все ответы по гисте. 1. Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала для гистологического исследования
 Скачать 0.66 Mb.
|
|
1.Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала для гистологического исследования. 1.Взятие гистологического материала: Или от живого животного(биопсия, пункция) или от трупа. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) – где 0,5 – толщина. Берется не позднее 3ч. после смерти при комнатной температуре( при +4 не более 12 ч.). Материал берется на границе здоровой и больной ткани. Затем помещают в фиксатор(фиксирующая жидкость). Если токсикологическое исследование(при подозрении на отравление) – материал только свежий(желудок и его содержимое, кусочек тонкого кишечника и его содержимое, почка, печень и участки явных поражений) .Бактериологическое исследование – свежий материал (лимфоузлы, селезенка, почки, печень, иногда трубчатая кость и участки с видимыми изменениями) 2.Фиксация материала: Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей. Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков. Фиксаторы:1.Формалин(не подходит для исследования на гликоген);2 Спирт(70%)(3-4 недели хранит препарат),не подходит для исследования на жиры;3 Сложные фиксаторы(состоят из многих компонентов на основе пикриновой к-ты).4 Осмиевая кислота( для электронной микроскопии) 3.Обезвоживание: образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань). Для этого их “проводят” по батарее спиртов - 70 % , 80 % , 96 % , 100 % этанол -по 24 часа в каждом спирте. Образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле. 4.Уплотнение. Затем образцы уплотняют - чтобы в последующем их можно было резать на микротоме. Часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин. Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56 о С. Дают парафину, остывая, затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике. Также используют заливку в смолы, желатин и замораживание. 2.Техника изготовления гистосрезов, их окраска и заключение. Далее приготавливают срезы с помощью аппарата микротом:1. Кубики вставляют в специальный прибор - микротом, - служащий для приготовления срезов. 2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм).б) А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины.3. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем - на предметное стекло. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей: ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин)(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.) Для окрашивания предметные стёкла со срезами помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой. Препарат опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией),а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом. Гистологические красители (основные, кислые, специальные). Сначала окрашивание основными красителями, они красят ядра. Основные красители: гематоксилин – окрашивает ядра в фиолетовый цвет; кармин – в красный; тионин – в синий. Кислые красители (окрашивают цитоплазму):эозин – в розовый; оранж – в оранжевый; ауранция – в желтый; индигокармин – синий. Специальные красители(окрашивают избирательно): пикрофуксин – окрашивает соединительную ткань в красный, остальное в желтый; смесь Маллори – окрашивает соединительную ткань в синий; судан – красит жиры; муцикармин – окрашивает слизь в фиолетовый; тионин – слизь в голубой. 3.Значение новых методов( цитохимия, гистоавторадиография, люминесцентная и электронная микроскопия) исследования для познания глубинных процессов жизни на клеточном и субклеточном уровнях. Цитохимия - (цито- + химия) раздел цитологии, изучающий химический состав клетки и ее компонентов, а также обменные процессы и химические реакции, которые лежат в основе жизнедеятельности клетки.Благодаря развитию методов цитохимии впервые были сформулированы идеи о ведущей роли нуклеиновых к-т в синтезе белка, в развитии организмов и наследственности (Б. В. Кедровский, Т. Касперсон, 30-е гг. 20 в.). В 40-х гг. методами цитохимии было доказано постоянство содержания ДНК в хромосомном наборе (К. и Р. Вендрели) и на этой основе определена общебиол. значимость полиплоидных клеток (несут неск. гомологичных наборов хромосом) и выяснена важная роль клеточной полиплоидии (кратное увеличение числа наборов хромосом) в росте и развитии животных и растений. При использовании радиоактивных предшественников синтеза ДНК, гл. обр. 3Н-тимидина (К. Леблон, Л. Н. Жинкин, 60-е гг.), определены важные закономерности обновления клеточных популяций и регенерации тканей. При применении 3H-предшественников РНК и белков изучены закономерности перемещений макромолекул внутри клетки. При изучении кинетики образования клеточных белков цитохим. и биохим. методами в 60-70-х гг. открыт ритм синтеза белка. Цитохим. методы используют в медицине, в частности, для диагностики и прогноза лечения злокачеств. опухолей. Гистоавторадиография – этот метод широко применяют для изучения кинетики клеточных популяций, метаболических процессов в клетках, и определения участков синтеза биополимеров с помощью регистрации веществ, меченых изотопами. Для этого в ткань животного или в среду с культивируемыми клетками вводят предшественников какого-либо макромолекулярного соединения(аминокислоты, нуклеотиды), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. В процессе синтеза белков, гормонов, ферментов или иных веществ в них включается молекула меченого предшественника. Для регистрации места ее включения в темноте на окрашенные срезы наносят специальную фотоэмульсию, после чего срезу проявляют. На участках соприкосновения фотоэмульсии с радиоактивным веществом происходит фотореакция и образуются метки(треки). Этим методом можно определить время перемещения клеток в пластах многослойного эпителия, синтез йодсодержащих гормонов в щитовидной железе. Люминесцентная микроскопия - основана на том, что многие органические вещества, содержащиеся в клетках, способны светиться при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции постоянно смещен в сторону более длинных волн по отношению к излучению, возбуждающему флуоресценцию. Например, хлорофилл зеленых растений в ультрафиолетовых лучах светиться красным светом, а другие вещества – зеленым или желтым. Этот принцип использован на создании люминесцентных микроскопов. Источником света в них служат ксеноновые или ртутные лампы, а объект исследуют через специальные фильтры. Собственной, или первичной, флуор-ией обладают пигменты ( в том числе бактерий),витамины А,В2,индоламины и др. вещ. Существует вторичная, или вызванная. ф-ия. Чтобы ее получить, используют специальные вещ.- флуорохромы. Разновидностью вторичной является Ф. желто-зеленого цвета, индуцированная парами формальдегида и характерная для катехоламинов (адреналин и норадреналин) мозгового вещества надпочечников. Таким образом можно исследовать хим. состав тканевых структур, выявить трофические и секреторные включения в клетках. Электронная микроскопия - совокупность методов исследования с помощью электронных микроскопов микроструктур тел, их локального состава и локализованных на поверхностях или в микрообъемах тел электрических и магнитных полей. В электронном микроскопе используются лучи с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн (разрешение в 100000 раз выше, чем в световом микроскопе). Методом ЭМ исследуют ультратонкие срезы, которые готовят на ультратомах. К современным электронно-микроскопическим методам относят ПЭМ(просвечивающую, или трансмиссионную электронную микроскопию. используется для изучения внутреннего строения клетки. Пучок электронов пропускается через объект, предварительно обработанный тяжелыми металлами, которые накапливаются в определенных структурах, увеличивая их электронную плотность. Электроны рассеиваются на участках клетки с большей электронной плотностью, в результате чего на изображениях эти области выглядят темнее), СЭМ(сканирующую) (используется для изучения поверхности объекта. Образцы зачастую покрывают тонкой пленкой золота.), электронную авторадиографию, иммуно-электронную микроскопию, ЭМ – гистохимию. 4.Строение клетки как саморегулируемой системы организма. Примеры саморегуляции на клеточном уровне — самосборка клеточных органелл из биологических макромолекул, поддержание определенного значения трансмембранного потенциала у возбудимых клеток и закономерная временная и пространственная последовательность ионных потоков при возбуждении клеточной мембраны. Клетка, по сравнению с прионами и вирусами, является структурой более совершенной. Она представляет своеобразный симбиоз простейших структур, таких, как митохондрий, пластид, лизосом и других, которые в условиях общеклеточной среды способны к активной функциональной деятельности. Клетка является не только структурно механической и функциональной ячейкой всего живого, но и представлена в природе целостными, как их принято называть, одноклеточными организмами. Их автономное существование в среде обитания возможно в силу того, что они имеют совершенную функционально-структурную организацию, в основе которой лежат процессы саморегуляции. Разрушение целостной клеточной структуры ведет к остановке регулирующих механизмов, в основе которых лежит принцип включения и выключения структур регуляции, обеспечивающих поддержание относительно постоянного состава клетки. Регуляторными механизмами этого процесса являются гены-регуляторы. Они способны контролировать не только качественный состав белков-ферментов, но и их количество в клетке. Гены-регуляторы - это уже "изобретение" следующего, более высокого уровня жизни, но начало их развития находится на предыдущем уровне. Поэтому связь между ферментами и генами-регуляторами самая, что ни есть прямая. Гены - регуляторы действуют не путем непосредственного контакта со структурными генами, которые выдают информацию о синтезе определенных полипептидных цепей, а при помощи белка-репрессора, при наличии достаточно накопившихся молекул синтезируемого вещества белок-репрессор, соединяясь с этими молекулами, активизируется и связывается с геном-оператором, непосредственно сцепленным с группой структурных генов. В результате синтез данного вещества прекращается. Белок-репрессор, который свое название получил из-за того, что подавляет деятельность гена-оператора, ставит его в положение "выключено". Но при малом количестве синтезируемых молекул белок-репрессор остается неактивным. В таких условиях действие гена-оперона и структурных генов не подавляется, и синтез будет продолжаться беспрепятственно. Практически это выглядит следующим образом. Если организм оказался в таких условиях среды, которые требуют ответной реакции его органов на их действие, то на организацию этих реакций тратится энергия, которую выделяют молекулы АТФ вследствие ее распада до АДФ. Этот процесс распада приводит к уменьшению содержания АТФ в клетке, величина которой составляет около 0,04 процента. Уменьшение концентрации вещества в клетке является сигналом белкам-ферментам, осуществляющим реакции бескислородного и кислородного расщепления глюкозы. В ходе этих реакций выделяется энергия и синтезируется АТФ. Когда уровень АТФ достигнет нормы, ее синтез притормаживается, потому что белки-ферменты улавливают изменение концентрации химического вещества в клетке, меняют свою структуру и прекращают свою функциональную деятельность. Изменение белками-ферментами своей структуры - процесс обратимый. При расходовании АТФ и, соответственно, снижении ее концентрации, опять включаются реакции расщепления глюкозы. По этому принципу осуществляются реакции и других веществ в клетке. Все эти процессы являются основным условием поддержания жизнедеятельности клетки, источником ее функционирования в непосредственной связи с окружающей средой, из которой клетка получает различные вещества для реакций диссимиляции и в которую выделяет продукты жизнедеятельности. Эта связь осуществляется с помощью соответствующих структурных образований (поры), через которые проникают и выделяются ионы, вода и мелкие молекулы других веществ. Более крупные частицы твердых веществ, а также капли жидкости проникают в клетку и выделяются из нее путем фагоцитоза ("фагос" - пожирать, "цитос" - клетка) и пиноцитоза ("пино" - пью, греческ.). Все это элементы обменных процессов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки, от нормальной работы которой зависит жизнедеятельность более крупных структур многоклеточных организмов. Ими являются ткани, органы и их системы, а так же целостные организмы, в которых проявляются еще более сложные системы саморегуляции. 5.Ультроструктурная организация поверхностного аппарата клетки, роль в реализации клеточных функций. Поверхностный аппарат клетки имеет сложное строение. В основе его лежит плазматическая мембрана, с которой снаружи связан надмембранный комплекс – гликокаликс, а изнутри – опорно-сократительный аппарат гиалоплазмы. Его основные функции определяются пограничным положением и включают: 1) барьерную (разграничительную) функцию; 2) функцию распознавания других клеток и компонентов межклеточного вещества; 3) рецепторную функцию, включая взаимодействие с сигнальными молекулами (гормоны, медиаторы и т.п.); 4) транспортную функцию (Через нее происходит транспорт веществ внутрь клетки и наружу. Мембрана обладает свойством полупроницаемости); 5) функцию движения клетки посредством образования псевдо-, фило- и ламеллоподий) Основная часть поверхностного аппарата клетки - плазматическая мембрана. Её толщина 10нм. Клеточные мембраны — важнейший компонент живого содержимого клетки — построены по общему принципу. Согласно жидкостно-мозаичной модели, предложенной в 1972 г. Николсоном и Сингером, в состав мембран входит бимолекулярный слой липидов, в который включены молекулы белков.Липиды — это водонерастворимые вещества, молекулы которых имеют два полюса, или два конца. Один конец молекулы обладает гидрофильными свойствами, его называют полярным. Другой полюс гидрофобный, или неполярный. В биологической мембране молекулы липидов двух параллельных слоев обращены друг к другу неполярными концами, а их полярные полюса остаются снаружи, образуя гидрофильные поверхности. Кроме липидов, в состав мембраны входят белки. Их можно разделить на три группы: периферические, погруженные (полуинтегральные) и пронизывающие (интегральные). Большинство белков мембраны является ферментами. Полуинтегральные белки образуют на мембране биохимический «конвейер», на котором в определенной последовательности осуществляется превращение веществ. Положение погруженных белков в мембране стабилизируется периферическими белками. Интегральные белки обеспечивают передачу информации в двух направлениях: через мембрану в сторону клетки и обратно. Интегральные белки бывают двух типов: переносчики и каналообразующие. Последние выстилают пору, заполненную водой. Через нее осуществляется прохождение ряда растворенных неорганических веществ с одной стороны мембраны на другую. Гликокаликс представляет собой ассоциированный с плазмолеммой гликопротеиновый комплекс, в состав которого входят различные углеводы. Углеводы образуют длинные, ветвящиеся цепочки полисахаридов, связанные с белками и липидами, входящими в состав плазмолеммы Углеводные цепи выполняют роль рецепторов. Благодаря им осуществляется межклеточное узнавание. Клетка приобретает способность специфически реагировать на воздействия извне. Субмембранный комплекс характерен только для эукариотических клеток. Он состоит из разнообразных белковых нитевидных структур: тонких фибрилл, микрофибрилл, скелетных фибрилл и микротрубочек. Они связаны друг с другом белками и формируют опорно-сократительный аппарат клетки. Субмембранный комплекс взаимодействует с белками плазмалеммы, которые, в свою очередь, связаны с надмембранным комплексом. В результате ПАК представляет собой структурно целостную систему. Это позволяет ему выполнять важные для клетки функции: изолирующую, транспортную, каталитическую, рецепторно-сигнальную и контактную. 6.Ультраструктурная организация и взаимосвязи органелл метаболического аппарата клетки. Ничего особо не нашла Цитоплазма клетки состоит из гиалоплазмы и обязательных клеточных компонентов: органелл – мембранных, немембранных, а также специального назначения и различных видов непостоянных структур – включений. В гиалоплазме и органеллах происходят все этапы метаболических реакций, посредством которых клетка расщепляет одни малые молекулы и синтезирует другие, необходимые для её роста и функционирования. Все компоненты цитоплазмы функционально тесно взаимосвязаны и составляют единый метаболический. Метаболический аппарат клетки - совокупность ее структур, участвующих в метаболизме. Под метаболизмом понимают постоянно происходящий в клетках живых организмов обмен веществ и энергии. В различных процессах метаболизма из простых веществ при участии ферментов синтезируются высокомолекулярные соединения, в свою очередь сложные молекулы расщепляются на более простые.Реакции биологического синтеза называются анаболическими, а их совокупность в клетке — анаболизмом, или пластическим обменом. В клетке протекает огромное количество процессов синтеза: липидов в эндоплазматической сети, белков на рибосомах, полисахаридов в комплексе Гольджи эукариот и в цитоплазме прокариот, углеводов в пластидах растений. Структура синтезируемых макромолекул обладает видовой и индивидуальной специфичностью. Набор характерных для клетки веществ соответствует последовательности нуклеотидов ДНК, составляющих генотип. Для обеспечения реакций синтеза клетке требуются существенные затраты энергии, получаемой при расщеплении веществ. Совокупность реакций расщепления сложных молекул на более простые носит название катаболизма (греч. katabole разрушение), или энергетического обмена. Примерами таких реакций является расщепление липидов, полисахаридов, белков и нуклеиновых кислот в лизосомах, а также простых углеводов и жирных кислот в митохондриях. Органоиды, участвующие в ассимиляции: 1) шЭПС 2) аЭПС 3) аппарат Гольджи 4) рибосомы 5) хлоропласты (у растений) Диссимиляция осуществляется в: 1) лизосомах (подготовительный этап) 2) в цитоплазме (гликолиз) 3) в митохондриях (аэробный этап) |