1. Форми життя клітинна та неклітинна
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
Біохімічні методи Біохімічні методи спрямовані на виявлення біохімічного фенотипу організму. Вперше біохімічні методи почали застосовувати для діагностики генних хвороб ще на початку XX сторіччя. За останні роки їх широко використовують для пошуку нових мутантних алелів. За їхньою допомогою описано понад 1000 спадковиих хвороб обміну речовин. Для більшості з них виявлений дефект первинного генного продукту. Найбільш поширеними серед таких захворювань є хвороби, пов'язані з дефектом ферментів, структурних, транспортних або інших білків. Дефекти ферментів установлюють шляхом визначення вмісту в крові і сечі продуктів метаболізму, що є результатом функціонування даного білка. Дефіцит кінцевого продукту, що супроводжується накопиченням проміжних і побічних речовин порушеного метаболізму, свідчить про дефект ферменту або його дефіцит в організмі. Об'єктами біохімічної діагностики є сеча, піт, плазма і сироватка крові, формені елементи крові, культури клітин (фібробласти і лімфоцити). Програми первинної біохімічної діагностики спадкових хвороб можуть бути масовими і селективними. Відомі масові просіюючі програми для діагностики фенілкетонурії, спадкового гіпотиреозу і та ін. Наприклад, біологічним матеріалом для скринінг-діагностики фенілкетонурії є висушені плями капілярної крові новонароджених на хроматографічному папері. У плямах крові визначають кількість фенілаланіну за допомогою одного із методів: мікробіологічний тест Гатрі, флуориметрія, роздільна хроматографія на папері, тонкошарова хроматографія. Селективні діагностичні програми передбачають перевірку біохімічних аномалій обміну (сеча, кров) у пацієнтів з підозрою на генні спадкові хвороби. У селективних програмах використовуються прості якісні реакції (тест із хлоридом заліза для виявлення фенілкетонурії). Наприклад, за допомогою тонкошарової хроматографії сечі і крові діагностують спадкові порушення обміну амінокислот, глікозаміногліканів. Газова хроматографія застосовується для виявлення спадкових хвороб обміну органічних кислот. Шляхом електрофорезу гемоглобінів діагностуються гемоглобінопатії. Біохімічна діагностика спадкових порушень обміну включає два етапи. На першому етапі відбирають ймовірні випадки захворювань, на другому більш точними і складними методами уточнюють діагноз захворювання. Для визначення в крові, сечі або амніотичній рідині проміжних, побічних і кінцевих продуктів обміну, крім якісних реакцій із специфічними реактивами на певні речовини, використовують хроматографічні методи дослідження амінокислот та інших органічних речовин. Показаннями для застосування біохімічних методів діагностики новонароджених є такі симптоми: судоми, кома, блювота, гіпотонія, жовтяниця, специфічний запах сечі і поту, ацидоз, припинення росту. У дітей біохімічні методи використовуються у випадках підозри на спадкові хвороби обміну речовин (затримка фізичного і розумового розвитку, втрата набутих функцій, специфічна для будь-якої спадкової хвороби клінічна картина). Порушення первинних продуктів генів виявляють за допомогою біохімічних методів, а локалізацію відповідних ушкоджень у спадковому матеріалі - за допомогою методів молекулярної генетики. 45. Методи вивчення спадковості людини: цитогенетичні, молекулярно-генетичні (ДНК-аналіз). Генетичні маркери. Молекулярно-генетичні методи Це різноманітна група методів, що застосовуються для виявлення варіацій у структурі досліджуваної ділянки ДНК, а також для розшифровування первинної послідовності основ. Ці методи ґрунтуються на "маніпуляціях" з ДНК і РНК. Основні етапи молекулярно-генетичних методів: 1. Отримання зразків ДНК або РНК - вихідній етап всіх методів. Джерелом геномної ДНК є будь-які клітини, що мають ядро. Частіше використовують периферійну кров (лейкоцити), хоріон, амніотичні клітини, культури фібробластів. Основне завдання - накопичення необхідної кількості певних фрагментів ДНК. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це метод ампліфікації ДНК за умов in vitro. Відповідне до нуклеотидної послідовності кінців досліджуваної ділянки застосовують два олігонуклеотидних праймери (приманки). Довжина праймерів 20-30 нуклеотидів. Процес ампліфікації полягає у здійсненні повторюваних циклів. 2. Рестрикція ДНК на фрагменти за допомогою рестриктаз. Основна їх властивість - розривати дволанцюгову ДНК у визначених послідовностях нуклеотидів. Рестриктази - ферменти, виділені з бактеріальних клітин, розрізають молекулу ДНК на фрагменти у визначених місцях. Застосування цих ферментів дає можливість одержати досить короткі фрагменти ДНК, в яких легко можна визначити послідовність нуклеотидів. Розробка методу зворотної транскрипції ДНК на молекулах мРНК визначених білків з наступним клонуванням цих ДНК призвела до появи ДНК-зондів. Використання таких зондів для гібридизації з ДНК-клітин пацієнта дає можливість точно локалізувати генну мутацію. 3. Електрофорез фрагментів ДНК. Кожен фрагмент ДНК займає певне місце у вигляді дискретної смуги в конкретному місці геля. 4. Візуалізація та ідентифікація фрагментів ДНК у гелі. Розроблено й інші методи виявлення специфічних фрагментів ДНК за допомогою блот-гібридизації за Саузерном. Цитогенетичний метод, його значення Цитогенетичний аналіз дозволяє записувати діагноз спадкового захворювання у вигляді каріотипічної формули. Цитогенетичний метод (метод хромосомного аналізу) ґрунтується на мікроскопічному дослідженні структури і кількості хромосом. У 1956 р. шведські вчені Дж. Тийо і А. Леван вперше довели, що у людини 46 хромосом. Цитогенетичний метод використовують для: • вивчення каріотипів організмів; • уточнення числа хромосомних наборів, кількості і морфології хромосом для діагностики хромосомних хвороб; • складання карт хромосом; • для вивчення геномного і хромосомного мутаційного процесу; • вивчення хромосомного поліморфізму в людських популяціях. Хромосомний набір людини містить велику кількість хромосом, основні відомості про які можна отримати при вивченні їх в метафазі мітозу і профазі - метафазі мейозу. Клітини людини для прямого хромосомного аналізу отримують шляхом пункції кісткового мозку і біопсії гонад, або непрямим методом - шляхом культивування клітин периферичної крові (лімфоцити), коли отримують значну кількість метафаз. Непрямим методом досліджують також клітини амніотичної рідини або фібробласти, отримані при амніоцентезі або біопсії хоріона, клітини абортусів, мертвонароджених та ін. Частіше досліджують хромосоми в лімфоцитах периферичної гепаринізованої крові. Для стимуляції мітозу додають фітогемаглютинін, а для зупинки мітозу - колхіцин. Препарат забарвлюють ядерними барвниками: 2 % розчином ацеторсеїну, азуреозином, барвником Унна, розчином Гімза та ін. Накривають покривним скельцем, видаляють надлишок барвника фільтрувальним папером, розглядають під мікроскопом з масляною імерсією. Останнім часом всі дослідження в цитогенетиці людини проводять із застосуванням методів диференційного забарвлення хромосом, які дозволяють відрізнити кожну хромосомну пару. Існує декілька способів забарвлення: Q, G, С, R. У вирішенні питань діагностики хромосомних хвороб різні методи диференційного забарвлення застосовують у комбінації. Завдяки диференційному забарвленню хромосом можна виявити незначні хромосомні поламки: невеликі делеції, транслокації та ін. Отримавши мікропрепарат, вивчають його візуально та складають ідіограму каріотипу, тобто впорядковане розміщення кожної пари хромосом за індивідуальними ознаками відмінностей: загальна довжина хромосоми, форма, розташування центромери. Більшість хромосом за таким методом можна тільки віднести до певних груп згідно з Денверською класифікацією. Цей метод дозволяє діагностувати багато спадкових хвороб, вивчати мутаційний процес, складні перебудови і найменші хромосомні аномалії у клітинах, які вступили у фазу поділу та поза поділом. На хромосомний аналіз направляються пацієнти з множинними уродженими вадами розвитку, діти з затримкою фізичного і психомоторного розвитку, пацієнти з недиференційованими формами олігофренії (недоумства), з порушенням статевого диференціювання, жінки з порушенням менструального циклу (первинна або вторинна аменорея), сім'ї з безпліддям, жінки зі звичним невиношуванням вагітності (викидні, мертвонароджені). Генетичні маркери Для діагностики спадкових та інфекційних захворювань на рівні ДНК використовують різні методи, зокрема ДНК-зонди (маркери). ДНК-зонд - це ділянка ДНК довжиною від 10 до 6000 пар нуклеотидів, у якій послідовність основ комплементарна послідовності досліджуваної ділянки ДНК (гена, що зумовлює захворювання, або гена вірусу, бактерії). Технологія ДНК-зондів вимагає знання нуклеотидної послідовності гена, що досліджується. Для локалізації гена зонди, що містять радіоактивні або флуоресцентні мітки, вносяться у ДНК-зразки, що містять біологічний матеріал, отриманий від хворого. За наявності в ДНК комплементарної послідовності зонд приєднується до неї і його можна визначити, вимірюючи радіоактивність або флуоресценцію. Розміри фрагментів ДНК, до яких приєднався зонд, визначають за допомогою методики, що отримала назву блотинг, розроблена американським вченим Саузерном. За допомогою ДНК-зондів ідентифіковані деякі гени людини. Вони використовуються також для діагностики інфекційних захворювань внаслідок визначення послідовності ДНК, унікальної для кожної бактерії або віруса, наприклад, віруса гепатиту В - дуже тяжкого і поширеного захворювання людини. Послідовність нуклеотидів ДНК цього вірусу розшифрована. На даний час випускаються готові діагностичні набори, що містять одноланцюгову ДНК, мічену флуоресцентним барвником, комплементарну одному з ланцюгів вірусної ДНК. Таку одноланцюгову ДНК додають до зразка крові хворого з симптомами гепатиту В. Пробу крові нагрівають для поділу ДНК вірусу на окремі ланцюги. ДНК-зонд приєднується до комплементарного ланцюга ДНК вірусу і відновлює подвійний ланцюг ДНК. Флуоресціюючі ДНК можна побачити, знявши на фотоплівку. Одним із важливих досягнень в області ДНК- технологій є розробка полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Використовуючи ПЛР, можна синтезувати мільйони копій одного гена або будь-яких специфічній ділянок ДНК у пробірці впродовж короткого часу ПЛР отримала свою назву від ДНК-полімерази, ферменту, що сприяє реплікації ДНК у клітині. Реакція ланцюгова, тому що полімераза буде відтворювати реплікацію кожної копії ДНК, що утворилася, нескінченну кількість разів. Для проведення ПЛР необхідні праймери - короткі послідовності з 20 нуклеотидів, комплементарні нуклеотидам на обох кінцях ділянки ДНК-мішені Праймери необхідні для початку процесу реплікації що буде продовжений ДНК-полімеразою. Варто зазначити, що для аналізу кожної ділянки ДНК застосовуються свої специфічні праймери. Це дало можливість значно вдосконалити і прискорити діагностику багатьох інфекційних захворювань, зробити більш доступними генетичні дослідження у медичній практиці. 46. Методи вивчення спадковості людини: дерматогліфіка, популяційно-статистичні, гібридизації соматичних клітин. Метод гібридизації соматичних клітин Соматичні клітини містять увесь об'єм генетичної інформації. Це дає можливість вивчати багато питань генетики людини, які неможливо досліджувати на цілому організмі. Соматичні клітини людини отримують із різних органів (шкіра, кістковий мозок, клітини крові, тканини ембріонів). Найчастіше використовують клітини сполучної тканини (фібробласти) і лімфоцити крові. Культивування клітин поза організмом дозволяє отримувати достатню кількість матеріалу для дослідження, який не завжди можна взяти в людини без шкоди для здоров'я. Клітини культури тканини можна використовувати для вивчення різними методами: цитологічним, біохімічним, імунологічним тощо. Таке дослідження може бути у ряді випадків більш точним, ніж на рівні цілісного організму, бо метаболічні процеси вдається виділити із складного ланцюга взаємопов'язаних реакцій, які відбуваються в організмі. Гібридизація соматичних клітин проводиться в широких межах не тільки між різними видами, але й типами: людина і миша, людина і комар, муха і курка тощо. Залежно від мети аналізу, дослідження проводять на гетерокаріонних або синкаріонних клітинах. Синкаріони зазвичай вдається отримати при гібридизації у межах класу. Це справжні гібридні клітини, бо в них відбулося поєднання двох геномів. Наприклад, гібридні клітини людини і миші мають 43 пари хромосом: 23 - від людини і 20 - від миші. Згодом, при розмноженні цих клітин частка вихідних геномів різна. Відбувається поступова елімінація хромосом того організму, клітини якого мають повільніший темп розмноження. За допомогою цього методу проводиться картування хромосом у людини. Використання методу гібридизації соматичних клітин дає можливість вивчати механізми первинної дії і взаємодію генів. Культури соматичних клітин використовуються для визначення мутагенної дії факторів навколишнього середовища. Розширюються можливості точної діагностики хвороб на біохімічному рівні у дорослих і до народження у плодів (пренатальна діагностика). Для подальшого удосконалення цих методів необхідно нагромаджувати лінії клітин з генними і хромосомними мутаціями. Вже організовані "банки" клітинних ліній. Метод дерматогліфіки Дерматогліфіка - наука, що вивчає спадкову обумовленість малюнку, який утворюють лінії шкіри на кінчиках пальців, долонях і підошвах людини. Дерматогліфіка поділяється на: дактилоскопію - вивчення малюнка пальців; пальмоскопію — вивчення особливостей будови долонь; плантоскопію - вивчення особливостей будови підошов. Встановлено, що візерунки є індивідуальною характеристикою людини і не змінюються впродовж життя. Дерматогліфічні дослідження мають важливе значення у визначенні зиготності близнюків, у діагностиці багатьох спадкових захворювань, а також в окремих випадках спірного батьківства. Долонний рельєф дуже складний. У ньому виділяють багато полів, подушечок і долонних ліній. Подушечок на долоні 11 і їх поділяють на три групи: 1. П'ять кінцевих (апікальних) подушечок на кінцевих фалангах пальців. 2. Чотири міжпальцеві подушечки розміщуються навпроти міжпальцевих проміжків. 3. Дві долонні проксимальні подушечки - тенар і гіпотенар. Долоня дистально обмежена п'ястково-фаланговими згинальними складками, а проксимально — зап'ястковою, або браслетною, згинальними складками. Як на долонях, так і на пальцевих подушечках шкірні гребінці розміщені потоками. Точки зустрічі цих потоків утворюють трирадіуси, або дельти. На кожній із 4 міжпальцевих подушечок звичайно є трирадіуси, їх позначають малими літерами латинського алфавіту (a, Ь, c, d), починаючи від вказівного пальця (а) і закінчуючи мізинцем (d). Поблизу браслетної складки розташований головний (осьовий) долонний трирадіус t. Якщо провести лінії від трирадіусів а і d до t, то утворюється кут долоні < atd, який в нормі не перевищує 57° Гребінчасті візерунки зазвичай вивчають під лупою. Як на кінчиках пальців, так і на долонних підвищеннях можуть спостерігатися різноманітні папілярні візерунки у вигляді завитків, петель і дуг, відкритих в ульнарний або радіальний бік. Те ж саме спостерігається на тенарі й гіпотенарі. Проте тут частіше бувають дуги. На середній і головній фалангах пальців гребінчасті лінії знаходяться поперек пальців, створюючи різноманітні візерунки - прямі, серпоподібні, хвилеподібні, дугоподібні - і сполучення. Більша кількість праць присвячена вивченню візерунків на кінчиках пальців. Ф. Гальтон виділив три форми папілярних візерунків: завитки, петлі і дуги. їх позначають відповідно: W; L; А. Петлі бувають відкриті як в ульнарний, так і в радіальний бік. Їх напрямок позначають першою літерою цих слів. Символом U позначають петлю, відкриту в ульнарний бік, символом R - петлю, відкриту в радіальний бік. Виділяють чотири головних пальцевих папілярних візерунки - W; R; U; А. У дугах потоки гребінчастих ліній не перетинаються. Отже, в дузі немає трирадіуса, або дельти. У петлі є одна дельта, а в завитку дві дельти. Загальноприйняті показники особливостей шкірних візерунків на пальцях: 1. Загальний гребінцевий рахунок (загальна кількість папілярних ліній) - сума на всіх 10 пальцях папілярних ліній між центром візерунка і дельтою. 2. Індекс інтенсивності візерунка - сума дельт на 10 пальцях обох рук. 3. Частота окремих візерунків - співвідношення кількості візерунків того чи іншого типу (дуги, петлі радіальні, петлі ульнарні, завитки) до загальної кількості всіх візерунків. У популяційних дослідженнях обчислюють індекси, що відображають в основному дельтовий показник, тобто співвідношення петель і завитків на всіх 10 пальцях за формулою А+2W/10. Найчастіше застосовується формула Dt 10 = А 2W/(А+L+W) 10. У групових дослідженнях користуються вивченням кількісного значення візерунка, тобто числа гребінців від дельти до центру візерунка (гребінцевий рахунок). У середньому на одному пальці буває 15-20 гребінців, на всіх 10 пальцях у чоловіків - 144,98, а у жінок - 127,23. При вивченні шкірного рельєфу долоні досліджують: 1. Хід головних долонних ліній А, Y, С, D. 2. Долонні візерунки на тенарі і гіпотенарі. 3. Пальцеві візерунки (форму візерунків і гребінцевий рахунок). 4. Осьові трирадіуси. На характер пальцевого і долонного візерунків впливають механізми цитоплазматичної спадковості. Дослідження людей з хромосомними захворюваннями дозволило виявити специфічні зміни не тільки візерунків пальців і долонь, але й характер основних згинальних борозен на шкірі долонь. Характерні зміни даних показників спостерігаються при хворобі Дауна, синдромах Клайнфельтера, Шерешевського - Тернера, що дозволяє використовувати методи дерматогліфіки та пальмоскопії для діагностики цих захворювань. Дерматогліфічні особливості у осіб з хромосомними порушеннями
|