история. 1. понятие биотрансформации. Виды биокатализаторов
 Скачать 4.48 Mb.
|
НЕДОСТАТКИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК В КАЧЕСТВЕ БИОКАТАЛИЗАТОРА.1.Фермент внутри клетки отделен от экзогенного субстрата клеточной стенкой и ЦПМ, так что для их взаимодействия необходимо транспортировать субстрат внутрь клетки. Иногда этот процесс является лимитирующим.  Поверхностные структуры и клеточная мембрана могут также препятствовать свободному выходу продукта трансформации из клетки, что осложняет его последующее извлечение из реакционной смеси. 2. Внутри клетки помимо фермента, осуществляющего целевую трансформацию, имеются множества других ферментов. Некоторые из этих ферментов могут также трансформировать исходный субстрат, в этом случае селективность биокатализатора будет сильно зависеть от активности нецелевых (мешающих) ферментов.  Кроме того, в клетках могут присутствовать ферменты, способные разрушать целевой продукт трансформации, что будет существенно снижать его выход. Вместе с тем, способность клеток осуществлять политрансформацию может оказаться весьма полезным свойством. Например, в том случае, если целевой продукт образуется из субстрата в несколько стадий и, если эти ферменты присутствуют в клетке, то можно осуществить многостадийный процесс в одном реакторе без выделения промежуточных продуктов.  3. Использование целых клеток в ряде случае может сопровождаться быстрой потерей активности биокатализатора вследствие протеолиза целевого фермента под действием внутриклеточных протеаз.  4. Активность и селективность клеточных биокатализаторов может в значительной степени варьировать в зависимости от физиологического состояние микроорганизмов, которое определяется возрастом и условиями их роста. Например, такими параметрами как составом среды, температурой культивирования, интенсивностью аэрации и так далее. Таким образом, при разработке недорогих клеточных биокатализаторов необходимо либо искать микроорганизм «без проблем» (без мешающих ферментов, которые будут конкурировать за субстрат, либо разрушать целевой продукт), либо решать эти проблемы путем модификации биокатализатора. 4.МОДИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТНЫХ КАТАЛИЗАТОРОВДля усиления стабильности и функциональных свойств ферментных катализаторов могут быть использованы следующие подходы: Обработка ферментов органическими растворителями, ПАВами, неорганическими солями Химическая модификация ферментов Иммобилизация ферментов Обработка ферментов органическими растворителями, ПАВами, неорганическими солями Органические растворители и поверхностно активные вещества являются токсичными для большинства ферментов, однако в ряде случаев обработка этими соединениями ферментных препаратов может привести к значительному увеличению активности. Например, активирующее действие на некоторые липазы оказывают ПАВ, в частности ТВИНы. Это объясняется тем, что активный центр липазы может находиться либо в закрытой форме, либо в открытой форме. Закрытая форма менее активна. ПАВ взаимодействуют с липазой и стабилизируют ее активный центр в более активном, то есть открытом состоянии.  Активирующее действие на липазы показано также для некоторых органических растворителей, в частности для изопропанола , а также для фосфатов калия и кальция. ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВХимическую модификацию ферментного биокатализатора осуществляют с помощью би- и полифункциональных реагентов. Такие реагенты могут формировать перекрестные (поперечные) внутримолекулярные связи в белковых молекулах, что приводит к образованию поперечносшитых кристаллов фермента.  В качестве бифункционального реагента зачастую используют глутаровый альдегид, который сшивает белковые молекулы за счет свободных аминогрупп лизина.  Поперечносшитые ферментные кристаллы отличаются повышенной стабильностью, они нерастворимы в воде, имеют достаточно крупные размеры по сравнению с лиофильно-высушенными порошкообразными препаратами ферментов. Это приближает их к иммобилизованным ферментам. Однако химическая модификация может использовать только в том случае, если в активном центре фермента отсутствуют группы, с которыми может взаимодействовать сшивающий реагент. В противном случае, фермент может частично или полностью инактивироваться реагентом. С помощью бифункционального реагента поперечносшитому ферменту можно присоединять небольшие молекулы, а также осуществлять модификацию аминокислотных остатков. Используя данный подход можно модулировать гидрофобные свойства поверхности ферментов, увеличивать их активность, стабильность и селективность. 01.11.2021 |