1. Образование антибиотиков в естественных и лабораторных условиях. Вещества предшественники для биосинтеза антибиотиков

• Название: 1. Образование антибиотиков в естественных и лабораторных условиях. Вещества предшественники для биосинтеза антибиотиков
• Дата: 29.10.2018
• Размер: 0.99 Mb.
• Имя файла: Shpargalki_po_antibiotikam.docx
• Тип: Документы; #54894
• страница: 1 из 8

1. Образование антибиотиков в естественных и лабораторных условиях. Вещества – предшественники для биосинтеза антибиотиков

Считается, что лучшими продуцентами антибиотиков являются почвенные организмы, причем около 3000 всех известных соединений с ан-тибиотической активностью образуют представители актиномицетов. На проявление способности продуцировать антибиотики оказывает воздействие весь сложный комплекс условий культивирования или существования продуцента.

В лабораторных условиях биосинтез многих антибиотиков (как и других вторичных метаболитов) происходит во время определенной стадии роста культуры. С этой точки зрения, по предложению Б. Локка, рост популяции продуцентов можно разделить на две стадии: трофофазу (или фазу сбалансированного роста) и идиофазу (или фазу несбалансированного роста). В первой происходит интенсивный синтез таких соединений, как белки, нуклеиновые кислоты, ферменты, некоторые органические кислоты; во второй – относительно окисленные продукты синтеза первой фазы потребляются, и происходит образование большинства вторичных метаболитов (антибиотиков, пигментов и др.), т. е. относительно восстановленных соединений.

В зависимости от участвующих в процессе биосинтеза веществ антибиотики могут быть образованы следующим образом:

1) из единственного предшественника – первичного метаболита. Их синтез –цепь реакций, модифицирующих исходный продукт таким же образом, как при синтезе аминокислот или нуклеотидов. Примером такого рода синтеза является образование хлорамфеникола через типичный для ароматических соединений путь шикимовой кислоты;

2) из двух-трех различных предшественников, которые модифицируются и конденсируются с образованием сложных молекул. За счет конденсации двух аминокислот происходит биосинтез линкомицина. Антибиотик новобиоцин образуется из замещенной бензойной кислоты, аминогидрооксикумарина (оба – производные тирозина) и сахара новиозы;

3) путем олигомеризации или полимеризации близких по структуре мономеров через образование основной структуры, которая впоследствии может модифицироваться. По такому механизму происходит биосинтез четырех основных групп антибиотиков:

а) из аминокислот образуются полипептидные и депсипептидные;

б) из ацетат-пропионатных единиц (по типу синтеза жирных кислот) – тетрациклины, рифамицины, макролиды;

в) из ацетатных единиц при конденсации до изопреновых структур –

фузидиевая кислота;

г) из сахаров (по типу синтеза полисахаридов) – аминогликозиды.

Известно не менее 300 соединений, которые относятся к антибиотикам с полипептидной структурой и образование которых можно рассматривать как результат конденсации аминокислот с образованием пептидных связей. Они отличаются от обычных белков тем, что их молекулярная масса не превышает 3000, а в их составе обнаруживаются необычные аминокислоты, например в D-форме, метилированные или оксиаминокислоты. Такие структуры склонны к циклизации или гиперциклизации.

Считается, что в биосинтезе полипептидных антибиотиков не участвует рибосомная система, и, соответственно, процесс носит название не-рибосомного синтеза.

В качестве примера синтеза полипептидных антибиотиков можно рассмотреть биосинтез грамицидина С – декапептидного циклического

соединения, состоящего из двух идентичных пентапептидных цепей.

Биосинтез катализируется двумя растворимыми ферментными белками –

Н (280 тыс.) и L (100 тыс.). В присутствии этих ферментов экстракты

клеток B. brevis при наличии АТФ, катионов Mg2+, соответствующих

аминокислот могут синтезировать антибиотик.

Пептидные антибиотики не содержат более 15–20 аминокислот, так как маловероятно, что ферментный комплекс удерживал бы большее их количество. Синтез полипептидных антибиотиков осуществляется семействами, отдельные представители которых различаются заменой одной или нескольких аминокислот. Это, возможно, объясняется тем, что происходит ошибочное связывание аминокислот с ферментными комплексами либо аминокислоты конкурируют друг с другом за возмож-ность включения в молекулу антибиотика.

По такому же механизму происходит и образование таких широко известных антибиотиков, как пенициллины и цефалоспорины. Основу молекулы составляют L-цистеин, D-валин и L-α-аминоадипин.

Первым этапом биосинтеза считается образование трипептида, который последовательно превращается в моноциклический β-лактам, затем в изопенициллин N и 6-аминипенициллановую кислоту (6-АПК).Последняя является исходной при получении полусинтетических пенициллинов. При биосинтезе цефалоспоринов процесс происходит сходным образом до образования изопенициллина N, после появления этого соединения пути биосинтеза молекул расходятся. Дополнительными этапами являются гидроксилирование и ацетилирование молекул.

В группе антибиотиков, образующихся путем конденсации ацетатных и пропионатных единиц, обнаруживаются разные по структуре молекулы: изолированные или конденсированные ароматические, хиноны, макролиды, анзамицины. Реакции их образования близки к реакциям биосинтеза жирных кислот. Такие антибиотики образуются микроорганизмами под действием мультиферментного комплекса с участием молекулы-затравки, которая связывается с ним.

Принципиальные отличия синтеза жирных кислот от синтеза вторичных метаболитов-антибиотиков заключаются в следующем:

1) восстановление карбонильных групп может не происходить, и образуются ароматические структуры; если оно все же осуществляется частично до стадии гидроксильной группы или двойной связи, то образуется макротетралид;

2) при синтезе антибиотиков может использоваться метилмалонат и

образуются метилированные цепи;

3) активатором – инициатором процесса может быть не только уксусная кислота, но и пропионат, изовалериановая кислота, малониламид и другие соединения.

Структура антибиотика определяется главным образом длиной цепии степенью ее восстановленности. Если цепь образована исключительноиз ацетатных единиц и группы С=О не восстановлены, образуются поликетидные структуры. Согласно стерическим представлениям образуются

шестичленные кольца ароматической природы. Если карбонильная группа восстанавливается частично и циклизация затруднена, то получаютсялинейные структуры или макроциклы.

Один из примеров – образование тетрациклинов. Исходными структурными единицами являются восемь молекул малонил-КоА и одна молекула малониламин-КоА. Первым общим предшественником для всехтетрациклинов является метилпрететрамид, для его образования исполь-зуется примерно 50 ферментных систем, а последующие 11 реакций при-водят к образованию молекулы антибиотика. Исключительно важноезначение имеет наличие НАДФН+, необходимыми являются три молекулы – продукт пентозофосфатного пути утилизации глюкозы. Следовательно, они образуются раньше, чем используются для биосинтеза антибиотика. Был постулирован тот факт, что чем ниже уровень реакций вЦТК, тем более высоким является выход тетрациклина. Считают, чтопродуктивный штамм имеет дефект в энергетическом обмене, в результате чего усиливается утилизация уксусной кислоты для синтеза тетрациклина.

Ферменты, участвующие в биосинтезе антибиотиков, могут бытьразделены на три группы:

1) образующие и модифицирующие промежуточные продукты метаболизма, которые являются исходными для синтеза данного антибиотика. Такие продукты образуются путем конденсации первичных предшественников, например АсКоА, который может быть превращен в мевалоновую кислоту, поликетидные структуры;

2) катализирующие образование первичных предшественников, например малоната, метилмалоната, их ацилированных производных;

3) образующие первичные метаболиты, которые затем включаются всинтез вторичных, например ферменты биосинтеза валина и цистеина,аминокислот, составляющих молекулу антибиотика.

Относительно механизма, который обусловливает образование антибиотика именно в идиофазе, можно сказать, что синтез ферментов, ответственных за это в период трофофазы, подавлен, после ее окончаниядолжна наступить дерепрессия их синтеза. Возможны несколько механизмов обеспечения данного процесса:

1. Индуктор, дерепрессирующий гены биосинтеза, должен накапливаться после окончания роста культуры или добавляться извне. В настоящее время описаны несколько химических веществ, которые рассматриваются как регуляторы внутриклеточных процессов, в том числе иантибиотикообразования. Они способны действовать одновременно на

несколько процессов. Например, косинтетический фактор I (Streptomyces

aureofaciens) способен индуцировать образование хлортетрациклина у

малоактивного штамма, 1 мкг его индуцирует образование 50 000 мкг/мл

антибиотика.

Помимо неспецифических, известны и специфические регуляторы

процесса образования антибиотиков. Это гены – регуляторы соответст-

вующих оперонов, например биосинтеза стрептомицина (strR) и спекти-

номицина (srmR). Их белковые продукты связываются с ДНК в области

промоторов и активируют структурные гены.

2. В трофофазе конечный продукт первичного метаболизма по типуобратной связи вызывает подавление одной или нескольких реакций напути синтеза антибиотика. Истощение этого продукта приводит к дерепрессии генов, ответственных за синтез антибиотиков – продуктовидиофазы. Репрессия синтеза антибиотика конечным продуктом возможна в двух вариантах: сам антибиотик является тем метаболитом, который угнетает активность определенного фермента. Например, прибиосинтезе хлорамфеникола, на этапе присоединения азотсодержащегорадикала, образующийся продукт может подавлять активность ферментов начальных этапов.

Иная ситуация наблюдается при биосинтезе пенициллина. В этомслучае ингибитором является лизин, т. е. один из продуктов первичногометаболизма, который ингибирует активность гомоцитратсинтазы – первого фермента, который участвует в образовании аминоадипиновой кислоты, включающейся в молекулу антибиотика.

3. Рост на легкоутилизируемом источнике углерода ведет к подавлению активности генов в идиофазе вследствие катаболитной репрессии.

Истощение источника углерода приводит к дерепресии генов. Было от-мечено влияние явления катаболитной репрессии на биосинтез пенициллина: добавление глюкозы к культуре Penicillum в высоких концентрациях приводит к снижению уровня синтеза антибиотика. На практике дляустранения подобного явления глюкозу вводят в среду дробно. Катабо-литной репрессии подвержен и синтез многих пептидных антибиотиков.

4. Синтез вторичных метаболитов (антибиотиков) подавляется высоким энергетическим зарядом в клетке. Истощение АТФ приводит к дерепрессии генов их биосинтеза.

5. РНК-пролимераза во время трофофазы может осуществлятьтранскрипцию только генов, ответственных за синтез продуктов трофофазы, и не может присоединяться к промоторам генов, активных во время идиофазы. После завершения трофофазы происходят конформационные изменения РНК-полимеразы, и она способна присоединяться к промоторным участкам соответствующих генов и инициировать синтез ферментов биосинтеза вторичных метаболитов.

2. Общая характеристика и классификация аминогликозидных антибиотиков

Аминогликозидные антибиотики, которых в настоящее время на-считывается около сотни, по своей значимости занимают второе после β-лактамных место. Относясь к антибиотикам с широким спектром действия, аминогликозиды используются для лечения таких инфекционных заболеваний, как туляремия, чума, коклюш, туберкулез. Стрептомицин может быть использован в сельском хозяйстве для борьбы с заболеваниями растений: бактериальным увяданием фасоли, ожогом косточковых. Антибиотики являются бактерицидными.

С точки зрения химической структуры все соединения данной группы могут быть разделены:

1) на стрептомицины, имеющие в качестве агликонового фрагмента стрептидин, не содержащий NH2-группу, которая замещена на гуанидиновую, и имеющие пентозы с разветвленной цепью;

2) 2-ДОС (дезоксистрептамины) – в качестве агликонового фрагмента присутствует дезоксистрептамин, к которому гликозидной связью могут быть присоединены два сахара (пентозы и гексозы) по разным положениям;

3) фортамины, содержащие неизвестный ранее агликон, названный

фортамином, и углеводный фрагмент;

4) сорбистины, содержащие нециклический агликон сорбитол и один углеводный фрагмент.

Таким образом, аминогликозиды – это соединения, содержащие

аминосахара и сахара, соединенные гликозидной связью с агликоновым

фрагментом. С другой стороны, в зависимости от устойчивости к действию инактивирующих ферментов, можно выделить аминогликозидыпервого (стрептомицин, канамицин, неомицин, мономицин) и второго(гентамицин) поколений.

Для биолога исследование аминогликозидов может быть интересно

со следующих позиций:

1) продукция данных антибиотиков наблюдается у представителей

не менее шести различных родов бактерий, в частности у Pseudomonas,

Bacillus, Streptomyces, Micromonospora или других редких родов актино-мицетов, что позволяет рассмотреть вопрос о локализации генов биосинтеза и биогенезе молекулы антибиотика;

2) структура молекулы предполагает широкие возможности дляее

модификации, что используется в создании новых препаратов путем му-тасинтеза;

3) именно для продуцентов стрептомицина обнаружен фактор А иустановлена его регулирующая роль в процессах биосинтеза;

4) изучение функционирования рибосом и регуляция биосинтезабелка;

5) изучение общих механизмов устойчивости, особенно за счет продукции инактивирующих ферментов, и создание антибиотиков, у которых экранированы подверженные их действию активные группы

Поступление в клетку аминогликозидов осуществляется с использованием пориновых каналов наружной мембраны грамотрицательныхбактерий. Это согласуется с тем, что аминогликозиды являются гидрофильными поликатионными соединениями, что облегчает их транспортчерез заполненные водой каналы. Общим положительным зарядом молекулы объясняется также и способность некоторых аминогликозидов вытеснять из наружной мембраны катионы Mg2+, связывающие молекулы

липополисахаридов. В результате этого частично дезорганизуется мембрана, что приводит к усилению поступления аминогликозидов через наружную мембрану. Такое явление получило название «самопромотирования», и в зависимости от роли, которую играют катионы Mg2+ в поддержании целостности наружной мембраны, для различных бактерийоно выражено в разной степени. Можно отметить, что высокие концентрации Mg2+ отрицательно сказываются на антимикробном действииаминогликозидов.

Поступление аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану является сложным, многоступенчатым процессом, идущим с затратами энергии. Его можно разделить на три фазы:

I – фаза связывания антибиотика с наружной поверхностью цито-плазматической мембраны (ионное связывание). Никакие механизмы ре-зистентности клеток не влияют на ее осуществление;

II – фаза медленного поглощения, в результате которого через цито-

плазматическую мембрану в клетку проникает незначительное количество антибиотика, не вызывающее летального исхода, но индуцирующее

наступление фазы III;

III – индукция массивного поглощения антибиотика. Именно наэтой стадии наступает летальный эффект для чувствительных клеток.

Потребность в энергии на двух последних стадиях требует транспорта электронов по дыхательной цепи. Относительно веществ – переносчиков аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану в настоящее время сложилось устойчивое мнение, что это хиноны либо какие-то связанные с ними вещества. По крайней мере для E. coli показано, что аминогликозиды в субингибирующих концентрациях блокируют функционирование цикла трикарбоновых кислот. Исходя из этого факта и объясняют отмеченное еще С. Ваксманом в 1950-х годахявление, которое заключается в том, что в аэробных и анаэробных условиях наблюдаются резкие различия в активности аминогликозидовпо отношению к клеткам микроорганизмов.

3.Спектр действия антибиотиков: роль и значение отдельных структур клеток

 По спектру действия антибиотики делятся на такие группы:

1.противобактериальные узкого спектра, которые активны в отношении грамположительных бактерий: природные пенициллины, некоторые макролидные;

2.противобактериальные широкого спектра действия: тетрациклины, аминогликозиды;

3.противотуберкулезные: рифампицин;

4.противогрибковые: нистатин, леворин;

5.противоопухолевые: актиномицины;

6.антипротозойные: фумагиллин.

К характеристикам антибиотической активности относится и такая, как спектр антибиотической активности (действия) – группа организмов, рост которых подавляется данным соединением. Различная активность антибиотиков в отношении микро-, а такжемакроорганизмов может быть связана с разными факторами.

Во-первых, она зависит от различной проницаемости клеточных оболочек для поступления антибиотиков. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий устроена более сложно, нежели грамположительных, из-за наличия наружной мембраны. Вероятно, именно это привело к тому, что последние в норме более чувствительны к большинству антибиотиков. Если же у грамотрицательных бактерий удалить наружную мембрану, то чувствительность к антибиотикам изменится. Устойчивость грамотрицательных бактерий за счет наличия наружной мембраны носит название intrinsic, что значит «природная, естественно присущая».

Во-вторых, поступая в клетку, антибиотик должен проникнуть через липофильную наружную и внутреннюю мембраны, гидрофильный пептидогликан и попасть в гидрофильную цитоплазму. В этом случае говорят о том, что степень гидрофильности антибиотика должна быть подходящей. В зависимости от этого свойства может быть задействовано несколько механизмов поступления антибиотиков, в том числе – активный и пассивный транспорт, использование транспортных систем для других соединений.

Действие антибиотиков на бактериальные клетки определяется их способностью проникать через наружную мембрану. Основные сведения о структуре наружной мембраны были получены в 70–80-х годах ХХ столетия и касались в основном представителей кишечной группы бактерий и псевдомонад. Основными компонентами наружной мембраны являются липополисахариды ( ЛПС), фосфолипиды, липопротеины и мембранные белки. Наружная и внутренняя поверхность мембраны асимметричны: наружная часть представлена преимущественно ЛПС и белками, внутренняя – фосфолипидами и белками. Каждое из этих соединений отдельно и все вместе могут либо способствовать (или обеспечивать), либо препятствовать поступлению антибиотиков.

ЛПС-компоненты наружной мембраны связаны между собой через катионы Mg2+. Удаление этих катионов усиливает отталкивание между соседними участками (молекулами) ЛПС и ЛПС и кислыми белками, вследствие этого обнажаются участки поверхности, и их место могут занимать фосфолипиды из нижнего слоя и облегчать поступление гидрофобных (липофильных) веществ. Доказательством тому, что ЛПС и липиды могут быть связаны с поступлением антибиотиков в клетку (например, β-лактамных), является то, что чувствительность к ним возрастает после обработки ЭДТА. Кроме того, известны так называемые «шероховатые» (deep rough) мутанты, которые характеризуются изменением ЛПС за счет укорочения полисахаридной части молекулы, что усиливает поступление гидрофобных веществ. В качестве примера можно рассматривать и повышенную чувствительность N. gonorrhaeae к β-лактамам.

Вторым путем поступления антибиотиков в клетку является система, обеспечиваемая белками. Основную роль в данном случае играют белки-порины. Помимо пориновых белков в клеточной стенке обнаруживаются липопротеид Брауна, состоящий из 58 аминокислотных остатков и связанный с пептидогликаном, и белок ompA, или главный белок наружной мембраны, поддерживающий ее стабильность, выполняющий функцию рецепторов для бактериофагов, бактериоцинов и участвующий в конъюгации. Можно отметить также наличие ряда минорных белков и белков, обнаруживаемых при особых условиях культивирования.

Белки-порины образуют на наружной поверхности клетки три канала, которые в нижней части наружной мембраны сливаются в один. Каналы заполнены водой, и, следовательно, через них осуществляетсятранспорт гидрофильных веществ. Количество пориновых каналов может достигать 10⁵ на клетку, молекулярный вес соответствующих белков – 30–40 тыс. Д, у E. coli их три типа – ompС, ompF, phoE. Между отдельными бактериями существуют различия в типах пориновых каналов. Синтез omp-белков регулируется продуктами генов ompR и envZ. Продукт гена envZ реагирует на изменение осмолярности среды и может фосфорилировать белок ompR, который в свою очередь изменяет транскрипцию генов всего оперона.

К специфическим особенностям и характеристикам пориновых белков, влияющим на поступление антибиотиков, можно отнести следующие:

1) у различных бактерий может быть различное количество типов пориновых белков и, соответсвенно, различное число каналов;

2) пориновые каналы имеют различный диаметр;

3) в зависимости от условий внешней среды (или условий культивирования) каналы определенных типов могут функционировать или нет.

Одной из существенных характеристик, влияющих на поступление веществ по каналам, является их диаметр. Формально эта величина колеблется незначительно – от 1,08 до 1,16 Е, но для поступающих веществ это имеет большое значение. Кроме размеров поступающих молекул, диаметр определяет также и создание «гидрофильных» условий: чем больше диаметр, тем дальше располагаются друг от друга выстилающие канал молекулы воды и тем легче осуществляется транспорт гидрофильных веществ. Условия культивирования могут влиять на синтез белковпоринов.