Учреждение образования полесский государственный университет в. Т. Чещевик молекулярные основы
 Скачать 1.26 Mb.
|
|
Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 1 УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ В.Т. ЧЕЩЕВИК Молекулярные основы онтогенеза специальность 1-31 01 01 Биология (по направлениям) Пояснительная записка Конспект лекций Литература Вопросы к экзамену Учебная программа дисциплины Пинск ПолесГУ 2019 Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 2 ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Учебно-методический комплекс ”Молекулярные основы онтогенеза“ представляет собой целостную совокупность разновидностей учебных материалов, необходимых для проведения всех видов занятий по данной дисциплине, являющейся базовой дисциплиной специального цикла образовательной программы для подготовки студентов I ступени высшего образования по специальности 1-31 01 01 Биология (по направлениям). Цель дисциплины – формирование у студентов знаний о молекулярно- клеточных механизмах формирования из оплодотворенной яйцеклетки многоклеточного организма, состоящего из разнообразных типов специализированных клеток, механизмах регуляции пролиферации клеток, их дифференцировки и морфогенеза – образование надклеточных структур, включая избирательные межклеточные взаимодействия и миграцию клеток, образование тканей и надтканевых систем. Основными задачами курса являются: - сформировать современное представление о достижениях экспериментальной биологии развития на базе молекулярно-биологических исследований; - исследовать возникающие на различных этапах индивидуального развития организма взаимосвязи в экспрессии различных генов; - обеспечить понимание студентом прикладных аспектов использования знаний о молекулярных механизмах индивидуального развития организма в своей профессиональной деятельности. В разделе ”Введение“ рассмотрены предмет и задачи молекулярной биологии онтогенеза, терминологическая база дисциплины, методы, используемые в изучении молекулярных аспектов развития, основные модельные объекты и организмы. В разделе ”Дифференциальная экспрессия генов как основа индивидуального развития организма“ рассмотрены основные механизмы избирательной экспрессии генов во времени и пространстве, уровни регуляции, транскрипционные факторы. В разделе ”Избирательные взаимодействия клеток“ рассмотрены вопросы межклеточного сигналинга с участием ауто-, юкста- и паракринных факторов, роль межклеточного матрикса, адгезионных молекул клеточной поверхности и щелевых контактов в онтогенезе, миграция клеток в период эмбрионального развития. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 3 В разделе ”Молекулярные основы гаметогенеза и оплодотворения“ охарактеризованы основные пути и молекулярно-биологические механизмы гаметогенеза, оплодотворения и детерминации пола. В разделе ”Ооплазматическая сегрегация как фактор, определяющий судьбу зародыша на ранних стадиях развития“ охарактеризована роль ооплазматической полярности для формирования общего плана строения организма, особенности клеточного цикла в период дробления. В разделе ”Молекулярные механизмы контроля раннего развития дрозофилы“ описаны молекулярно-биологические механизмы и сигнальные каскады формирования передне-задней и дорсо-вентральной осей у зародыша дрозофилы, роль градиентов сигнальных белков. В разделе ”Становление общего плана строения в раннем развитии позвоночных животных“ рассмотрены вопросы молекулярно-биологических механизмов гаструляции позвоночных животных, становление передне-задней и дорсо-вентральной осей, понятия организатора и эмбриональной индукции. В разделе ”Нейрогенез“ охарактеризованы молекулярно-биологические механизмы формирования центральной и периферической нервной системы, отдельных типов нервных клеток, дорсовентральной и передне-задней спецификации нервной трубки. В разделе ”Мезодерма и ее производные“ рассмотрены механизмы эпителиально-мезенхимной трансформации и миграции клеток при формировании тканей и органов мезодермального происхождения, молекулярные механизмы сомитогенеза, миогенеза, кардиогенеза, нефрогенеза. В разделе ”Органогенез“ представлены механизмы закладки и развития конечностей у высших позвоночных животных. В разделе ”Молекулярные основы апоптоза и старения“ отражены вопросы апоптоза и некроза, пути индукции и сигнальные каскады, представлены современные теории старения организма, рассматриваемые с молекулярно-биологических позиций. В разделе ”Роль нейроэндокринной регуляции в онтогенезе“ рассмотрены механизмы действия основных классов гормонов, участвующих в регуляции жизнедеятельности организма и адаптации его к условиям окружающей среды, медиаторы, факторы роста, цитокины. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 4 ЛЕКЦИИ 1. Введение в дисциплину ”Молекулярные основы онтогенеза“ 1. Предмет и задачи дисциплины. 2. Определение онтогенеза и его основные характеристики. 3. Методы исследования молекулярных механизмов индивидуального развития организма. Модельные объекты. 2. Регуляция активности генов на уровне инициации транскрипции 1. Цис-элементы промоторов и трансрегуляторные факторы транскрипции. Общие и специальные транскрипционные факторы. 2. ДНК-белковые и белок-белковые взаимодействия. Гиперчувствительные сайты ДНК. 3. Доменная структура факторов транскрипции, важных для раннего развития животных: гомеобокс (helix - turn - helix), bacis HLH. 4. Роль метилирования ДНК в регуляции экспрессии генов. Влияние 5- азацитидина на дифференцировку клеток in vitro. 3. Регуляция активности генов на посттранскрипционном и претрансляционном уровне 1. Процесс созревания РНК: кэпирование, полиаденилирование, сплайсинг. 2. Регуляция транспорта из ядра в цитоплазму. Хранение запасенной мРНК в цитоплазме (гены «материнского эффекта»). 4. Избирательные взаимодействия клеток 1. Межклеточный сигналинг и трансдукция сигналов при взаимодействии клеток друг с другом и с внеклеточным матриксом. 2. Адгезионные молекулы клеточной поверхности и щелевые контакты. 3. Избирательные взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом и молекулы субстратной адгезии. 4. Миграция клеток как результат избирательных взаимодействий. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 5 5. Молекулярные основы гаметогенеза 1. Общая характеристика гаметогенеза. 2. Сперматогенез. 3. Оогенез. Метафазный блок мейоза. 6. Молекулярные основы оплодотворения и определения пола 1. Оплодотворение и его биологические значение. 2. Детерминация пола у дрозофилы. 3. Детерминация пола у Млекопитающих. 7. Ооплазматическая сегрегация как фактор, определяющий судьбу зародыша на ранних стадиях развития 1. Понятие ооплазматической сегрегации и ее роль в формировании общего плана строения организма. 2. Биологическая функция дробления. Точка перехода на средней бластуле и гипотеза истощения репрессора. 3. Особенности клеточного цикла в период дробления. Роль MPF-фактора и циклинов. 8. Молекулярные механизмы контроля раннего развития дрозофилы. Пространственная организация эмбриона 1. Жизненный цикл дрозофилы. 2. Формирование передне-задней оси зародыша дрозофилы. Градиенты белков Bicoid и Nanos, гены терминальных структур. 3. Формирование дорсо-вентральной оси зародыша дрозофилы. 9. Молекулярные механизмы контроля раннего развития дрозофилы. Регуляция сегментации 1. Гены сегментации (gap-гены, pair-rule-гены и segment-polarity-гены) и парасегменты. 2. Гомеозисные гены, гомеобоксы. Кластерная организация гомеозисных генов. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 6 10. Гаструляция и эмбриональная индукция 1. Представление о гаструляции как о морфогенетических перемещениях клеток и клеточных пластов. 2. Гаструляция у млекопитающих. 3. Сущность явления и история открытия эмбриональной индукции и организатора. 11. Пространственная организация эмбриона позвоночных животных 1. Становление дорсо-вентральной оси зародыша амфибий. Роль белковых факторов Wnt и TGFβ в становлении дорсо-вентральной оси зародыша амфибий. Центр Ньюкупа. 2. Становление лево-правой асимметрии. 12. Молекулярно-биологические механизмы нейрогенеза 1. Нейруляция. 2. Молекулярные механизмы спецификации нейроэктодермы. 3. Молекулярные механизмы дорсо-вентральной спецификации нервной трубки. 4. Молекулярные механизмы передне-задней спецификации нервной трубки. Дифференцировка нейроэпителиальных клеток на нейральные и глиальные клетки. 13. Молекулярно-биологические механизмы развития нервного гребня 1. Нервный гребень: образование, производные. 2. Молекулярные механизмы миграции клеток нервного гребня. 14. Молекулярно-биологические механизмы формирования и развития мезодермы у позвоночных 1. Общая характеристика и развитие мезодермы. 2. Эпителиально-мезенхимные взаимодействия и миграция клеток при формировании мезодермы. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 7 15. Молекулярно-биологические механизмы сомитогенеза у позвоночных 1. Общая характеристика сомитогенеза. 2. «Молекулярные часы» сомитогенеза. 16. Миогенез, формирование почки и сердца в эмбриональный период развития 1. Молекулярные механизмы миогенеза. 2. Механизм формирования почки. 3. Молекулярные механизмы закладки и образования сердца. 17. Органогенез 1. Развитие конечностей у высших позвоночных. 2. Морфогенетическое поле конечности. Гомеозисные гены, принимающие участие в формировании передне-задней оси конечности. Роль фактора роста фибробластов FGF10. 3. Почка конечности. Области формирования трехмерной структуры конечности. Роль апоптоза. 18. Молекулярные основы апоптоза 1. Сущность явления апоптоза – программируемой клеточной гибели, отличия апоптоза и некроза. 2. Механизмы активации процесса (рецептор-опосредованный и митохондриальный пути развития клеточной гибели), основные участники процесса. 3. Роль апоптоза в развитии и в физиологических процессах во взрослом организме. 19. Современные теории старения организма 1. Теория соматических мутаций. 2. Теория накопления измененных белков. 3. Митохондриальная теория. 4. Теломерная теория. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 8 5. Эпигенетическая теория. 6. Теория системных и сетевых механизмов. 20. Гормоны и гормоноподобные соединения в онтогенезе 1. Основные классы гормонов. 2. Механизмы действия гормонов. 3. Нейромедиаторы. 4. Цитокины. 5. Факторы роста. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 9 ТЕМА 1 ВВЕДЕНИЕ В ДИСЦИПЛИНУ ”МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ОНТОГЕНЕЗА“ 1. Предмет и задачи дисциплины. 2. Определение онтогенеза и его основные характеристики. 3. Методы исследования молекулярных механизмов индивидуального развития организма. Модельные объекты. 1. Предмет и задачи дисциплины Изучением молекулярных механизмов онтогенеза занимается наука генетика развития. Данная наука возникла на стыке эмбриологии, биохимии, молекулярной биологии, генетики, цитологии, генной инженерии. Предмет дисциплины: молекулярно-клеточные механизмы, лежащие в основе индивидуального развития организма; пролиферация клеток, их дифференцировка и морфогенез; формирование тканей, надтканевых систем и многоклеточного организма из оплодотворенной яйцеклетки; механизмы контроля и поддержания стабильной целостности многоклеточного организма и его взаимоотношений с окружающей средой в период онтогенеза. Задача дисциплины – сформировать представление об индивидуальном развитии организма на базе молекулярно-биологических исследований. Этапы становления генетики развития: 1. Описательный (начало ХХ века): гистологическое сравнение и выявление стадий, на которых возникают различия в развитии нормальных и мутантных эмбрионов. 2. Экспериментальный (30-40-е годы ХХ века): выявление закономерностей генетического контроля индивидуального развития организма. 3. Биохимический (40-60-е годы ХХ века): установление роли избирательного накопления РНК и белков в развитии эмбриона и выявление дифференциальной активности генов на различных стадиях онтогенеза и в разных тканях. 4. Молекулярно-генетический (с 60-х годов ХХ века и по настоящее время): открытие генетических регуляторных систем, контролирующих экспрессию генов на различных стадиях онтогенеза. Принципы генетики развития: 1. Принцип дифференциальной активности генов как основы регионализации Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 10 развития организма. 2. Принцип ведущей роли ядерно-цитоплазматических отношений в регионализации эмбриона. 3. Взаимодействие генов в процессе онтогенеза. 2. Определение онтогенеза и его основные характеристики Онтогенез (от греч. on (ontos) — сущее + генез (Э. Геккель, 1866) – индивидуальное развитие организма, совокупность последовательных морфологических, физиологических и биохимических преобразований, претерпеваемых организмом от момента его зарождения до конца жизни. Онтогенез включает две группы процессов: морфогенез и репродукцию. В результате морфогенеза формируется репродуктивно зрелая особь. Онтогенез включает рост (увеличение массы тела, его размеров) и дифференцировку, заключающуюся в возникновении различий между однородными клетками и тканями, их изменения в ходе развития, приводящие к специализации. У животных и растений, размножающихся половым путем, зарождение нового организма осуществляется в процессе оплодотворения, а онтогенез начинается с оплодотворенной яйцеклетки, или зиготы. У организмов, которым свойственно бесполое размножение, онтогенез начинается с образования нового организма путем деления материнского тела или специализированной клетки, почкования, а также из корневища, клубня, луковицы и т. п. В ходе онтогенеза каждый организм закономерно проходит последовательные фазы развития: зародышевый (эмбриональный, или пренатальный) послезародышевый (постэмбриональный, или постнатальный) период развития взрослого организма. Онтогенез характеризуется устойчивостью – гомеорезом, который представляет собой процесс реализации генетической программы строения, развития и функционирования организма. В основе онтогенеза лежит сложный процесс реализации на разных стадиях развития организма наследственной информации, заложенной в каждой из его клеток в виде генов. Большинство генов (структурные гены) кодируют первичную структуру белков. Генетическая программа онтогенеза осуществляется под влиянием многих факторов: условия внешней среды, межклеточные и межтканевые взаимодействия, гуморально-гормональные и нервные регуляции и т. д. и выражается во взаимосвязанных процессах размножения клеток, их роста и дифференцировки. В процессе взаимодействия особей с окружающей средой Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 11 осуществляется отбор организмов, наиболее приспособленных в силу их наследуемых свойств. Основные атрибуты онтогенеза: 1. Исходная запрограммированность процессов. Наличие уникальной неизменной генетической программы развития, сформированной вследствие мейоза и оплодотворения. 2. Необратимость онтогенеза. При реализации генетической программы невозможен возврат к предыдущим стадиям. 3. Углубление специализации: по мере развития уменьшается вероятность смены траектории онтогенеза. 4. Адаптивный характер: поливариантность онтогенеза обеспечивает возможность приспособления к различным условиям. 5. Неравномерность темпов: скорость процессов роста и развития изменяется. 6. Целостность и преемственность отдельных этапов. Признаки, появляющиеся на более поздних стадиях, базируются на признаках, проявляющихся на ранних стадиях. 7. Наличие цикличности: существует цикличность старения и омоложения. 8. Наличие критических периодов, связанных с выбором пути в узловых точках (точках бифуркации) или преодолением энергетических порогов. Онтогенез характеризуется автономизацией и эмбрионизацией. Автономизация онтогенеза – это процесс повышения независимости онтогенеза от условий внешней среды: экзогенные факторы развития замещаются эндогенными. Автономизация онтогенеза базируется на системе корреляций и координаций. Корреляции – это взаимозависимости между частями развивающегося организма, которые обеспечивают его устойчивое развитие. Типы онтогенетических корреляций: 1. Геномные – обусловливают целостность генотипа. Достигаются с помощью диплоидности, доминирования, плейотропного действия генов и наличия полигенных систем с участием генов-модификаторов. 2. Морфогенетические – обусловлены эмбриональной индукцией и нейрогуморальной регуляцией целостности организма. 3. Эргонтические – фенотипические корреляции, обусловленные взаимозависимостью между функциями органов. Координации – это согласованные изменения между частями организма с точки зрения филогенеза. Координации обеспечивают формирование Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 12 адаптивных комплексов. Типы филогенетических координаций: 1. Биологические координации – адаптивный ответ на изменения среды. Биологические координации устанавливаются через функциональную деятельность организма (например, удлинение тела и редукция конечностей у змей, змееобразных ящериц и амфибий). 2. Динамические координации – координации между взаимосвязанными органами. Например, у млекопитающих хорошо развиты и орган обоняния, и обонятельные доли переднего мозга. 3. Топографические координации – выражаются в закономерных изменениях пространственных соотношений между органами, не связанными непосредственной функциональной зависимостью. Эмбрионизация онтогенеза – это возникновение в ходе эволюции способности проходить значительную часть зародышевого развития под защитой материнского организма или зародышевых оболочек. У животных эмбрионизация онтогенеза выражается в переходе к яйцекладному и внутриутробному типам онтогенеза, у растений может выражаться в редукции гаметофита, формировании семени с семенной кожурой и запасом питательных веществ в виде эндосперма и/или специализированных семядолей и формировании плода (ароморфоз) и плодоподобных структур (идиоадаптации). 3. Методы исследования молекулярных механизмов индивидуального развития организма. Модельные объекты Классические методы экспериментальной эмбриологии: 1. Методы микрохирургии эмбриона (начало XX века, Г. Шпеман): снятие оболочек яиц животных, пересадка частей одного эмбриона к другому. Данные методы используются для изучения последствий разрушения частей эмбриона или его отдельных клеток в онтогенезе организма и выявления путей миграции клеток и источников развития тканей. 2. Метод эксплантации – иссечение небольшого участка эмбриона и выращивание его на искусственной среде. С помощью этого метода можно получать информацию об источниках развития тканей из данного участка зародыша и выявлять гистогенетические закономерности развития. 3. Метод трансплантации ядер – метод, позволяющий клонировать зародышей. 4. Метод прижизненного наблюдения – метод, позволяющий прослеживать перемещение эмбрионального материала (морфогенетические движения) при Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 13 помощи меток, наносимых на зародыш прижизненными красителями. Современные методы: 1. Методы переноса генов и их частей: а) метод микроинъекций – генетическую конструкцию вносят в зиготу при помощи микропипетки, закрепленной в держателе микроманипулятора. б) метод электропорации – метод основан на способности клеточной мембраны, становиться проницаемой для экзогенных молекул ДНК под действием импульсов высокого напряжения. Размер пор зависит от длины импульсов, силы электрического поля, а также ионного состава среды. в) метод биобаллистической трансформации – на частички вольфрама, платины или золота (размер: 0,1 – 3,5 мкм) напыляется векторная ДНК, содержащая необходимую для трансформации генную конструкцию. Вольфрамовые, платиновые или золотые частички, несущие ДНК, на целлофановой подложке помещаются внутрь биобаллистической пушки. Суспензия эмбрионов на ранней стадии развития помещается под биобаллистическую пушку, в которой вакуумным насосом уменьшается атмосферное давление, что приводит к выбрасыванию частичек металла с огромной скоростью из пушки, которые, пробивая мембраны, входят в цитоплазму и ядра клеток. Располагающиеся непосредственно по центру клетки погибают, а по периметру будут находиться трансформированные клетки. Далее эмбрионы переносят на среду для дальнейшего культивирования. г) метод липофекции – данный метод основан на взаимодействии между положительно заряженными молекулами фосфолипидов, из которых состоят липосомы, и отрицательно заряженными молекулами ДНК. Липосомы, несущие положительный заряд, легко присоединяются к несущей отрицательный заряд плазматической мембране животных клеток, после чего путем эндоцитоза проникают в цитоплазму клеток. д) метод трансформации при помощи сперматозоидов – можно разделить трансформацию при помощи сперматозоидов на два типа: естественную и искусственную. Под естественной трансформацией понимают непосредственную инкубацию чужеродной ДНК со спермиями, в этом случае происходит спонтанное поглощение ДНК сперматозоидами и накопление данной ДНК на поверхности мембран сперматозоидов. При искусственной трансформации применяют различные способы инкорпорирования чужеродной ДНК в мужские гаметы: липофекция, использование диметилсульфоксида. е) метод трансформации с помощью агробактерий – активно используется для получения генетически модифицированных растений. Также показана возможность использования этого метода при получении трансгенных морских Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 14 беспозвоночных животных, в частности, морских ежей, для которых продемонстрировано содержание ряда генов, которые встречаются только у агробактерий. Процедура трансформаци заключается в добавлении к эмбриональным клеткам морских ежей суспензии агробактерий, которые далее культивируют 1–2 суток и спустя 1–2 недели определяют экспрессию перенесенных генов. 2. Методы «выключения» генов: а) Нокдаун генов – метод, позволяющий снизить экспрессию одного или нескольких генов при помощи изменения соответствующей последовательности нуклеотидов, либо при помощи короткого олигонуклеотида, комплементарного соответствующей молекуле мРНК. В случае, когда изменяется последовательность гена, организм называют нокаутным по данному гену. В случае использования коротких олигонуклеотидов, комплементарных соответствующим мРНК или связывающимися с последовательностью нуклеотидов в ДНК, нокдаун гена приводит к временному изменению параметров экспрессии гена, без внесения изменений в структуру хромосом и последовательности ДНК гена. Кратковременный нокдаун генов используют в биологии развития, так как олигонуклеотиды легко могут быть введены в зиготу и будут попадать во все дочерние клетки в ходе эмбрионального развития. б) РНК-интерференция (англ. RNA interference, RNAi) — процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК при помощи малых молекул РНК. Процессы РНК-интерференции обнаружены в клетках многих эукариот: у животных, растений и грибов. Система РНК-интерференции играет важную роль в защите клеток от вирусов, паразитирующих генов (транспозонов), а также в регуляции развития, дифференцировки и экспрессии генов организма. Процесс РНК-интерференции начинается с действия фермента Dicer, который разрезает длинные молекулы двуцепочечной РНК (dsRNA) на короткие фрагменты размером 21–25 нуклеотидов, называемые siRNA. Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют «направляющей», эта одноцепочечная РНК далее включается в состав РНК-белкового комплекса RISC. В результате активности RISC одноцепочечный фрагмент РНК соединяется с комплементарной последовательностью молекулы мРНК и вызывает разрезание мРНК белком Argonaute (Argo) либо ингибирование трансляции и/или деаденилирования мРНК. Эти события приводят к подавлению экспрессии (сайленсингу) соответствующего гена, эффективность которого ограничена концентрациями молекул малых РНК. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 15 Селективный эффект РНК-интерференции на экспрессию генов делает RNAi полезным инструментом для исследований с использованием культур клеток и живых организмов, так как синтетические двуцепочечные РНК, введённые в клетки, вызывают супрессию специфических генов. RNAi используется для крупномасштабных исследований в области молекулярной биологии, биохимии, биотехнологии и медицины. 3. Методы культивирования эмбриональных клеток и тканей и их маркировка. В настоящее время созданы соответствующие питательные среды и разработаны технологии для длительного поддержания жизнеспособности эмбриональных клеток, в частности, стволовых клеток, в культуре. Применение антител или олигонуклеотидов, конъюгированных с флуоресцентными зондами, позволяет осуществлять прижизненный мониторинг распределения инструкционных молекул мРНК и белков в эмбриональных клетках, а также миграции эмбриональных клеток в развивающемя организме эмбриона. К основным модельным объектам, используемым в исследовании молекулярно-генетических механизмов онтогенеза, используют эмбрионы низших беспозвоночных животных, насекомых (в частности, Drosophila melanogaster), амфибий, птиц, лабораторных мышей. Применение таких разнообразных групп организмов в качестве модельных объектов обусловлено значительным сходством основных этапов их онтогенеза. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 16 |