1. Образование антибиотиков в естественных и лабораторных условиях. Вещества предшественники для биосинтеза антибиотиков
 Скачать 0.99 Mb.
|
|
антибиотики (амфотерицин В, нистатин), имеющие в лактонном кольце несколько сопряженных двойных связей и разделяющиеся на диены,триены, тетраены, пентаены, гексаены и гептаены. 5. Анзамицины (рифамициновый комплекс), имеющие бициклическую структуру с длинным алифатическим мостиком и нитрифицированной боковой цепью. 6. Полипептидные антибиотики (полимиксины, низины, бацитрацины) и депсипептидные (валиномицин, энниатин В), представляющие собой циклические или линейные полипептидные цепи. 7. Антибиотики-антрациклины (дауномицин, рубомицин, карминомицин, целикамицины) – гликозиды, хромофорная группа которых представлена красноокрашенными антрациклинонами или синими пигментами актиномицетов, нерастворимыми в воде и соединенными с амино-или дезоксисахарами, иногда с аминокислотами. 8. Антибиотики-гликопептиды (ванкомицин, ристомицин), имеющиенесколько остатков углеводов, соединенных с циклопептидным агликоном. 9. Металлосодержащие антибиотики, среди которых имеются железо- (сидеромицины, альбомицин, гризеин) и медьсодержащие (флеомицин) соединения. 10. Соединения с другой структурой, среди которых можно выделить ароматические соединения (хлорамфеникол); антибиотики, сходные с нуклеозидами (линкомицин), и др. 23. Получение антибиотиков в промышленных условиях. Основные стадии процесса. После установления лечебных свойств первого антибиотика – пенициллина – сразу же возникла задача организации его массового производства. В настоящее время можно говорить о том, что производство антибиотиков – хорошо развитая отрасль, которая занимает одно из центральных мест в производстве лекарственных препаратов. Огромный спрос на анти- биотические препараты со стороны медицины, сельского хозяйства, пище- вой промышленности способствовал усиленному поиску новых антибиоти- ков и получению их в промышленных масштабах. Современное промыш-ленное получение антибиотиков – это сложная многоступенчатая биотех- нологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий. 1. Стадия биосинтеза (образования) антибиотика, основной задачей которой является создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика. Высокая результативность этой стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма. Для максимального выхода антибиотика при культивировании продуцента используют комплекс мер, включающий подбор наиболее благоприятных для этих целей питательных сред и режимов культивирования организма. Все это входит в понятие управляемый синтез. На стадии подготовки инокулята следует обратить внимание на состав среды, в которой выращивается организм, на возраст клеток или мицелия. На стадии биосинтеза, кроме состава среды, большую роль играет скорость потребления тех или иных ее компонентов, регуляция процесса аэрации, поддержание соответствующих рН и температуры и других показателей культивирования. Для максимального снижения себестоимости препарата необходимо: • внедрение в производство наиболее высокопродуктивных штаммов микроорганизмов – продуцентов антибиотиков; • создание и обеспечение самых благоприятных условий развития продуцента антибиотика на относительно дешевых средах; • широкое использование математических методов планирования процесса развития организма и электронно-вычислительной техники с целью оптимизации и моделирования условий его культивирования, обеспечивающих максимальный выход антибиотика; • применение современного оборудования на всех стадиях технологического процесса с контролем основных параметров развития организма и стадий биосинтеза антибиотика. В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов – продуцентов антибиотиков является методглубинного культивирования, суть которого заключается в том, что микроорганизмы развиваются в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается. Наибольшее распространение получила модификация глубинного культивирования, названная непрерывным культивированием, при использовании которого возможно поддержание развития микроорганизмов на определенной стадии роста. Для изучения условий образования антибиотиков и их производства в промышленных условиях используются ферментеры, снабженные приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры и контрольно-измерительными приборами. В зависимости от характера работ используют разные типы ферментеров: лабораторные, полупромышленные, промышленные. Для каждого продуцента разрабатывается оптимальная среда, которая должна соответствовать определенным требованиям: а) обеспечивать максимальный выход антибиотика; б) состоять из относительно дешевых компонентов; в) иметь хорошую фильтрующую способность; г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов для выделения и очистки антибиотиков. Стерилизация питательных сред в промышленных условиях достигается в результате: • периодического метода для небольших объемов среды, при котором среда нагревается до 120–130 оС непосредственно в ферментере и выдерживается в течение определенного времени; • непрерывного метода для значительных объемов, при котором приготовленная среда подается в стерилизационную колонку, через которую пропускают острый пар. Нагретая до необходимой температуры среда по- ступает в специальный аппарат, где выдерживается определенное время. При подготовке посевного материала микроорганизмы предварительно выращивают на агаризованной среде в пробирках, затем делают высевы в колбы с жидкой питательной средой. На следующем этапе делают высев в специальный инокулятор небольшого объема (10 л), из которого хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный (100–500 л) ферментер, откуда и делают высев в основной ферментер. Для засева используется объемная доля инокулята 5–10 %. 2. Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделения культуральной жидкости от биомассы продуцента), эффективность которой определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, накоплением антибиотика в культуральной жидкости или внеклеточно. 3. Стадия выделения и очистки антибиотика, особенностью которой является достигаемое увеличение концентрации антибиотика (примерно от 1 до 20–30 %). В качестве основных методов используются экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, выпаривание, сушка. Если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции, используя для этого растворители, не смешивающиеся с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, то вначале его переводят в фазу, из которой наиболее целесообразно изолировать. Цель химической очистки – извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение от со-путствующих примесей. 4. Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка, основное требование к которой – высокое качество конечного продукта. Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому. В первом случае ставится задача выяснения стерильности готового препарата, которая обеспечивается соблюдением стерильных условий работы на всех стадиях процесса развития продуцента, выделения и очистки препарата. При фармакологическом контроле предполагается исследование токсичности, пирогенности, аллергенности и других свойств препарата, определенных Государственной фармакопеей. Расфасованный и упакованный препарат с указанием биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу. Выход антибиотиков обычно составляет несколько десятков граммов на 1 л. Можно отметить, что помимо прямой ферментации, которая описана выше, существует также способ получения полусинтетических производных антибиотиков. Такое производство было разработано с 1960 года, а первым полусинтетическим антибиотиком явился метициллин. Вообще говоря, на основе ферментативного гидролиза 6-аминопенициллановой (6-АПК) кислоты с помощью фермента пенициллинацилазы, который образуется многими видами микроорганизмов, получено около 40 тыс. полусинтетических производных. 6-АПК оказалась исключительно удобным объектом для введения радикалов вместо атома водорода в аминной группе. В настоящее время в разных странах созданы биотехнологические производства с использованием иммобилизованной пенициллинамидазы для выделения 6-АПК из бензилпенициллина. Полученная 6-АПК затем используется для химического синтеза других пенициллинов. Например, при синтезе ампициллина гидролиз бензил-пенициллина осуществляют при участии мутанта Kluivera citrophyla, после чего вносят клетки Pseudomonas melanogenium и эфир D, L-фенилглицина, условия процесса подобраны таким образом, что происходит образование ампициллина (D-аминобензилпенициллин). 24. Общая характеристика макролидных антибиотиков: механизмы развития резистентности к ним. Макролидные антибиотики относятся к соединениям, блокирующим процессы биосинтеза белка в области 50S субъединицы рибосом. Структура антибиотиков достаточно сложна, так как они содержат мак- роциклы из 14 (эритромицин, кларитромицин, олеандомицин); 15 (азали- ды, сумамед, азитромицин) и 16 (спирамицин, джозамицин, тилозин) атомов углерода, к которым присоединяются нейтральные или аминосахара. Всего обнаруживается в составе различных антибиотиков пять различных амино- и 11 нейтральных сахаров. Известно около 100 природных и полусинтетических производных, которые обладают бактериостатическим действием, в основном против грамположительных кокков, редко – в отношении грамотрицательных бактерий. С клинической точки зрения данные антибиотики могут быть разделены напротивобактериальные и противогрибковые (полиены). Первым обнаруженным в 1952 году соединением этой группы был эритромицин (S. erythreus = Sac-charopolyspora erythraea). Следует отметить, что в последние годы были обнаружены и 12-членные макролиды, образуемые Penicillium и полу-чившие название патулолиды, а также получены производные макроли- дов – кетолиды с весьма интересными для клиники свойствами. Макролиды – крупные гидрофобные структуры, поэтому их поступление в клетки грамотрицательных бактерий ограничено, но если процесс происходит, то считают, что он обеспечивается наличием пориновых каналов. Через цитоплазматическую мембрану поступление антибиотиков происходит, вероятно, путем пассивной диффузии. Проникая в клетку, антибиотик связывается с 50S субъединицей рибосомы, причем такое связывание обратимо и происходит за счет водородных связей. Для связывания антибиотика обязательно наличие интактного лактонного кольца и хотя бы одного сахара. Макролид более активен обычно, если таким остатком сахара в молекуле является аминосахар. При взаимодействии эритромицина с 50S субъединицей в образовании места связывания участвуют и 30S субъединица, и 23S-рРНК. При определении места связывания за основу было взято определенное сходство участка (сахар + часть лактонного кольца) с участком пептидил-тРНК. Современная концепция действия эритромицина на белковый синтез рассматривает антибиотик как аллостерический эффектор пептидил-трансферазы. Эффектор означает, что эритромицин может как подавлять, так и стимулировать образование пептидной связи. Основополагающим явился тот факт, что эритромицин не подавляет образование первой пептидной связи. Однако, если имеется хотя бы дипептид, наблюдается подавление данной реакции, т. е. Р-сайт должен быть занят пептидил-тРНК с определенной минимальной последовательностью аминокислот. Эритромицин рассматривают и в связи с изучением транслокации пептидной цепи (т. е. при перемещении пептидил-тРНК из А- в Р-сайт; вытеснение из Р-сайта тРНК; перемещение мРНК). В системе in vitro (рибосомы E. coli, присутствие других ингибиторов белкового синтеза, тРНК с различными по длине пептидами) исследовалось влияние на белковый синтез эритромицина. Оказалось, что связывание эритромицина с рибосомой приводит к нарушению расположения в Р-сайте возвращающейся из А-сайта пептидил-тРНК. Возможно, что она располагается при этом даже не в Р-сайте, а рядом с ним. В результате этого не вытесняется в окружающую среду уже деацитилированая тРНК, а неправильное расположение пептидил-тРНК по отношению к Р-сайту обрывает функционирование системы. А-место на рибосоме не изменяется в присутствии эритромицина и может принимать тРНК. Рибосомы эукариотических клеток макролиды не связывают, а ми-тохондриальные рибосомы защищены мембраной, через которую они не проникают. В настоящее время описано несколько механизмов резистентности к макролидам. Следует учитывать природную резистентность у грам-отрицательных бактерий за счет отсутствия поступления через наружную мембрану. Для E. coli описаны мутанты с повышенной резистентностью к эритромицину и другим макролидам за счет изменения некоторых белков 50S субъединицы. Это приводит к ослаблению способности рибосом связывать эритромицин. Считают, что как минимум шесть или семь белков участвуют в таком связывании. Значительно больший интерес представляет MLS-резистентность (макролиды, линкозамины, стрептограмин), описанная для Staphylococcus и Streptococcus. Гены, отвечающие за такой тип резистентности (erm-гены), могут быть локализованы как на хромосоме, так и в плазмидах. Их насчитывается семь классов. Продуктом данных генов является специ-фическая метилаза, катализирующая метилирование определенных остатков аденина в 23S-рРНК. Например, у E. coli происходит диметилирование остатка А-2058 в петле V, включенного в перенос пептидильного фрагмента. Возможна также замена аденина в этом (или сходных положениях у других организмов) на другой нуклеотид. Количество метилированных остатков – 2–3 на молекулу. Индукция синтеза метилазы происходит обычным путем: антибиотик воздействует на регуляторный белок на уровне транскрипции. Индуцирующими могут быть бактериостатические концентрации любого из антибиотиков. Такой тип резистентности носит название диссоциирующей. Удаление индуктора приводит к потере MLS-резистентности. Проблема достаточно актуальна, так как вживотноводстве часто используется тилозин, и в этих случаях наблюдалось повышенная частота выделения грамположительных бактерий с таким типом устойчивости. Все большее распространение получает механизм резистентности засчет образования клетками инактивирующих макролиды ферментов, которые могут быть трех типов: фосфорилирующие или гликозилирующиемолекулу и эстеразы, расщепляющие лактонное кольцо. Фосфорилирующие ферменты инактивируют лактонное кольцо в присутствии АТФи магния; гликозилирующие нуждаются в УДФ-глюкозе как кофакторе. Особое внимание в последнее время уделяется эстеразам, которые впервые были обнаружены у Pseudomonas, E. coli. Считают, что проблема их распространения как факторов резистентности приобретает для клиники такое же значение, как и продукция лактамаз и аминогликозидинактиви рующих ферментов. В настоящее время описаны два типа изоферментов – эстеразы I и II. Наконец, в последние годы у Staphylococcus обнаружен механизм, обусловливающий резистентность за счет энергозависимого выброса антибиотика из клетки, что сопровождается наличием вклетке плазмиды определенного типа. Применение макролидов в клинике ограничено по двум причинам:они являются нейтральными или основными соединениями, поэтому наблюдается плохое всасывание в организме; вторая причина – широкое распространение устойчивых штаммов. 25.Препаратынормофлоры морфологическую структуру в виде биопленки. Толщина ее 0,1 – 0,5мм. В ней содержится от нескольких сотен до нескольких тысяч микроколоний, образующихся как из анаэробных, так и аэробных бактерий . Формирование биопленки создает для бактерий дополнительную защиту. Внутри биопленки бактерии более устойчивы к действию химических и физических факторов, влияющих на состояние нормальной микрофлоры. К ним относятся: 1)эндогенные: а)секреторная функция организма; б)гормональный фон; в)кислотно-основное состояние; 2)экзогенные: условия жизни (климатические, бытовые, экологические). Любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормофлоры человека, возникающие в результате воздействия на макро- или микроорганизм различных Микроорганизмы, составляющие нормофлору, представляют собой четкую неблагоприятных факторов приводят в дисбактериозу. Для коррекции дисбактериоза необходимо устранить причину, вызвавшую его, затем использовать эубиотики(пробиотики) и пребиотики и симбиотики. Пребиотики – это препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника, стимулирующие рост и размножение так называемых дружественных человеку бактерий. Это низкомолекулярные углеводы (фруктозо-олисахариды, инулин, лактулоза и др.), которые не должны подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами [7]. Основные известные препараты: - |