история. 1. понятие биотрансформации. Виды биокатализаторов
 Скачать 4.48 Mb.
|
6.ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТАИммобилизация клеточного фермента – это включение молекулы фермента в какую-либо фазу, отделенную от фазы свободного раствора, но способную взаимодействовать молекулами субстрата. Основной целью иммобилизацией ферментов является обеспечение возможности их многократного использования. Иммобилизованный фермент можно легко отделить от реакционной смеси после трансформации и вернуть в реактор. Материалы или носители, применяемые при иммобилизации должны обладать следующими свойствами: Нерастворимостью; Биологической и химической стойкостью; Проницаемостью для ферментов, субстратов и продуктов; Способностью легко активироваться; Гидрофильностью. В качестве носителя могут быть использованы полимеры: Органические Неорганические  Белковые полимеры – коллаген, α-кератин, фибролин, сывороточный альбумин Полисахаридные полимеры – целлюлоза, хитин и хитозам, крахмал, агароза, декстрам, альгинат и другие Липидные полимеры – лицитин, фосфотидилхалил, сфингомиелин и другие  Из этих материалов могут быть сформированы гранулы, волокна, мембраны, трубочки, в том числе имеющие нано размеры. Для отделения иммобилизованного фермента от реакционной смеси могут быть использованы различные реакторы. В случае гранулированного биокатализатора достаточно просто осадить унесенные частицы в отстойнике или отфильтровать их, а затем вернуть в реактор.  Еще экономичнее осуществлять биотрансформацию в непрерывных условиях, пропуская реакционную смесь через колонну, заправленную биокатализатором.  В ряде случаев за счет иммобилизации фермента удается увеличить их стабильность, активность и селективность, а также устойчивость в органическим растворителям, токсичным субстратам и продуктам. Существуют различные методы иммобилизации ферментов, которые можно разделить на: Ковалентные, с образованием ковалентной связи между ферментом и носителем (химические методы иммобилизации) Нековалентные протекают без возникновения ковалентные связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) При ковалентной иммобилизации фермент с помощью би- и полифункциональных реагентов ковалентно сшивается с инертным полимерным носителем. В этом случае реагент сначала с одного конца пришивают к полимеру, а затем другим концом присоединяют к ферменту. В качестве реагента помимо глутарового альдегида часто используют хлористый цианур.  При нековалентной иммобилизации фермент адсорбируется на инертном и нерастворимом носителе или физически включается в него. Адсорбция фермента на нерастворимом носителе происходит за счет ионных гидрофобных и водородных связей, а также за счет Ван-дер-Ваальсовых сил.  Данный способ иммобилизации находит применение в промышленности из-за своей простоты. Для адсорбции ферментный раствор и носитель перемешивают некоторое время вместе. К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации может произойти десорбция фермента, его потери и загрязнение продукта ферментом. Для иммобилизации липаз могут быть использованы гидрофобные материалы. Например, пористые резины, которые при этом могут активировать фермент за счет стабилизации его в открытой форме.  При включении фермента в полимерный носитель белок удерживается внутри полимера. Полимер может образовывать вокруг фермента сетеподобную матрицу, ячейки которой настолько малы, что ферментные молекулы не могут освободиться от сети, но в то же время достаточно велики для проникновения субстрата. Молекулы фермента распределяются в ячейках полимера.  Для включения в синтетические полимеры раствор фермента смешивают с мономерами, а затем инициируют процесс полимеризации. Наиболее часто ферменты, растворив предварительно в буферном растворе, включают в полиакриламидный гель, получаемый путем сополимеризации мономера акриламида и сшивающего агента N,N’-метиленбисакриламида. Эти реагенты смешивают с раствором фермента и добавляют сначала катализатор, а затем инициатор реакции. В качестве катализатора полимеризации используют тетраметилэтилендиамин. Инициатором может служить либо персульфат аммония, либо рибофлавин. В последнем случае раствор необходимо облучить ультрафиолетом (происходит фотополимеризация). В результате полимеризации образуется полиакриламидный гель. Природные полимеры, например, агароза или карогенан, сначала переводят в жидкое состояние, то есть расправляют, а затем смешивают с раствором фермента и вновь переводят в твердое состояние, то есть охлаждают. С помощью полимера можно сформировать общую оболочку или капсулу внутри группы молекул фермента, проницаемую для субстрата. Такой способ включения фермента в гель называют инкапсулированием.  Методом микрокапсулирования могут быть иммобилизованы не только ферменты, но и целые клетки, и отдельные фрагменты клеток. Ферменты могут быть инкапсулированы не только в полимерных матрицах, но и внутри мицелл, образованных поверхностно активными веществами (ПАВами). Инкапсулирование внутри мицеллы осуществляется путем дисперсии раствора фермента в гидрофобном растворите, например в изооктане, в присутствии синтетических или природных эмульгаторов. Дисперсию можно осуществить механическим встряхиванием или обработкой ультразвуком. При этом способе иммобилизации внутри мицеллы оказывается не только сам фермент, но и окружающий его водный раствор, а снаружи остается органический растворитель. Такой биокатализатор удобно использовать для биотрансформаций в органических растворителях, когда следует исключить непосредственный контакт фермента и растворителя. Близким к инкапсулированию вариантом иммобилизации является метод включения водных растворов ферментов в липосомы, то есть в двойные липидные шарики. Для получения липосом из растворов липида, например лицитина, упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов выдерживают в водном растворе, содержащим фермент. В процессе выдержки происходит самосборка липидных структур в липосомы, содержащий данный раствор фермента. Этот метод используется в медицине, при адресной доставке ферментов. При использовании липидов, способных образовывать в воде липидный бислой, можно осуществить иммобилизацию гидрофобного фермента, включением в липидный бислой. Выбор носителя и способа иммобилизации осуществляют в зависимости от конкретных задач, которые приходится решать в процессе биокатализа. 03.11.2021 |