления антител к антигенам ВИЧ методом иммуноблотинга.

Полимеразная цепная реакция в диагностике ВИЧ- инфекции

ПЦР можно регистрировать по завершении амплификации (по конечной точке) либо на протяжении всей реакции (в реальном времени). В «классической» ПЦР анализ результатов проводится по конечной точке. С этой целью используется несколько методов: электрофорез в геле, гибридизационно-ферментный анализ (ГиФА), флуоресцентная детекция после ПЦР(FLASH) и др. Эти методы определяют количество продукта по завершении процесса, статически характеризуя динамический процесс. Методы ГиФА и FLASH более специфичны по сравнению с электрофорезом ДНК в результате повышения специфичности пробы к целевому амплификату. Преимуществом ПЦР в реальном времени является оценка исходного количества копий ДНК в образце.

Таким образом, для выявления ВИЧ-инфекции используют три теста:

ИФА-скрининг – тест имеет высокую чувствительность, хотя менее специфичен, чем ИБ;
vestern-blot, или ИБ, - позволяет установить наличие ВИЧ-инфекции;
определение р24-АГ - выявляется на протяжении примерно 2 недель ранней стадии ВИЧ-инфекции.

Стадии лабораторной классификации ВИЧ

Острая, ранняя и текущая ВИЧ-инфекция как стадии лабораторной классификации

Определение срока инфицирования ВИЧ прежде всего необходимо для проведения эпидемиологического мониторинга. Появляется возможность оценить два важных показателя – распространенность (prevalence) ВИЧ- инфекции и частоту новых случаев (incidence), необходимых для оценки течения эпидемии. С учетом устойчивого сочетания лабораторных критериев выделяют:

острую(acute) инфекцию - соответствует клинической стадии инкубации;
раннюю(recent) инфекцию - соответствует клинической стадии первичных проявлений;
текущую(established) инфекцию - все остальные клинические стадии за исключением последних стадий СПИДа;
серореверсию (снижение уровня титра антител к ВИЧ на фоне выраженной иммунодепрессии в поздних стадиях СПИДа, когда чувствительность тест- систем ИФА не позволяет установить низкий титр АТ к ВИЧ).

Определение острой ВИЧ-инфекции важно для контроля безопасности трансфузии донорской крови и ее препаратов. Динамика маркеров в период ранней ВИЧ-инфекции представлена на рис. 3. При острой инфекции ДНК ВИЧ-1 в клетках крови определяется на 5–6-й день заражения и в течение всего инфекционного процесса. РНК ВИЧ-1 (в высоких титрах) в сыворотке крови выявляется на 5–6-й день инфицирования и до сероконверсии (продолжительность периода определения – около 3–4 нед). Репликация ВИЧ уменьшается ниже уровня определения методом ПЦР в результате пока еще эффективного Т-клеточного иммунного ответа. При острой инфекции р24-АГ начинает выявляться в плазме крови с 11–16-го дня после заражения и может быть обнаружен в течение примерно 2 нед. Таким образом, р24-АГ определяется позже РНК ВИЧ, и продолжительность его выявления - меньше.

Через 3–4 нед. после инфицирования активируется гуморальный иммунный ответ. В крови появляются АТ к АГ ВИЧ – р24, gp41 и gp120, наблюдается сероконверсия, она может сохраняться до 3 мес. Сероконверсия совпадает с окончанием острой инфекции. В дальнейшем происходит снижение эффективности Т-клеточного ответа, прогрессирующее до выраженной иммунодепрессии в поздних стадиях СПИДа. Когда ВИЧ- инфекция находится в острой стадии (до появления АТ к АГ вируса), ИФА дает отрицательный результат в определении АТ. С целью более раннего подтверждения наличия инфекции дополнительно могут использоваться тесты для определения р24-АГ и РНК ВИЧ. Вирусная нагрузка на самых ранних этапах ВИЧ-инфекции очень высока и составляет от 10⁴ копий РНК в 1 мл, более низкие значения свидетельствуют об окончании острой фазы инфекции.

Рис. 4 - Динамика маркеров в период ранней ВИЧ- инфекции

При определении РНК ВИЧ-1 возможны ложноположительные результаты вследствие контаминации. При этом определяются низкие значения вирусной нагрузки (менее 50 копий РНК в 1 мл). Такой результат оценивается как ложноположительный. В этих ситуациях может быть целесообразно проведение теста на ДНК ВИЧ. При возможности одновременного исследования АТ к ВИЧ и вирусной нагрузки острую ВИЧ- инфекцию установить нетрудно. Обнаружение репликации вируса с использованием ПЦР более 50-5000 копий РНК в 1 мл крови и отсутствие АТ к ВИЧ, выявленное ELISA-тестом, соответствует острой ВИЧ-инфекции.

Если вирусная нагрузка равна 50–5000 копий РНК в 1 мл, что не соответствует острой фазе ВИЧ-инфекции, необходимо исследовать новый образец крови. При таком положительном результате ПЦР и отрицательном – на АТ к ВИЧ необходимо исключить возможность контаминации. Повторное обнаружение вирусной нагрузки 50–5000 копий РНК в 1 мл при отрицательном результате определения АТ предполагает необходимость исследования еще одного образца крови. При подтверждении предыдущего результата анализ трактуется как неопределенный, пациент должен находиться под серологическим контролем. Лабораторный алгоритм острой ВИЧ-инфекции представлен на рис. 5.

Рис. 5- Лабораторный алгоритм выявления острой ВИЧ-инфекции

Лабораторный диагноз острой ВИЧ-инфекции устанавливается при высоких показателях РНК ВИЧ (>5 000 копий в 1 мл) при отрицательном результате ИФА на наличие АТ. Основным методом, используемым для диагностики ранней ВИЧ-инфекции в странах Западной Европы, является sensitive/less sensitive (SLS) ELA test, или STARHS (Serologic Testing Algorithm for Recent HIVSeroconversion). Одновременно с ним проводится исследование образца сыворотки крови в двух ИФА-тестах одинакового формата, но с различной чувствительностью. У пациентов с текущей инфекцией определяется высокий титр АТ, у лиц с ранней ВИЧ-инфекцией, соответствующей клинической стадии первичных проявлений, титр АТ невысокий, выявляются при достаточном времени инкубации и без разведения образца сыворотки крови.

Серореверсия ВИЧ- инфекции

При серореверсии наблюдается не истинное исчезновение АТ к ВИЧ, а снижение их титра ниже уровня, определяемого в тест-системах ИФА. Серореверсия в последних стадиях СПИДа обусловлена несостоятельностью гуморального иммунного ответа или усилением репликации вируса с повышенным образованием иммунных комплексов, в состав которых вошли свободные АТ к ВИЧ, поэтому их невозможно определить в скрининге с использованием тест-системы ИФА. В этих ситуациях применение ПЦР для выявления провирусной ДНК ВИЧ позволяет определить инфекцию с чувствительностью около 99%. С другой стороны, тяжелые клинические проявления заболевания у этой категории больных легко распознаются. У пациентов, начавших лечение в ранних стадиях ВИЧ-инфекции, может в редких случаях возникать серореверсия со снижением титра АТ ниже порога определения в наборе ИФА. В этих ситуациях серореверсия объясняется снижением гуморального ответа на фоне уменьшения вирусной нагрузки.

1 2 3 4 5 6