1. Образование антибиотиков в естественных и лабораторных условиях. Вещества предшественники для биосинтеза антибиотиков
 Скачать 0.99 Mb.
|
|
-ингибиторы ферментов (ДНК-полимераз, РНК-полимераз и др.). К соединениям – ингибиторам активности ферментов, участвующим в репликации и транскрипции ДНК, относятся высокоактивные бактерицидные синтетические химиотерапевтические средства широкогоспектра действия, получившие название хинолонов и фторхинолонов. Препараты группы хинолонов (налидиксовая кислота) предложены к использованию в 1962 году, фторхинолоны – в 1978–1980 годах. В соответствии с активностью среди препаратов данной группы нефторированные соединения относят к I и II поколениям, фторированные производные делят на препараты III и IV поколений. Сравнивая общую структуру хинолонов и фторхинолонов, можно отметить, что принципиальными изменениями, влияющими на антибактериальную активность, являются наличие атома фтора в положении 6 (в цикле В) и наличие в цикле А шестичленного цикла с кето- и карбоксильной группой по отношению к азоту. Далее принципиальным является также наличие в циклеВ заместителей по 7 положению (пиперазиновый цикл). В настоящее время получены ди- и трифторированные хинолоны, однако улучшение их свойств требует и специфических заместителей по другим положениям. На данный момент в практике используется 15 препаратов. Поступление в клетку препаратов группы хинолонов определяется их гидрофобностью, а также способностью взаимодействовать с катионами наружной мембраны. Считается, что нефторированные соединения, которые являются гидрофобными, поступают непосредственно через слой фосфолипидов и липополисахаридов, а фторированные – через пориновые каналы, например ompF. Взаимодействие с катионами магния нарушает целостность мембраны, и, следовательно, используется механизм «самопромотирования». Через цитоплазматическую мембрану антибиотик поступает путем диффузии через фосфолипидные слои, создается градиент концентрации между ее наружной и внутренней поверхностью. Поступление антибиотиков не требует затрат энергии. Механизм действияантибиотиков был расшифрован в середине 1970-х годов, и долгое время считалось, что основной мишенью является ДНК-топоизомераза II, которая присутствует и у про- (ДНК-гираза II), и у эукариот, но имеет различную структуру. Фермент является тетрамерным белком и состоит из двух субъединиц А и В, которые катализируют строго определенные этапы в процессе формирования необходимой укладки ДНК в хромосоме: 1) разрыв спирали ДНК и образование комплекса ДНК + субъединица А; 2) отрицательная спирализация, энергозависимый процесс, гидролиз АТФ в присутствии Mg2+ – субъединица В; 3) восстановление двойной спирали, формирование окончательной укладки ДНК – субъединица А. Существует несколько моделей молекулярных механизмов действия антибиотиков, принципиально не отличающихся между собой. Прежде всего, отмечают, что сходства между ДНК, АТФ и фторхинолонами не существует, следовательно, не может быть конкурентного ингибирования. Скорее всего, молекулы хинолонов связываются непосредственно с однонитевой ДНК, образуемой гиразой, и реагируют с азотистыми основаниями за счет образования водородных связей своих 3-карбокси- и 4-оксогрупп. Возможно, что хинолоны стабилизируют связывание ДНК и гиразы, обусловливая конформационные изменения комплекса или препятствуя внутренней подвижности субъединиц гиразы. Это происходит перед разрывом ДНК, в результате прекращается не только репликация, но и транскрипция. В последнее время учитывают, что фторхинолоны могут влиять и на ДНК-топоизомеразу IV, обеспечивающую расщепление цепей после завершения репликации. ДНК-топоизомераза IV состоит из четырех полипептидных цепей, обозначаемых С2F2. При этом у грамотрицательных бактерий более чувствительной является топоизомераза II, а у грамположительных – топоизомераза IV. Гены, кодирующие синтез топоизомераз, обозначаются Gyr A, Gyr B и Par A, Par B соответственно. После поступления в клетку и взаимодействия с ДНК-гиразой происходит следующее: - нарушение биосинтеза белка, индукция белков SOS-ответа (нарушение деления клеток, образование филаментов); -при высоких концентрациях антибиотика наступает необратимое нарушение деления, глубокие структурные изменения в ядре и цитоплазме клеток и их гибель. Отмечая бактерицидный эффект действия, указывают, что хинолоны и фторхинолоны в высоких концентрациях ингибируют биосинтез белка и РНК. В качестве последствий действия антибиотиков всех типов отмечают механизм Аin vitro (парадоксальный эффект): снижение бактерицидной активности, так как при таких концентрациях подавляется синтез белка и РНК. Такой эффект может быть и при совместном действии с ингибиторами синтеза белка (тетрациклином, хлорамфениколом). Другой механизм действия В – сохранение бактерицидной активности в условиях подавления синтеза белка и РНК. Он показан для некоторых препаратов и, наряду с механизмом А, проявляется или отсутствует в зависимости от вида или штамма бактерий. Наконец, некоторые препараты могут проявлять свое действие в отношении неделящихся клеток, находящихся в буфере (механизм С). В механизме действия следует учитывать и эффект на клетку суббактериостатических концентраций антибиотиков: снижаются адгезивные свойства бактерий, подавляется индукция экзо- и эндотоксинов и ферментов, снижаются вирулентные свойства, повышается чувствительность клеток к фагоцитозу. Лечебные свойства фторхинолонов повышаются в присутствии аминогликозидных антибиотиков, что объясняется общими путями поступления, нарушением ori репликации; антагонистическими являются препараты – ингибиторы биосинтеза белка и РНК; индифферентными – -лактамные антибиотики. В настоящее время описаны три механизма устойчивости к фторхинолонам, хотя и отмечают, что спонтанные мутации возникают с низкой частотой – 10–9–10–11. Наиболее важным считают тип мутаций, приводящий к изменению ДНК-гиразы. Эти мутации являются хромосомальными и определяют устойчивость ко всем хинолонам и фторхинолонам. Наиболее высокий уровень резистентности обеспечивается мутациями в субъединице А, в этом случае фиксируют изменения в соответствующих участках белка, так называемых «хинолоновых карманах». Причиной развития устойчивости может быть и снижение проницаемости наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Эти мутации затрагивают Omp-белки или липополисахариды. У белков изменяются некоторые свойства (молекулярная масса) либо некоторые типы отсутствуют вовсе. В липополисахаридах отмечают укорочение длинноцепочечного компонента – О-полисахарида. Третьей причиной возникновения резистентных форм следует считать активный выброс (efflux) антибиотика из клетки, обнаруженный у P. aeruginosa. Данный процесс обеспечивается белками оперона mex – opr, что и приводит к резкому снижению внутриклеточного содержания антибиотика. Следует также отметить, что существуют ингибиторы функционирования и субъединицы В ДНК-гиразы. Это антибиотики новобиоцин S. niveus) и коумермицин (S. sphaeroides). Среди положительных моментов использования данных синтетических препаратов отмечают низкую частоту формирования резистентных форм; незначительные побочные реакции: препараты снимают в 2 % случаев. Ограничено использование препарата в педиатрии, так как может нарушаться рост ювенильных хрящей и развитие скелета. На базе фторхинолонов и цефалоспоринов создаются новые лекарственные формы – пролекарства (prodrugs). Между двумя молекулами формируется ковалентная связь. Попадая в клетки совместно, каждый компонент реагирует со своей мишенью. Накапливаются в клетке в больших концентрациях, чем каждая составляющая по отдельности. 39. Значение продукции антибиотиков для штаммов – продуцентов и процесс дифференцировки клеток Необходимость биосинтеза антибиотиков как продуктов вторичного метаболизма для штаммов-продуцентов может быть объяснена исходя из нескольких предположений: 1) антибиотики – остаточные токсичные продукты метаболизма, которые именно в таком виде должны быть удалены из клетки. Подобная точка зрения вряд ли может быть справедливой по нескольким причинам: слишком многие вторичные метаболиты обладают биологической активностью, а предшественниками их образования являются весьма важные первичные метаболиты, на синтез которых затрачивается много энергии и которые могли бы быть использованы клеткой; 2) несомненным является значение продукции антибиотиков как фактора, способствующего выживанию продуцентов. Особенно справедливо это предположение для медленно растущих видов, например актиномицетов; 3) наиболее распространенной в настоящее время является точка зрения, в соответствии с которой считается, что антибиотики синтезируются не только и не столько для конкуренции, а для изменения метаболизма собственного продуцента. Их образование в определенной стадии роста может приводить к блокированию специфических функций обмена и к индукции клеточной дифференцировки. Весьма подходящей кажется такая гипотеза для антибиотиков с пептидной структурой или ионофорных антибиотиков. Процесс дифференцировки клеток микроорганизмов затрагивает разные уровни организации: клеточный и субклеточный, колониальный и популяционный – и осуществляется во временном и пространственном отношениях. Изменения, происходящие при продукции антибиотиков на клеточном и субклеточном уровнях, лучше описаны и охарактеризованы для грибов и актиномицетов. Для штаммов Actinomyces spp. по мере перехода к образованию ан-тибиотиков наблюдается утолщение клеточной стенки, в цитоплазме об-разуются полисомы, развиваются внутрицитоплазматические мембранные структуры. Такие мембранные структуры ограничивают продуцируемый антибиотик (тетрациклин) от внутриклеточного содержимого,защищая тем самым клетки, и способствуют выделению антибиотика. Изменения такого же рода наблюдаются и у продуцента хлорамфеникола: наличие электронно-прозрачных мембранных образований связываютс выделением антибиотика в среду. Для продуцента линкомицина(S. roseolus) в период наибольшей продуктивности мицелия характерноутолщение клеточной стенки, образование молодых гиф внутри материнской. Для B. polymyxa, образующего полимиксин В, показано, что в продуцирующих клетках изменяется структура клеточной стенки, усложняется мезосомальный аппарат. Начало процесса дифференцировки в эндоспоры коррелирует с высоким содержанием антибиотика. На колониальном уровне зависимость между продукцией антибиотиков и дифференцировкой также более четко прослеживается для грибов и актиномицетов. Колонии продуцентов обычно более компактные, складчатые, нередко имеют различия в окраске воздушного и субстратного мицелия, а также способности продуцировать растворимый пигмент. У большинства штаммов-продуцентов потеря способности образовывать воздушный мицелий соответствует потере способности продуцировать антибиотик. Варианты с нарушенной дифференциацией (олигоспоровые, аспорогенные) характеризуются пониженной антибиотической активностью или лишены ее. У ряда грибов суперпродуцентов отмечается снижение темпов роста колоний и споруляции.Для мицелийобразующих продуцентов отмечают разный характерроста мицелия в различных частях колонии. По профилю колонии отмечают изменение дегидрогеназной, фосфатазной активности, распределения белка и РНК. Для продуцентов, обладающих флуоресценцией, с помощью методов локализационно-топографической люминесценции выявлено, что основная масса антибиотика в колонии локализуется в субстратном мицелии (тетрациклин, D-актиномицин). На популяционном уровне связь между дифференцировкой и обра-зованием антибиотика заключается в том, что до начала образования ан- тибиотика культура проходит ряд ростовых фаз, антибиотик синтезиру-ется только после наступления соответствующей, когда завершается синтез необходимых ферментов и предшественников. Как правило, обра- зование антибиотиков происходит в условиях, не благоприятных для роста продуцента. Следует учитывать, что образование антибиотика за- висит и от условий культивирования, и от внешних факторов. Для актиномицетов и грибов, продуцирующих антибиотики, характерна полицикличность развития, когда организм в процессе ферментации проходит 2–3 генерации с частичным автолизом мицелия в каждой из них. У грибов это обусловлено образованием фрагментов гиф, конидий, артроспор, гемм, способных к прорастанию и последующему развитию новых поколений глубинного мицелия, что коррелирует с наибольшей продуктивностью. Для продуцентов цефалоспорина показано, чтомаксимальная способность к синтезу антибиотиков наблюдается на ста-дии артроспор. Несомненный практический интерес представляют вопросы изучения защитных механизмов продуцентов от образуемых антибиотиков. Во-первых, гены резистентности продуцентов могут передаваться другим природным бактериям и в последующем распространяться среди клинических изолятов. Во-вторых, наличие и изучение этого процесса у продуцентов имеет практическое значение при создании штаммов- суперпродуцентов. В-третьих, интересным является исследование вопросов о возможности использования полученных сведений при отборе продуцентов. Тем не менее следует отметить, что существуют различия в механизмах защиты у промышленных штаммов суперпродуцентов и их природных аналогов. По отношению к продуцирующему штамму с 1979 года все известные в настоящее время антибиотики принято делить на две группы: 1) ксенотоксические, или действующие только на метаболизм других штаммов и не имеющие мишени в клетках собственного продуцента; 2) аутотоксические, или имеющие мишени для действия в клетках собственного продуцента и, следовательно, проявляющие определенные защитные механизмы. Очевидно, что такое деление является условным. Например, для β-лактамных антибиотиков, продуцентами которых являются штаммы Penicillum, образуемые антибиотики являются ксенотоксичными, но по отношению к продуцентам-бактериям – аутотоксичными. К чисто ксенотоксическим антибиотикам относятся антимицины – ингибиторы функционирования дыхательной электронтранспортной це- пи митохондрий за счет взаимодействия с убихинон-цитохромными ферментами. Продуцентом данной группы антибиотиков являются бак- терии S. antibioticus. Анизомицины – ингибиторы биосинтеза белка на 80S рибосомах, а продуцируются они S. griseolus и S. roseochromogenes. Актиномицеты S. cacaoi продуцируют полиоксины – антибиотики, инги- бирующие биосинтез клеточной стенки грибов. Такие антибиотики, как бицикломицин и глобомицин, ингибируют функционирование наружной мембраны грамотрицательных бактерий, однако продуцируются стреп- томицетами, т. е. бактериями грамположительными. 41. Система контроля качества при получении лекарственных препаратов.   42. Ионофорные и каналообразующие антибиотики, их характеристика. Группу ионофорных антибиотиков составляют несколько различных в химическом отношении соединений, общим для них является то,что они способны облегчать перенос через мембраны различных неорганических катионов. Эти соединения не нашли широкого применения в лечебной практике в силу неспецифического действия и токсичности, однако они используются в научных исследованиях как инструмент для определения функций мембран. Типичный представитель таких антибиотиков – валиномицин. Это депсипептидное циклическое соединение. Из 12 компонентов кольца аминокислоты располагаются таким образом, что попарно чередуются D- и L-формы, а также амино- и оксикислоты. Если аминокислот шесть (эн- ниатин), то каждый компонент кольца имеет другую конфигурацию. С катионами калия, для которых валиномицин является высокоспецифическим переносчиком, образуется комплекс, в котором (как показал рент-геноструктурный анализ), калий соединяется с внутренней частью молекулы шестью кислородными связями. Кольцо имеет такие размеры, которые позволяют идеально разместиться в нем только ионам калия, причем без гидратной оболочки. Общий заряд всего комплекса положительный. Валиномицин способен образовывать комплексы и с катионами натрия, но их размеры меньше, и константа сродства примерно в тысячу раз ниже. Действие валиномицина на мембрану обусловлено высокой специфичностью комплекса и его гидрофобностью снаружи. Липофильная молекула калий – валиномицин с общим положительным зарядом перемещается через мембрану путем простой диффузии, удаляя катионы калия из клетки. Процесс очень эффективен: одна молекула может переносить до 104 ионов в минуту. Выкачивание катионов калия в конечном итоге приводит к ингибироя к группе макротетралидов. За счет наличия циклической структуры он также позволяет заключить катион калия (или другие однозарядные катионы – NH4, Na+) в оболочку из восьми атомов кислорода. Наружная поверхность является липофильной. Антибиотикам с линейной структурой – монензину и нигерицину –также присуща способность транспортировать катионы калия и натрия со-ответственно. В данном случае конформация линейной молекулы изменяется таким образом, что она как бы складывается, и карбоксильная группа на одном конце способна образовывать связь с гидроксильной группой на другом. Внутри такой структуры находятся катионы за счет формирования связей с кислородом. Монензин имеет важное практическое значение, так как является средством, предотвращающим развитие кокцидиоза у кур. При этом использование его не ограничивается – устойчивые формы появляются относительно редко, а пищеварение улучшается. К антибиотикам-ионофорам, образующим в мембране поры, относится грамицидин А. Это линейная молекула, в которой наблюдается чередование D- и L-форм аминокислот. С одним концом полипептида связан этаноламин, с другим – формильная группа. По характеру переносимого иона это родственное валиномицину соединение, однако механизм процесса совершенно иной. При выяснении его действия учитывали тот факт, что в системе in vitro липидная мембрана, разделяющая растворы с различной концентрацией калия, при определенной температуре переходит в твердое состояние. В таких условиях перенос катионов калия с участием валиномицина (также специфического переносчика для них) резко снижается или не наблюдается вообще. В случае же использования грамицидина А проведение калия происходит, скорее всего, за счет образования пор. Спиральная структура молекулы изменяется таким образом, что внутренняя поверхность становится гидрофильной, а наружная – липофильной. Одна молекула антибиотика не имеет достаточной длины, чтобы образовывать пору через весь липидный слой, и считают, что две молекулы соединяются «голова к голове». Размеры канала таковы, что по нему могут перемещаться небольшие одновалентные катионы. При этом участок канала, где в данный момент находится ион, становится шире и короче. Время жизни такой поры мало (около одной секунды), однако она весьма активна в отношении транспорта: через отверстие может переноситься до 107 катионов калия. Антибиотики-полиены относятся к группе макролидных и имеют большое лактонное кольцо. Гидрофобная часть молекулы содержит систему сопряженных двойных связей (4–7). Противоположный участок яляется гидрофильным за счет наличия ОН-группировок. В медицине используются нистатин, амфотерицин В, относящиеся к противогрибковымпрепаратам. Особенностью полиеновых антибиотиков является то, что они действуют только на мембраны со стеролами. Однако в некоторых случаях они могут взаимодействовать и с холестерином, вызывая побочное действие на макроорганизм (гемолиз, нефрит). Обобщенная модель образования поры (для амфотерицина В) в мембране и нарушение функций последней выглядит следующим образом. Молекула антибиотика своим полярным концом, представленным аминосахаром и карбоксильной группой, заякоривается на поверхности мембраны. Участок молекулы с ОН-группами взаимодействует с таким же участком другой молекулы, а липофильный участок с двойными связями реагирует с углеводородной частью мембранных липидов. Десять молекул амфотерицина образуют замкнутый канал со скрытыми полигидроксильными группами и свыступающими липофильными. Между двумя молекулами антибиотика располагается молекула стерола. Из этого следует объяснение повышенной чувствительности мембран, содержащих стеролы, к полиенам: наблюдается повышенная ригидность углеводородных цепей фосфолипидов в мембране, что усиливает взаимодействие между антибиотиками и стеролами. Как уже отмечалось, заякоренная часть молекулы остается на поверхности мембрана – водная среда. Липофильный остов молекулы располагается вдоль цепей жирных кислот. В одном липидном слое образуется полупора, в двойном бислое – полная. Две полупоры образуют полную за счет водородных связей. Диаметр образованной поры соответствует по размерам молекулам глюкозы, следовательно, через нее могут удаляться вещества и меньшего размера: ионы калия, аммония, нуклеозиды, некоторые аминокислоты. Потеря жизнеспособности происходит не только за счет потери тех или иных компонентов цитоплазмы, но и за счет снижения рН и коагуляции белков при поступлении водородных ионов. Известно, что пора может находиться в трех состояниях: открытом, т. е. проводящем, короткоживущем закрытом и непроводящем (неактивном). В активном проводящем состоянии каналы могут находиться 220–260 с, а за 1 с переносить 2,5–10 · 106 ионов. Антибиотик филипин, молекула которого не имеет полярной части, взаимодействует с мембранами за счет образования стопок, представленных параллельными рядами молекул. В конечном итоге образуется крупный агрегат диаметром 150–200 Å, расположенный внутри мембраны. Два таких агрегата образуют сверхагрегат, в котором гидрофильные стороны повернуты друг к другу. Образование таких крупных включений в мембране ведет к ее разрушению. |