1 Генетика, предмет и задачи. Понятие о наследственности и изменчивости. Генетика
 Скачать 0.61 Mb.
|
|
Устойчивость к насекомым: Устойчивость ГМ-культур к насекомым-вредителям достигается внесением гена, вызывающего выработку инсектицидного токсина (такого как токсин Bt из бактерии bacillus thuringiensis). Bt-токсин представляет собой протеин (белок) с высокой избирательностью действия. Bt-протеин, выделенный из определенного штамма бактерии, способен поражать определённый вид насекомого-вредителя и не действует на других насекомых. Наибольших успехов в создании Bt-сортов удалось достичь на картофеле, кукурузе и хлопке. Потенциальные преимущества: 1) уменьшение объёма химического инсектицида, используемого во время посева; 2) повышение устойчивости за счёт уменьшения ущерба, приносимого вредителями и рост доходов фермеров; 3) сокращение основного ущерба «до» и «после» снятия урожая в результате использования инсектицидов, применяемых и для предотвращения проникновения болезнетворных организмов в культуру. Стрессорный фактор, или стрессор - сильно действующий фактор внешней среды, способный вызвать в организме повреждение или даже привести к смерти. Показано, что растения наиболее устойчивы в покоящемся состоянии (в виде семян, луковиц, клубней) и наиболее чувствительны в ювенильный период (молодой возраст), период появления всходов, период формирования гамет, во время цветениея и плодоношения. По существующей классификации экологические факторы можно разделить на абиотические и биотические. Абиотические факторы: а) климатические – свет, тепло, воздух (его состав и движение), влага (включая осадки в разных формах, влажность почвы и воздуха); б) эдафические (или почвенно-грунтовые) – механический и химический состав почв, их физические свойства и т. д.; в) топографические (или орографические) – условия рельефа. Биотические факторы: а) фитогенные – влияние растений-сообитателей как прямое (механические контакты, симбиоз, паразитизм, поселение эпифитов), так и косвенное (фитогенные изменения среды обитания для растений); б) зоогенные – влияние животных (поедание, вытаптывание и прочие механические воздействия, опыление, а также косвенное влияние на среду). в) микробогенные факторы г) микогенные факторы; Антропогенные факторы. Способность к защите от повреждающих и неблагоприятных факторов среды – обязательное свойство любого, в том числе и растительного, организма. Ответные реакции, индуцируемые в организме внешними воздействиями, объединяют термином «адаптационный синдром», а также широко распространившимся термином «стресс». В ответ на повреждающее действие фактора организм переходит в состояние стресса. Стресс — это интегральный (лат. integer — цельный, единый) неспецифический ответ растения на повреждающее действие, направленный на выживание организма за счет мобилизации и формирования защитных систем. 62. Растения с высокой азотофиксацией и эффективностью фотосинтеза. Повышение эффективности биологической азотфиксации: 1) хорошо изученный фермент ответственный за восстановление молекулярного азота до аммония- нитрогеназа; 2) задачей генетической инженерии для повышения эффективности биологической фиксации азота является создание штаммов ризобии с усиленной азотфиксацией и колонизирующей способностью. Колонизация бобовых растений ризобиями протекает очень медленно, лишь единичные из них дают начало глубенькам. Это происходит потому, что местом инвазии ризобии является только одна небольшая область между точкой роста корня и ближайшим к ней корневым волоском, находящимся на стадии формирования. Все остальные части корня и развившиеся корневые волоски растения нечувствительны к колонизации. В ряде случаев сформировавшиеся клубеньки оказываются неспособными фиксировать азот, что зависит от многих растительных генов (выявлено не менее 5), в частности от неблагоприятного сочетания двух рецессивных генов. Повышение эффективности фотосинтеза C4-растения характеризуются высокими темпами роста и скоростью фотосинтеза, у них практически отсутствует видимое фотодыхание. У большинства сельскохозяйственных культур, относящихся к C3-растениям, высокая интенсивность фотодыхания. Фотосинтез и фотодыхание – тесно связанные процессы, в основе которых лежит бифункциональная активность одного и того же ключевого фермента – рибулозобифосфат- карбоксилазы (РуБФК). РуБФ- карбоксилаза может присоединять не только CO2 но и О2, то есть осуществляет реакции карбоксилирования и оксигенирования. При оксигенировании РуБФ образуется фосфогликолат, который служит основным субстратом фотодыхания – процесса выброса CO2 на свету, в результате чего теряется часть фотосинтетических продуктов. Низкое фотодыхание у С4-растений объясняется не отсутствием ферментов гликолатного пути, а ограничением оксигеназной реакции, а также реассимиляцией СО2 фотодыхания. Одной из задач, стоящих перед генетической инженерией, является исследование возможности создания РуБФК с преобладающей карбоксилазой активностью. 63. Изменение окраски цветков у декоративных ГМ-растений. С помощью традиционных методов селекции были выведены 1000 сортов, различающихся цветом и формой цветов. Однако такая селекция ограничивается наличием исходного генетического материала. Например, у петунии традиционной селекцией нельзя было получить растения с цветами кирпичного цвета. Их цвет обуславливается антоцианами, которые синтезируются из фенилаланина и отличаются боковыми радикалами. Производные дельфинидина имеют синий цвет, цианидина – красный, а пеларгонидин окрашен в кирпично-красный цвет. После трансформации петунии геном дигидрофлавонол- 4-редуктазы кукурузы получили цветы кирпично-красного цвета. Этот необычный для петуний цвет обусловлен синтезом в трансгенном растении пеларгонидин-3-глюкозида из дигидрокепферола. Примерно 70% объёма индустрии цветов приходится на розы, гвоздики, тюльпаны, хризантемы. Получение растений с новой необычной окраской цветов дает большой экономический эффект. Так, были выведены трансгенные хризантемы, несущие смысловые и антисмысловые ДНК халконсинтазы. Учёные исходили из того, что и смысловые и антисмысловые ДНК будут подавлять экспрессию гена халконсинтазы в трансгенных растениях. Смысловая супрессия, состоит в том, что в присутствии дополнительной копии эндогенного гена подавляется накопление соответствующей мРНК. Молекулярные основы этого явления пока не изучены. Антисмысловая же РНК халконсинтазы блокирует трансляцию эндогенной халконсинтазной мРНК. Смысловые и антисмысловые конструкции под контролем 35-s промотора были встроены в бинарный Вектор на основе Ti-плазмид и введены в клетки растений. Трансгенные растения имели белые цветы. 64. Растения как биореакторы. Растительные клетки являются уникальными источниками ценных биологически активных веществ разной химической природы, которые обладают не только широким спектром лечебного действия, но и применяются в парфюмерии, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве. Исследования идут в нескольких основных направлениях: 1) растения-вакцины; 2) растения-фабрики лекарств; 3) растения-биореакторы для производства промышленных продуктов (компонентов для различных видов пластика, красителей, технических масел и присадок к ним, например, для двигателей внутреннего сгорания и т. д.). Применение вторичных метаболитов в различных областях: 1. Фармацевтические средства – 72,5 %; 2. Пищевые добавки – 8%; 3. Пигменты – 6,5%; 4. Другие продукты – 13%. Применение отдельных классов соединений в фармакопии: 1. Алкалоиды – 67%; 2. Сердечные гликозиды – 18%; 3. Стероиды – 4%; 4. Другие вещества – 11%. Одним из перспективных направлений ДНК-технологий растений является создание растений-биореакторов, способных продуцировать белки, необходимые в медицине, фармакологии и др. К достоинствам растений-биореакторов относится отсутствие необходимости в кормлении и содержании, относительная простота создания и размножения, высокая продуктивность. Кроме того, чужеродные белки не вызывают иммунных реакций у растений, чего трудно добиться у животных. В геном растений встраиваются гены, продукты которых индуцируют у человека и животных иммунный ответ, например, на оболочечные белки возбудителей различных заболеваний, в частности, холеры, гепатита, диареи, а также на антигены плазматических мембран некоторых опухолей. Создаются трансгенные растения, несущие гены, продуцирующие некоторые гормоны, необходимые для гормонотерапии людей и так далее. Велики перспективы использования растений для производства антител. Было проведено создание вакцины, продуцируемой картофелем, против инсулинозависимого диабета. В клубнях картофеля накапливался химерный белок, состоящий из субъединицы В токсина холеры и проинсулина. Наличие субъединицы В облегчает потребление данного продукта клетками, что делает вакцину в 100 раз более эффективной. Скармливание клубней с микрограммовыми количествами инсулина мышам, больным диабетом, позволяло затормозить прогрессирование болезни. 65. Регуляция сроков созревания и хранения плодов. Повышение урожайности, регуляция скорости роста. В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с «antisense RNA» (перевёрнутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при контролировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180 градусов. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется. Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Такой же подход применим для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен – это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов. 66. Джекпот 67. Генная инженерия в животноводстве. Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, – трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии. Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, – мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных. Первые трансгенные мыши с ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конечной живой массы. Однако у трансгенных свиней с геном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось. По данным Л.К. Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7% выше по сравнению с контрольными животными. Однако у трансгенных овец с генами Гр и РФ ГР, несмотря на повышенный уровень ГР, скорость роста не увеличивалась. Одна из важнейших задач использования трансгенных животных в медицине – получение биологически активных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызывающих у них синтез новых белков. В Эдинбурге в 1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном α-1-антитрипсина человека и β-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г./л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. В России группой ученых под руководством Л.К. Эрнста получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200–300 мг химозина – основного компонента для производства сыра. Крупное достижение сделано учёными научного центра, в котором была создана первая клонированная овечка – Долли. Исследователи из института Рослина произвели пять поколений птиц, в яичном белке которых содержатся человеческий интерферон и антитела для борьбы с меланомой 68. Животные как модели наследованных заболеваний человека, биореакторы, источники органов для пересадки человеку. Трансгенных животных используют для разных целей: увеличения продуктивности, получения животных-«биореакторов», которые продуцируют БАВ, необходимые для производства биологических, медицинских и ветеринарных препаратов. К числу важных практических достижений генной инженерии следует отнести создание диагностических препаратов. В медицинскую практику введено более 200 новых диагностикумов. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии. Так, были получены животные биореакторы, способные выделять ценные биологические вещества. Например, в России группой ученых под руководством Эрнста была выведена трансгенная овечка, которая с молоком выделяет химозин фермент, используемый а произ-ве сыра. Не так давно для сыроваренной промышленности требовалось огромное количество желудков телят. В последние несколько десятков лет практически все сыроделы пользуються химозином, полученным методом микробиологического синтеза из культур бактерий и микроскопических грибков. Очевидно, что такое получение химозина не только гуманнее, но и выгоднее традиционных способов, требующих убийства сотни телят. Всего из 3л молока трансгенной овцы можно получить достаточно химозина для производства тонны сыра – и при этом не тратиться ни на работу ферментёра, ни на выделение из культуральной жидкости нужного фермента и его очистку. Очень важным направлением использования трансгенных животных является создание моделей различных патологий человека. В настоящее время с помощью трансгеноза осуществлено моделирование множества различных заболеваний человека, как рак груди, рак простаты, диабет и др. На модели трансгенных животных проведены многочисленные исследования по выяснению роли различных онкогенов в злокачественных перерождениях клеток млекопитающих. Эмбриональные стволовые клетки. Все вышеперечисленные системы получения трансгенных животных имеют тот недостаток, что вводимая этими способами ДНК интегрируется с реципиентрым геномом случайным образом зачастую в виде множества копий, часто наблюдаются перестройки трансгена, мутации в геноме хозяина вплоть до летальных. Вследствие этого нередко экспрессия одного и того же трансгена может варьировать в широких пределах у трансгенных животных до полного её отстутствия. Однако в последнее десятилетие техника введения чужеродной ДНК в геном животных усовершенствовалась так, что стало возможным осуществлять направленное введение ДНК в любую желаемую часть генома или конкретного локуса. Основой новой технологии послужило создание эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). В 1981г. Одновременно в двух лабораториях были получены первые культуры клеток, выделенных из внутренней клеточной массы бластоцист мыши. Несколько позднее были получены культуры эмбриональных герминативных клеток (ЭГК), выделенные их первичных половых клеток мыши. Затем были выделены линии клеток, подобные ЭСК, из эмбрионов кролика, хомяка, норки, свиньи, овцы, обезьян, а в последние годы такие линии выделены из бластоцист и первичных половых клеток человека. ЭСК и ЭГК сохраняют высокие плюрипотентные свойства (плюрипотентные кл могут дифференцироваться во все типы клеток, кроме клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка). В отличие от них, тотипотентные клетки могут дать начало всем типам клеток, включая клетки могут дать начало всем типам клеток, включая клетки внезародышевых органов) при длительном культивировании in vitro и будучи вновь введенными в эмбрион способны формировать химер, участвуя в развитии тканей всех трёх зародышевых листков, включая образование гамет. Однако способность ЭСК к формированию химер и наследованию этих клеток у их потомков твердо установлена пока для ЭСК мышей. Таргетинг гена – направленное изменение гена за счет гомологичной рекомбинации, приводящее к выключению (гена нокаут) или изменению (гена нокин) его экспрессии. 69. Генный нокаут. Для изучения функций того или иного гена может быть применён нокаут гена – это метод молекулярной генетики, при котором из организма удаляют или делают неработоспособными определенные гены. Таким образом получают организм, «нокаутный» по неработающим генам. Нокаутные организмы помогают узнать функции генов, нуклеотидная последовательность которых известна. Различия между нокаутным и нормальным организмом могут свидетельствовать о функции выключенного гена. Первое клонированное животное мышь, из соматических клеток – овечка Долли. Искусственная экспрессия т.е. добавление в организм гена, которого у него ранее не было. Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функций генов. В сущности процесс введения дополнительных генов так же, как и при нокауте, но существующие гены не заменяются и не повреждаются. 70. Животные устойчивые к заболеваниям, продуцирующие БАВ медицинского и технологического назначения, с измененными качествами молока. Улучшение здоровья домашних животных, повышение их устойчивости к болезням с помощью методов генетической инженерии имеет практическое и социальное значение. Это не только позволяет повысить их продуктивность, уменьшить затраты на лечение животных, но и снизит уровень употребления антибиотиков для их лечения. Использовать 3 основные генно-инженерные подхода: 1. добавка генов, повышающих устойчивость к болезням 2. «удаление» генов восприимчивости к болезням 3. замена отдельных генов животного на аналогичные гены, но в большей мере способствующие активному противостоянию болезни. По сравнению с трансгенными животными, микроорганизмы и клеточные системы имеют недостатки: 1. Выход белка из культуральных клеток более низкий 2. Процесс выращивания клеток приводит к изменению структуры протеинов и как следствие к снижению их биологической активности 3. Создание данных клеточных культур в промышленном реакторе, является сложной и дорогой процедурой. Преимущества трансгенных животных: 1. животные лишь в начале могут быть трудно создаваемыми и дорогими, но однажды созданная линия таких особей воспроизведет себе подобных. 2. Они могут продуцировать чрезвычайно большое количество белков с низкой стоимостью 3. Выделением рекомбинантного белка с молоком, с одной стороны, удобный прием его получения от животного применения естественного приема традиционного доения. |