1. Образование антибиотиков в естественных и лабораторных условиях. Вещества предшественники для биосинтеза антибиотиков
 Скачать 0.99 Mb.
|
|
лактулоза – синтетический дисахарид. Микрофлора толстой кишки гидролизует лактулозу до молочной (в основном) и частично до муравьиной и уксусной кислот. Она способствует понижению рН содержимого толстого кишечника, снижению концентрации гнилостных бактерий, стимулирует перистальтику кишечника и усиливает рост бифидо- и лактобактерий; - кальция пантотенат участвует в процессах ацетилирования и окисления в клетках, углеводном и жировом обменах, синтезе ацетилхолина, стимулирует образование кортикостероидов в коре надпочечников; - лизоцим способствует нормализации нарушений микрофлоры. наиболее активен в отношении грамположительных патогенных и условнопатогенных бактерий. Лизоцим обладает бифидогенным, имунномоделирующим, противовоспалительным действием, улучшает пищеварение, стимулирует метаболические процессы и эритропоэ, проявляет синергизм со многими антибиотиками. Симбиотики – комплексные препараты, содержащие пробиотик и пребиотик. Пробиотики – это препараты нормальной микрофлоры человека.пробиотики имеют в своем составе живые клетки специально подобранных штаммов микроорганизмов растительного или животного происхождения; они выживают в условиях кишечного окружения, непатогенны, нетоксичны, стабильны в течение длительного срока хранения. Механизм положительного влияния пробиотиков включает: - подавление микробных патогенов за счет продукции антибактериальных веществ, конкуренции за лимитируемые питательные вещества и сайты адгезии на кишечной стенке; - влияние на ферментативную активность кишечных микроорганизмов; - стимуляцию иммунной системы макроорганизма. Производят моновалентные препараты: бифидумбактерин (на основе Bifidobacterium bifidum), апилак (на основе Lactobacillis acidophillus), колибактерин (на основе кишечной палочки E. Coli M-17), лактобактерин (на основе Lactobacillus plantarum, fermentum).комплексные препараты, например бификол (Bifidobacterium и E. Coli M -17). За рубежом производя поливалентные (комплексные) препараты: симбиофтор, бификор, примадофилюс (содержит комплекс микроорганизмов симбионтов) и другие. Они предназначены в основном для профилактики и лечения дисбактериоза. Особенно широко применяют в клинике детских болезней (при острой дизентерии, сальмонеллезе, эшерехиозе, вирусных диареях, диатезе и др.). При несформировавшейся микроэкологической системы ЖКТ у детей применение препаратов пробиотиков оказывается очень эффективным. Препараты пробиотиков также применяют в комплексном лечении кишечных инфекций, энероколитах на фоне нарушения микрофлоры с дефицитом или полным отсутствием бифидофлоры и др.). Пробиотики также назначаются ослабленным людям после соматических заболеваний и по завершении лечения антибиотиками, лицам преклонного возраста, так как у них в связи с изменением гормонального статуса уменьшается количество бифидо- и лактобактерий. Действующим началом лактосодержащих препаратов являются живые лактобациллы, обладающие антагонистическим действием против широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий за счет продукции кислот, перекиси водорода, лизоцима и антибиотическихвеществ. локтобациллы выделяют ферменты, витамины, способствуют пищеварению, улучшают обмен веществ, обладают иммуномоделирующим действием, нормализуя естественную резистентность организма. Лактосодержащие препараты целесообразно назначать детям и взрослым при лечении ОКИ, хрогических заболеваниях ЖКТ с выраженными дисбиотическими явлениями, особенно в случае дефицита лактофлоры или при использовании этих препаратов в комбинированной терапии с антибиотиками . К лактосодержащим препаратам относится лактобактерин, апилакт, аципол, линекс, гастрофарм, биобактон. Среди колисодержащих препаратов следует отметить колибактерин, лечебное действие которого обусловлено антагонистической активностью кишечной палочки в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, включая шингеллы, сальмонеллы, протей и др., бификол и бифилор. Препараты из апатогенных представителей других таксономических групп или микробных метаболитов. В этой группе относятся препараты из апатогенных представителей родов Bacillus, Aerococcus и Saccharomyces. Из спорообразующих бацилл готовят препараты бактисубтил, споробактерин, бактиспорин и биоспорин. Лечебное свойство споровых препаратов обусловлено их выраженными антагонистическими свойствами против широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий, в том числе протеев, стафилококков и грибов рода Candida. Эти препараты содержат комплекс ферментов, стимулирующих пищеварение, способствуют лучшему усвоению пищи, содержат протеолитические и фибринолитические ферменты, чем способствуют очищению воспалительных очагов от некротических тканей. Наиболее известный представитель этой группы – это препарат Хилак-форте. Он содержит концентрат продуктов метаболизма бактерий тонкой и толстой кишки, в том числе метаболиты Lactobacillus acidophilus, L.helveticus, E-coli, Enterococcus faecalis, молочную и фосфорную кислоты, аминокислоты и другие вещества, способствущие нормализации рН, восстановлению водно-электролитного баланса, состава нормофлоры и поддержанию физиологической функции слизистой оболочки кишечника. 26. Характеристика гликопептидных антибиотиков, механизм действия и резистентность. Гликопептидные антибиотики синтезируются представителями различных редких родов актиномицетов: Amycolatopsisorientalis (ванкомицин), Actinoplanesteicomyceticus (тейкопланин), Proactinomyces. Используются антибиотики для лечения тяжелых кокковых инфекций, являются бактерицидными. Особенности структуры и механизма действия данных антибиотиков следующие: • молекулы антибиотиков крупные (1500–2000 Д), в них имеется значительное число ароматических фенольных колец (у ванкомицина – 5, у других – 7), имеется гептапептидный хвост, необычные сахара (ванкозамин, ристозамин); • действуют только на грамположительные бактерии, так как из-за больших размеров не способны проникать через наружную мембрану в клетки грамотрицательных бактерий; • механизм действия связан непосредственно с взаимодействием с N-ацетилмурамилпентапептидом. В данном случае принципиально важно наличие двух концевых остатков D-аланина. Если хотя бы один из них замещен на L-форму, связывания не происходит. Три другие аминокислоты в пентапептиде не влияют на взаимодействие с антибиотиком. Из-за больших размеров молекулы антибиотика считают, что концевые остатки D-аланина как бы «проваливаются» в молекулу антибиотика. Следует отметить, что молекула антибиотика экранирует субстрат (D-аланин-D-аланин) от ферментов – транспептидаз и карбоксипептидаз. В настоящее время описаны несколько механизмов резистентности к гликопептидным антибиотикам, касающихся в основном ванкомицина. Во-первых, это резистентность, обнаруженная у Enterococcus и связанная с наличием ряда белков. Синтез этих белков кодирует плазмида pIP 816, имеющая размеры 34 т.п.о. Важно, что детерминанты резистентности организованы в транспозон 1546, ограниченный инвертированными повто-рами, и, следовательно, способны передаваться между различными репликонами. В составе Tn 1546 обнаружены гены: • van A, 1029 п.о., продуктом которого является специфическая D-аланин-D-аланин лигаза. Она характеризуется низкой специфичностью по сравнению с хромосомным геном, отвечающим за включение в пентапептид D-аланина, и может включать, наряду с аланином, D-лактат. В результате этого образуются концевые фрагменты со структурой D-аланин- D-лактат, которые не связываются с ванкомицином; • van H, кодирующий специфическую дегидрогеназу для образования D-лактата, т. е. субстрата для ранее описанной реакции; • van Х, кодирующий специфическую гидролазу, гидролизующую димеры D-аланина, но не димеры D-аланина-D-лактата. Благодаря работе этих генов резко сокращается содержание группировок D-аланин-D-аланин по сравнению с D-аланин-D-лактат (1: 49). В составе плазмиды имеются и регуляторные гены vanS и vanR. Белок VanS располагается в мембране, а его внутренний участок способен фосфорилироваться в цитоплазме при участии АТФ в результате воздействия на наружную часть внешнего сигнала. Подобный процесс приводит к передаче сигнала на белок VanR, который связывается с промоторным участком ДНК перед геном vanH, и запускает транскрипцию всех остальных. В качестве внешнего стимула выступает не сам антибиотик, а процесс подавления реакций трансгликозилирования и транспептидации. Во-вторых, резистентность, связанная с доступностью мишени, обнаружена у Staphylococcus. Клетки с таким типом резистентности характеризуются более толстыми стенками, имеющими иррегулярную структуру, на них хуже адсорбируются некоторые бактериофаги, они более устойчивы к лизоциму. Анализ белков клеточной стенки показал, что содержание одного из пенициллинсвязывающих (РВР-2) белков сильно повышено и обнаружены два новых белка – 35 и 39 Кд, с которыми и связывают устойчивость. 28. Общая характеристика тетрациклинов Тетрациклины – относительно небольшая группа химически весьма сходных соединений, состоящих из четырех конденсированных ароматических колец. Основная масса природных соединений этого класса обнаружена в 1948–1952 годах. Первым был выделен хлортетрациклин (S. aureofaciens), существует и другое его название – аурантин (ауреомицин), что свидетельствует об одном из его свойств – наличии золотистой окраски. Данный антибиотик под названием биовит используется в сельском хозяйстве как добавка в корм животных, что ускоряет рост, повышает привесы, снижает риск развития некоторых заболеваний. В1952 году при культивировании S. rimosus был выделен тетрациклин, хотя в настоящее время антибиотик получают, выращивая продуцент хлор-тетрациклина в условиях, когда к образующемуся антибиотику не присоединяется атом хлора (при добавлении барбитала). Тетрациклины являются антибиотиками широкого спектра действия, бактериостатическими в лечебной дозе. Всего описано 35 соединений данной группы, в клинике для лечения пневмоний, скарлатины, кишечных инфекций, бруцеллеза используются 3–5. Существуют как природные, так и полусинтетические (доксициклин, метациклин) соединения. Поскольку мишень для действия антибиотиков находится внутри клеток, встает вопрос о поступлении антибиотика в клетку. Первым барьером на этом пути является мембрана грамотрицательных бактерий. Тетрациклины – соединения в разной степени гидрофильные, поэтому принято считать, что канал OmpF у E. coli или аналогичные каналы у других бактерий – основной путь их поступления. Связывание с поверхностью микробной клетки, поступление через пориновые каналы и клеточную стенку не требует затрат энергии. Гораздо более спорным и менее изученным остается вопрос о посту-плении антибиотика через цитоплазматическую мембрану. Вывод о том,что поступление через мембрану является активным, энергозависимым процессом и осуществляется против градиента концентраций, основан, прежде всего, на том, что внутриклеточная концентрация антибиотика может в 10–100 раз превышать внеклеточную. Транспорт тетрациклина может быть связан с функционированием двух систем: протондвижущей и связанной с гидролизом фосфатной связи. Для некоторых бактерий (Staphylococcus, Streptococcus) показано, что компоненты системы транспорта являются термочувствительными и не функционируют при температуре 50–60 ºС, что указывает на возможную белковую природу переносчика. В отдельных случаях, учитывая сходство с оксалоацетатом и другими дикарбоновыми кислотами, рассматривают возможность поступления тетрациклина через систему транспорта С4 – дикарбоновых кислот. Рассматривая механизм действия тетрациклина, следует сразу же указать на тот факт, что антибиотик может связываться и с 80S рибосомами, однако в клетках макроорганизма антибиотик не накапливается, и не создается такая его концентрация, которая была бы достаточной для ингибирования биосинтеза белка. Сходный эффект описан также и для фузидиевой кислоты. В бактериальных же клетках считается установленным фактом (расшифровка механизма началась с середины 1950-х годов), что тетрациклин является ингибитором элонгации белковой цепи и препятствует связыванию очередной аа-тРНК. Предполагается, что фиксированная 30S субъединицей рибосомы молекула тетрациклина, возможно с участием катионов магния, находится в А-сайте и нарушает взаимодействие кодон – антикодон. Тетрациклин удерживается в связанном с рРНК состоянии за счет шести водородных, одной ионной связи, а также различных липофильных и слабых взаимодействий. Наиболее вероятно, что взаимодействие происходит в последовательности ГУ:ГЦ или ГЦ:АУ. Тетрациклин занимает участок, реагирующий с аминоацил-тРНК, фактором элонгации Tu и GTF. Связывание тетрациклина с рибосомой происходит в любом соотношении. На 30S субъединице обнаружено одно место специфического или сильного связывания, в результате которого блокируется биосинтез белка, и около 500 мест неспецифического связывания. В образовании места связывания антибиотика и рибосомы принимают участие минимум три белка (S7, S14, S19) и примерно 450 оснований 16S-рРНК. На 50S субъединице мест связывания тетрациклина не обнаружено. Устойчивость к тетрациклину может являться следствием различных механизмов, а гены резистентности могут быть локализованы как в составе плазмид, так и хромосомально, могут организовываться в транспозоны. В чувствительные клетки тетрациклин проникает с участием активных переносчиков, и его концентрация в клетке становится выше, чем в среде, а молекула антибиотика воздействует на А-сайт 30S-субъединицы. При устойчивости, связанной с наличием системы выведения(efflux) антибиотика из клетки, существует белок цитоплазматической мембраны, который с затратами энергии удаляет антибиотик, и его концентрация становится ниже внеклеточной и недостаточной для связывания с рибосомами. Устойчивость на рибосомном уровне связана с модификацией рибосом, в силу чего антибиотик не может быть долгое время связан с ними. Наконец, устойчивость вследствие внутриклеточной модификации антибиотика связана с его переходом в неактивную форму. Измененный тетрациклин затем диффундирует из клетки. Существует также устойчивость, связанная с потерей пориновых каналов и отсутствием транспорта антибиотика в клетки грамотрицательных бактерий. Устойчивость к тетрациклину у бактерий – довольно распространенное явление, поэтому его использование в клинике ограничено. В некоторых случаях клинические изоляты бактерий на 70–90 % являются устойчивыми к тетрациклину. 29.Поверхностно-активные в-ва, механизм их действия на клетку. Помимо антибиотиков, которые используются при приеме внутрь, всасывании и циркулировании в крови, часто возникает необходимость в использовании веществ, угнетающих рост микроорганимзов в целом, на поверхности тела или каких-либо объектов. Для обозначения таких веществ используют несколько названий: стерилизующие, дезинфицирующие, антисептические, биоцидные. Их использование входит в состав противомикробных мероприятий, под которыми понимают совокупность способов и методов уничтожения, подавления численности популяции и ограничения распространения потенциально патогенных для человека микроорганизмов. Антисептики – химические соединения, которые обладают противомикробным действием и используются для нанесения на кожу, слизистые оболочки, полости и раны в целях лечения и предупреждения развития местных инфекционных поражений и сепсиса. Существует 3 механизма противомикробного действия антисептиков: 1. Деструктивный механизм подразумевает разрушение структур и макромолекул клетки в присутствии антибиотика, что не позволяет им выполнять свои функции. 2. Окислительным механизмом 3. Антисептики, действующие по мембранатакующему механизму, могут вызывать разрушение входящих в состав мембраны полимеров, что приводит к лизису микробных клеток, или нарушает функции мембран (осмотическую проницаемость, перенос ионов через мембраны). Основная масса соединений такого рода – поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые могут быть разделены на три группы: катионные(четвертичные соединения аммония), анионные (щелочные мыла, желчные кислоты) и нейтральные. Антимикробное действие ПАВ зависит от типа соединения. Наибольшим бактерицидным эффектом обладают катионные ПАВ, промежуточным – анионные, слабым –нейтральные. Катионные ПАВ – уникальный класс дезинфицирующих веществ, в силу того что растворимы в воде, не имеют запаха, активны в высоком разбавлении в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, спор, нитчатых водорослей и других объектов. Амфифильная природа ПАВ позволяет им гидрофильной частью молекулы взаимодействовать с белками, нарушая их конформацию, а липофильной – с липидами. Разрушение бактериальных клеток под влиянием ПАВ происходит после адсорбции и проникновения их в клеточную мембрану, где они изменяют ее молекулярную организацию. Это сопровождается изменением проницаемости и осмотического равновесия, после чего наблюдается выход в среду внутриклеточного содержимого: катионов К+, аминокислот, веществ с максимумом поглощения в области 260 нм. Механизм устойчивости кПАВ можно рассматривать с точки зрения химической организации клеточных мембран микроорганизмов. Известно, что чем больше липидов содержится в клеточной стенке, тем выше их устойчивость к ПАВ. Для проявления устойчивости имеет значение, кроме общего количества липидов, их состав и расположение в мембране. Повышенную устойчивость к ПАВ туберкулезных бактерий связывают с наличием в составе их липидов особого гликолипида – корд-фактора. Одним из лучших катионных антисептиков является хлоргексидин. Это вещество активно в отношении широкого круга микроорганизмов в относительно низких концентрациях (10–50 мкг/мл), имеет низкую токсичность и проявляет слабое раздражающее действие на слизистую оболочку полости рта. При использовании в качестве полоскания действует на Streptococcus mutans, снижая вероятность кариеса; обладает способностью накапливаться в тканях, что говорит о пролонгированном действии. Может влиять как на цитоплазматическую, так и наружную мембрану бактерий. 30. Ингибиторы β – лактамаз и их практическое использование Ингибиторы β-лактамаз делят на две группы: обратимые ингибиторы и необратимые инактиваторы. В основе механизма действия обратимых ингибиторов лежит конкурентное ингибирование. В этом случае изменяется лишь сродство фермента к субстрату-антибиотику: происходит преимущественное связывание с ингибитором, что препятствует связыванию с субстратом. По такому механизму действуют антибиотики, которые с очень малой скоростью гидролизуются соответствующей β-лактамазой. Например, для цефалоспрориназ класса С – это клоксациллин, широкого спектра действия – азтреонам. В отношении некоторых β-лактамаз имеет место неконкурентноеингибирование. В этом случае ингибитор связывается с ферментом не в активном центре, а в другом участке. Такое ингибирование встречается относительно редко: например, ЭДТА, связывающая двухвалентные катионы, является неконкурентным ингибитором β-лактамаз класса В. Необратимые инактиваторы вызывают потерю активности фермента, которая не восстанавливается после удаления избытка ингибитора. К ним относятся: модификаторы аминокислот, вещества, ингибирующие активный центр фермента, суицидные ингибиторы. Модификаторы аминокислот – пара-хлор-ртуть бензоат (п-ХМБ) – ингибируют те β-лактамазы, у которых в активном центре важную роль играют остатки цистеина. Ингибиторами активного центра являются и вещества, сходные с субстратом, но имеющие высокоактивные группы. Они способны связываться с более чем одной аминокислотой в активном центре фермента и образовывать долгоживущие комплексы. Суицидные ингибиторы расщепляются при взаимодействии с ферментом за счет на-личия высокоактивных групп, образуются ковалентные связи, и происходит инактивация фермента. К таким инактиваторам относятся клавулановая и оливановая кислота, сульбактам и др. В качестве общих свойств ингибиторов β-лактамаз можно также рассматривать и следующее: 1) ингибитором может быть то соединение, чья фармакокинетика сходна с фармакокинетикой антибиотика, с которым она находится в комбинации; 2) не может быть создано ингибитора вообще, т. е. конкретное вещество действует на более или менее широкий круг лактамаз. Создание комплексных препаратов, содержащих ингибитор β-лактамаз, является одним из перспективных направлений при оценке качества и расширения спектра новых β-лактамных антибиотиков. Среди других задач подобного рода особенно важна разработка препаратов с расширенным спектром действия. Возникла данная проблема из-за возрастания в течение последних лет роли грамотрицательных бактерий в этиологии госпитальных инфекций, в появлении множественно резистентных штаммов и др. Этот процесс обусловлен совокупным действием ряда факторов: изменением нормальной микрофлоры человека под воздействием антибиотикотерапии вообще; применением лучевой терапии, цитостатиков, стероидных гормонов и других средств, снижающих реактивность больного организма. Такими препаратами стали полусинтетические пенициллины и цефа-лоспорины. Предпосылки для их получения были созданы в 1959 году, ко- гда Г. Бичем и К. Батчелор выделили ядро молекулы пенициллина – 6-ами- нопенициллановую кислоту (или Pen G), которая и послужила основой для синтеза препаратов с улучшенными свойствами. Одно из требований, которое предъявляется к таким препаратам, –улучшенная проницаемость через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. К немаловажным свойствам можно отнести и повышение связывания с ПСБ. Наконец, некоторые фармакокинетические показатели: незначительное связывание с белками сыворотки крови, меньшая ал-лергенность, стабильность в кислой среде желудка, всасываемость при приеме внутрь – относятся также к существенным при оценке качества вновь созданных препаратов. 32. Молекулярные механизмы действия аминогликозидов Аминогликозидные антибиотики, которых в настоящее время насчитывается около сотни, по своей значимости занимают второе после β-лактамных место. Относясь к антибиотикам с широким спектром действия, аминогликозиды используются для лечения таких инфекционных заболеваний, как туляремия, чума, коклюш, туберкулез. Стрептомицинможет быть использован в сельском хозяйстве для борьбы с заболева-ниями растений: бактериальным увяданием фасоли, ожогом косточковых. Антибиотики являются бактерицидными. На молекулярном уровне действие аминогликозидов происходит следующим образом. Уже достаточно давно установлено, что мишенью их действия является процесс биосинтеза белка, а из клеточных структур – рибосомы. Здесь следует отметить, что стрептомицин действует на 30S субъединицу, другие аминогликозиды связываются с обеими субъединицами, в их присутствии образуется нестабильный 70S инициаторный комплекс и обрывается биосинтез белка. В 1961 году было высказано предположение о влиянии стрептомицина на процессы биосинтеза белка. К тому времени была разработана бесклеточная система синтеза белка и уточнение сайта действия антибиотика проводили in vitro. В бесклеточную систему вводили стрептомицин и четыре возможных комбинации 30S и 50S субъединиц из рибо-сом чувствительных и устойчивых клеток, необходимые для осуществления биосинтеза белка составляющие. В результате было установлено, что ключевую роль в устойчивости играет 30S субъединица: если данная субъединица получена из резистентных клеток, то процесс биосинтеза белка происходит в присутствии антибиотика. Дальнейшая диссоциация 30S субъединицы на 16S-рРНК и 21 белок определила, что ключевую роль играет одна из белковых молекул. Сравнение белковых профилей из устойчивых и чувствительных клеток позволило М. Номура в 1968 году выявить разницу в одном белке – Р10 (S12). Именно его структура определяет устойчивость к антибиотику. Различия между белком в чувствительных и устойчивых клетках сводятся к очень небольшому числу замен аминокислот: лизин в 42 положении может быть заменен на аспарагин, треонин или аргинин, а лизин в 87 положении – на аргинин. Оказалось, что белок S12 в изолированном виде стрептомицин не связывает, а, по всей вероятности, контролирует такое связывание на рибосоме. Объяснили это следующим образом: 1) S12 при выделении изменяет конформацию; 2) S12 экранирует места связывания стрептомицина на рибосоме в устойчивых клетках; 3) S12 влияет на конформацию тех белков, которые реагируют со стрептомицином. Ни одно из этих предположений не опровергнуто, и в настоящее время считают, что со стрептомицином связываются по крайней мере пять белков (S3, S5, S9, S12, S14) и 16S-рРНК. Каждая 30S субъединица рибосом связывает по одной молекуле антибиотика, образуя так называемое место «сильного» связывания. Кроме этого, отмечают, что в разных функциональных состояниях, в зависимости от температуры, концентрации ка-тионов, рибосома может по-разному связывать антибиотик. При связывании с рибосомой одно из следствий действия стрептомицина – возникновение ошибок считывания. Этот факт зарегистрирован и в системе in vivo, и в системе in vitro. В частности, в системе биосинтеза белка с поли-U как матрицей и в присутствии таких аминокислот, как фенилаланин, лейцин, серин, тирозин, при наличии стрептомицина наблюдается ошибочное включение лейцина вместо фенилаланина. Было установлено, что такое ошибочное считывание подчиняется нескольким закономерностям: 1) происходит при высокой концентрации магния и зависит от концентрации тРНК; 2) в любом кодоне мРНК ошибочно считывается одно основание,обычно пиримидин, расположенный на 5′-конце или в среднем положении; 3) 3′-основание считывается верно; 4) ошибки считывания пуринов происходят редко, и при их наличиив кодоне вероятность ошибочного считывания резко снижается. Ошибочное считывание лежит в основе явления фенотипической супрессии или подавления последствий мутации на уровне фенотипа. Мутанты такого типа названы «стрептомицинзависимые» или Smd. Стрептомицин подавляет биосинтез белка монофазным путем: при увеличении концентрации синтез снижается практически до полной остановки. Относительно действия других аминогликозидов на клетки можно отметить, что мишень действия та же, однако связываться антибиотики могут с обеими субъединицами; одна субъединица может связать более одной молекулы антибиотика. Следовательно, аминогликозидные антибиотики подавляют синтез белка трехфазным путем: 1) при низких концентрациях (порядка 2 мкг/мл) наблюдается общее подавление синтеза; 2) при более высоких (порядка 50 мкг/мл) синтез белка даже стимулируется; 3) при еще больших концентрациях процесс вновь подавляется. В первом случае считают, что ошибки считывания незначительны; во втором – ошибки считывания существенны, особенно для терминирующих кодонов, что приводит к синтезу аномально длинных белковых цепей, и это фиксируется как увеличение синтеза белка. Наконец, в третьем – молекулы антибиотика способны связываться и занимать новые места на рибосоме. Таким образом, можно сказать, что летальное действие аминогликозидов обусловлено подавлением диссоциации свободных рибосом; снижением точности трансляции; подавлением транслокации рибосом; подавлением терминации полипептидной цепи. Устойчивость к аминогликозидам может быть обусловлена как мутациями, затрагивающими хромосомальные гены, так и наличием в клетке плазмид, и проявляется на нескольких уровнях: • модификации рибосом, которая выражается в изменении или отсутствии белков для связывания антибиотиков – rpsL-мутация (S12) и rrs-мутация (16S-рРНК); • снижение транспорта антибиотика в клетку, например, у анаэробных бактерий. В этом случае наблюдается одновременная устойчивость практически ко всем аминогликозидам; • синтез ферментов, инактивирующих антибиотики, как правило, детерминируемый плазмидными генами. Такие ферменты не выделяются в среду и локализованы на наружной поверхности цитоплазматической мембраны или в периплазме грамотрицательных бактерий, они требуют наличия кофакторов и нестабильны при выделении. Известны три типа таких ферментов: N-ацетилтрансферазы, О-фосфотрансферазы и О-аденилилтрансферазы. В каждом случае происходит взаимодействие фермента с конкретной группой в молекуле антибиотика: NH2-группа может быть замещена на ацетильный остаток (кофактор АсКоА); ОН-группа – на остаток фосфорной или адениловой кислот (кофактор АТФ). В молекуле аминогликозидов три функциональные группы подвергаются ацетилированию, шесть – фосфо- или аденилированию. Фосфотрансферазы (АРН) в зависимости от положения атакуемой группы делятся на пять подгрупп, обозначаемых А, B, C, D, E. Среди ферментов этих групп описаны несколько, обладающих бифункциональной активностью – фосфо- и ацетилтрансферазной. У исследованных штаммов стрептококков и стафилококков соотвествующий ген мог бытьлокализован как на конъюгативной, так и неконъюгативной плазмидах, атакже хромосомально. Синтез ферментов такого рода обусловливают гены устойчивости в составе транспозонов Tn5, Тn1699, Tn 903 и др. Аденилилтрансферазы (ААВ или ANT) разделены на пять различных типов. Ацетилтрансфераз (ААС) известно четыре типа, они обнаруживаются только у грамотрицательных бактерий, гены имеют плазмидную или хромосомальную локализацию. Ацетилированию могут подвергаться только дезоксистрептаминовые антибиотики. Аминогликозиды относятся к препаратам с низким терапевтическим индексом, т. е. малым разрывом между терапевтической и токсической дозой или концентрацией. Такой эффект наиболее часто объясняют тем, что антибиотики являются поликатионами, а большинство биополимеров клетки – полианионы. In vitro показано взаимодействие аминогликозидов с фосфолипидами, липопротеинами, нуклеиновыми кислотами. 33. Получение продуцентов пенициллина и стрептомицина. Создание полусинтетических антибиотиков. Мутасинтез. Получение высоких выходов пенициллина достигнуто в результате изучения условий его образования и селекции наиболее активных штаммов продуцента пенициллина. Важным этапом в увеличении выхода пенициллина было изучение условий образования антибиотика. Большую роль в процессе биосинтеза пенициллина определенного типа и в увеличении его выхода играют так называемые предшественники. Предшественниками могут служить только те органические вещества субстрата, которые в процессе биосинтеза антибиотика тем или иным путем включаются в его молекулу. Организм-продуцент пенициллина включает в молекулу антибиотика некоторые органические соединения или часть их без предварительного расщепления на отдельные фрагменты и последующего ресинтеза. Основная масса пенициллина в процессе биосинтеза выделяется в окружающую среду и лишь небольшое количество антибиотика содержится внутри мицелия гриба и в клеточной стенке. Большое значение в настоящее время имеет так называемый полусинтетический (биологический+химический) способ получения аналогов природного пенициллина, обладающих рядом ценных свойств. Исходным продуктом в указанном синтезе служит 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК). Наиболее перспективным способом получения 6-АПК является ферментативный метод гидролиза молекулы бензилпенициллина с участием иммобилизованной пенициллинацилазы, которая осуществляет гидролиз бензилпенициллина с образованием 6-АПК и фенилуксусной кислоты, соединенных в молекуле антибиотика карбоксиламидной связью. Образование пенициллиназы широко распространено среди различных групп микроорганизмов. В настоящий период наиболее широкое применение в медпрактике находят полусинтетические пенициллины, полученные на основе 6-АПК. Получение 6-АПК в широких масштабах осуществляется с помощью иммобилизованной пенициллинамидазы. 6-АПК подвергают химическому ацилированию и получают соответствующие аналоги пенициллина, обладающие иными свойствами по сравнению с природными пенициллинами. Одно из требований, которое предъявляется к таким препаратам, – улучшенная проницаемость через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. К немаловажным свойствам можно отнести и повышение связывания с пенициллинсвязывающими белками. Наконец, некоторые фармакокинетические показатели: незначительное связывание с белками сыворотки крови, меньшая аллергенность, стабильность в кислой среде желудка, всасываемость при приеме внутрь – относятся также к существенным при оценке качества вновь созданных препаратов. Увеличение производства антибиотика осуществлялось не только за счет расширения и увеличения числа промышленных предприятий, но и за счет, в основном, следующих трёх мероприятий: получение наиболее активных штаммов актиномицета – продуцента стрептомицина; подбор наиболее благоприятных сред и других условий культивирования продуцента, обеспечивающих максимальный биосинтез стрептомицина; разработка наиболее рациональных методов выделения и очистки антибиотика. Получение наиболее активных штаммов актиномицета – продуцента стрептомицина. Только за счет селекции штамма Str. griseus удается увеличить выход стрептомицина в 60-100 раз. Важную роль в селекции продуцентов играют индуцированный мутагенез и ступенчатый отбор. С целью получения мутантов широко применяются мутагенные факторы: рентгеновское и УФ излучения. Используется метод многократного облучения спор УФ с последующим применением видимого света. В результате были получены новые штаммы, сохраняющие высокую антибиотическую активность. Использование комбинации мутантов продуцентов антибиотических в-в и предшественников позволяет направлять биосинтез антибиотиков по нужному пути и получать в результате в-ва с измененными свойствами. Мутосинтез – один из перспективных методов получения новых антибиотиков методом направленного биосинтеза. Суть его состоит в том, что в результате генетических манипуляций получают мутант продуцента, который потерял способность синтезировать один или несколько фрагментов мол-лы антибиотика. При внесении в среду для культивирования такого мутанта недостающих фрагментов, синтезированных химическим путем, мутант способен включать их в молекулу образуемого антибиотика 34. Механизм поступления аминогликозидов в клетку и обобщенная модель их действия Поступление в клетку аминогликозидов осуществляется с использованием пориновых каналов наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Это согласуется с тем, что аминогликозиды являются гидрофильными поликатионными соединениями, что облегчает их транспорт через заполненные водой каналы. Общим положительным зарядом молекулы объясняется также и способность некоторых аминогликозидов вытеснять из наружной мембраны катионы Mg2+, связывающие молекулы липополисахаридов. В результате этого частично дезорганизуется мембрана, что приводит к усилению поступления аминогликозидов через наружную мембрану. Такое явление получило название «самопромотирования», и в зависимости от роли, которую играют катионы Mg2+ в поддержании целостности наружной мембраны, для различных бактерийоно выражено в разной степени. Можно отметить, что высокие концентрации Mg2+ отрицательно сказываются на антимикробном действии аминогликозидов. Поступление аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану является сложным, многоступенчатым процессом, идущим с затратами энергии. Его можно разделить на три фазы: I – фаза связывания антибиотика с наружной поверхностью цитоплазматической мембраны (ионное связывание). Никакие механизмы резистентности клеток не влияют на ее осуществление; II – фаза медленного поглощения, в результате которого через цитоплазматическую мембрану в клетку проникает незначительное количество антибиотика, не вызывающее летального исхода, но индуцирующее наступление фазы III; III – индукция массивного поглощения антибиотика. Именно на этой стадии наступает летальный эффект для чувствительных клеток. Потребность в энергии на двух последних стадиях требует транспорта электронов по дыхательной цепи. Относительно веществ – переносчиков аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану в настоящее время сложилось устойчивое мнение, что это хиноны либо какие-то связанные с ними вещества. По крайней мере для E. coli показано, что аминогликозиды в субингибирующих концентрациях блокируют функционирование цикла трикарбоновых кислот. Исходя из этого факта и объясняют отмеченное еще С. Ваксманом в 1950-х годах явление, которое заключается в том, что в аэробных и анаэробных условиях наблюдаются резкие различия в активности аминогликозидов по отношению к клеткам микроорганизмов. Клиницистам известна резистентность анаэробов (Clostridium, Bacteroides) и в некоторых условиях – факультативных анаэробов (Escherichia, Staphylococcus) к аминогликозидам. В среднем для лечения инфекций, развивающихся в анаэробных условиях, требуются примерно в десять раз большие кон-центрации антибиотиков. Причем такая резистентность не связана ни с изменением рибосом, ни с наличием инактивирующих ферментов. Считают, что в таких условиях не функционирует цикл трикарбоновых кислот, нет активных переносчиков аминогликозидов в клетку, а следовательно, и антибиотик в клетки не поступает. Такая ситуация, т. е. недостаток кислорода, наблюдается при развитии таких инфекций, как абсцессы и остеомиелиты. С учетом механизма поступления аминогликозидов и того, что они действуют на процессы биосинтеза белка, создана единая концепция о действии аминогликозидов на бактериальную клетку. В основе такой концепции лежат исследования модельной системы «стрептомицин – E. coli». Во время первой энергозависимой фазы незначительное количество стрептомицина проникает в клетку и взаимодействует с рибосомами на стадии элонгации белковой цепи. В результате ошибок считывания генетического кода образуются аномальные (или неправильные) клеточные белки с нарушенной последовательностью аминокислот, которые входят и в состав цитоплазматической мембраны. С их участием в мембране формируются неспецифические туннели, и в клетку поступают новые порции антибиотика, увеличивается количество ошибок считывания, повышается проницаемость мембраны, и количество поступающего антибиотика достигает той концентрации, когда белковый синтез блокируется уже на стадии инициации. Высвобождение из клетки через образующиеся туннели низкомолекулярных метаболитов и неорганических ионов можно рассматривать как фактор, дополняющий летальное действие аминогликозидов. Также к летальному эффекту приводит и нарушение формирования точки начала репликации ДНК за счет образования аномальных белков на нижней поверхности цитоплазматической мембраны. 35.Окислительный и деструктивный механизмы действия антисептиков на клетку. 1. Деструктивный механизм подразумевает разрушение структур и макромолекул клетки в присутствии антибиотика, что не позволяет им выполнять свои функции. Деструкцию могут вызывать химические вещества, температура, ультразвук, соли тяжелых металлов, поверхностно-активные вещества. Молекулы, которые имеют в своем составе гидроксильные или карбонильные группы, двойные связи, разрушаются в основном за счет окисления. Биополимеры типа белков, полиэфиров – под действием окислителей, детергентов. Наиболее подвержена деструкции мембрана, у которой изменяется целостность, – таким образом, наступает гибель клетки. Применение антисептиков этой группы может иметь отрицательные последствия для макроорганизма (оказывают раздражающее действие, вызывают повреждение кожи, слизистых оболочек и т. д.). 2. В соответствии с окислительным механизмом активности антисептиков (перекись водорода, иод, марганцевокислый калий) на первом этапе взаимодействия с химическими веществами клетки происходит отсоединение от антисептика кислорода, его активация и образование промежуточных перекисных продуктов – гидроксил-иона и др. На втором этапе активированный кислород и промежуточные продукты взаимодействуют с реакционноспособными группами соединений микробной клетки, в результате чего происходит полная деструкция молекул или возникают солеобразующие или несолеобразующие комплексы с молекулами - мишенями. Изменения носят необратимый характер, и, следовательно, окислители имеют бактерицидный эффект. Например, в растворе марганцевокислого калия марганец в кислой среде переходит в четырехвалентное, а в щелочной – в двухвалентное состояние с выделением атомарного кислорода, который окисляет соединения, входящие в состав поверхностных структур бактериальной клетки. 36. Антибиотики – ингибиторы синтеза предшественников клеточной стенки и их транспорта через мембрану. К антибиотикам, ингибирующим образование предшественников, относят фосфомицин и D-циклосерин. Первое соединение было обнаружено в начале 1970-х годов, продуцентом его являются стрептомицеты (Streptomycesfradiae, Streptomycesviridochromogenes). Антибиотик взаимодействует с ферментом, участвующим в образовании N-ацетилмурамовой кислоты, связанной с уридиндифосфатом, действуя как аналог ФЕП (фосфоенолпирувата) и связывается с цистеином в активном центре трансферазы. Мишень для действия антибиотика находится в цитоплазме, и реакция является весьма специфичной: на другие ферменты и реакции с участием ФЕП антибиотик не действует. Поступление антибиотика происходит за счет двух транспортных систем – для гексозофосфатов и для глицерофосфата. За счет увеличения поступления в присутствии этих соединений активность антибиотика возрастает. В настоящее время обнаружены несколько механизмов резистентности к фосфомицину: изменение систем транспорта или ослабление сродства между ферментом-мишенью и антибиотиком за счет хромосомальных мутаций. При устойчивости, детерминируемой плазмидными генами и обнаруженной у кишечных бактерий Serratia marcescens, выявлен транспозон Tn2921, кодирующий синтез локализованного в цитоплазме белка Fos (16 Кд). С антибиотиком связывается глутатион (два глутамата, соединенных через цистеин), а глутатионтрансфераза катализирует раскрытие цикла молекулы. Наконец, возможна одновременная устойчивость, определяемая как плазмидными, так и хромосомальнымигенами и имеющая различные механизмы. Действие фосфомицина с другими антибиотиками может быть как синергидным, так и антагонистическим. Возможно, что в его присутствии уменьшается или увеличивается количество пенициллинсвязывающих белков в клеточной стенке или же продукты повреждения пептидогликана включаются как эффекторы в систему регуляции синтеза β-лактамаз. Антибиотик является бактерицидным, его использование в клинике ограничено. D-циклосерин (Streptomyces lavendulae) следует рассматривать как антагониста D-аланина, что обусловлено их структурным сходством. При действии антибиотика в цитоплазме клеток накапливается трипептидное производное N-ацетилмурамовой кислоты, лишенное двух концевых D-аланиновых остатков. Мишенью для действия фермента являются рацемаза L-аланина и синтетаза D-аланина. Было продемонстрировано, что циклосерин структурно сходен с одной из возможных конформаций D-аланина, а его сродство к синтетазе намного больше, чем для природного субстрата. Устойчивость к антибиотику может быть связана с повышением уровня синтеза ферментов, взаимодействующих с антибиотиком, либо с утратой способности к его транспорту в клетку (через систему аланина). Бацитрацин Аотносится к антибиотикам, связывающимся с молекулами-переносчиками. Этот пептидный антибиотик, продуцируемый Bacillus lichiniformis, выделенный в 1945 году, обладает повышенной токсичностью для организма за счет возможного связывания со стеролами мембран и используется местно для подавления грамположительной микрофлоры. Антибиотик подавляет перенос через мембрану мурамилпентапептида к растущей цепи пептидогликана. В процессе переноса происходит фосфорилирование-дефосфорилирование бактопренола, который только в дефосфорилированной форме способен связывать и при последующем фосфорилировании транспортировать предшественника. Антибиотик не является высокоспецифическим и может подавлять некоторые другие реакции с участием бактопренола (например, синтез О-антигена липополисахарида). 37. Биопленки, их образование и роль в устойчивости бактерий к антимикробным препаратам. Проблема антибиотикотерапии, как и любой другой терапии, складывается из 2-х компонентов: проблемы эффективности и проблемы безопасности. К сожалению, 100% эффективности антибактериальной терапии не бывает, как бы хорошо не обеспечивались фармакодинамические параметры. Установлено, что эффективность антибиотиков может быть ограничена за счет образования структуры «биопленки» и существования в любой бактериальной популяции «клеток-персистеров». Клетки-персистеры сохраняют жизнеспособность в присутствии антибактериальных препаратов и после удаления препарата возобновляют свой рост. Биопленки — это полимикробные фиксированные сообщества микроорганизмов в синтезированном ими полимерном матриксе, адгезированные в виде тонкого слоя к органической или неорганической поверхности. Биопленки, основной фенотип почти всех бактерий, усиливают защиту от фагоцитоза, УФО, вирусов и деградации, а также от антибиотиков и факторов иммунной защиты организма. В частности, биопленки способны выдерживать концентрации антибиотиков в 100-1000 раз больше, чем плавающие клетки. Традиционные бактериологические методы при выделении чистой культуры определяют лишь около 1% клеток из множества штаммов, присутствующих в составе биопленки. Более того, эти методы не выявляют те бактерии в составе биопленки, которые являются жизнеспособными, но не культивируются, в результате делается ошибочное заключение о «стерильном воспалении» или вирусной инфекции (например, при среднем отите). Формирование биопленок подтверждается визуально методом сканирующей электронной микроскопии. Идентифицировать микроорганизмы в составе биопленок позволяют современные молекулярные методы (электрофорез в геле, жидкостная хроматография, ПЦР и др.). Все новые данные свидетельствуют о существовании биопленок при хронических инфекциях. В частности, доказана ведущая роль биопленок в формировании хронических синуситов и аденотонзиллярной патологии, что требует новых подходов к диагностике и лечению. Биопленки должны стать терапевтической мишенью при хронических инфекциях. Способность разрушать даже уже сформированные биопленки обнаружена у муколитика N-ацетилцистеина, при этом значительно усиливается бактерицидная активность антибиотиков, в частности фосфомицина, тиамфеникола. По мнению Хенс-Петер Мюллера, в биопленке колонии бактерий по сравнению с так называемыми планктонными культурами проявляют особые свойства:
Биопленка играет важную, а в некоторых случаях главенствующую роль в развитии стоматологических заболеваний. Патогенные бактерии биопленки являются этиологическим фактором болезней периодонта. Контроль за биопленкой является эффективным средством лечения болезней периодонта. В борьбе с биопленкой по-прежнему ведущая роль отводится антимикробным препаратам. Повышение эффективности терапии возможно только при целевом воздействии на микробные сочетания, ответственные за возникновение конкретных нозологических форм болезней периодонта. Исследованиями показана эффективность антимикробной терапии в отношении специфических микроорганизмов при лечении болезней периодонта. В то же время удалить биопленку только воздействием антибактериальных препаратов не представляется возможным. Наилучших результатов можно достичь при сочетании профессиональной гигиены и антимикробной обработки. Рядом зарубежных исследователей показаны преимущества комбинации профессиональной гигиены и антисептической обработки, которые способствуют существенному уменьшению количества спирохет и P. gingivalis по сравнению со стандартной процедурой профессиональной гигиены. 38.Характеристика антибиотиков группы хинолонов и фторхинолонов: механизм действия и развития устойчивости. Антибиотики — ингибиторы репликации и транскрипции ДНК и РНК могут быть разделеныследующим образом: 1) ингибиторы синтеза предшественников нуклеиновых кислот; 2) ингибиторы реакций полимеризации, среди которых: -ингибиторы матричных функций ДНК; |