история. 1. понятие биотрансформации. Виды биокатализаторов

• Название: 1. понятие биотрансформации. Виды биокатализаторов
• Анкор: история
• Дата: 21.10.2022
• Размер: 4.48 Mb.
• Имя файла: vasilova_bilety.docx
• Тип: Лекции; #747199
• страница: 5 из 9

5.МОДИФИКАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ

Модификацию клеточных катализаторов осуществляют путем:

• 
  Избирательной инактивацией мешающих ферментов;
  
• 
  Получением мутантов с нарушенным синтезом мешающих ферментов;
  
• 
  Физиологической оптимизацией синтеза ферментов;
  
• 
  Пермеабилизацией клеток;
  
• 
  Иммобилизацией клеток.
  

ИЗБИРАТЕЛЬНАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МЕШАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ

Селективность клеточного биокатализатора можно повысить, если избирательно элиминировать или минимизировать активность мешающих ферментов.



Для избирательной инактивации мешающего фермента клеточный биокатализатор предварительно инкубируют в условиях, в которых ненужный фермент необратимо инактивируется тогда, как целевой фермент остается активным. После прединкубации клетки используют для биокатализа.

В качестве факторов инактивации могут использоваться специфические ингибиторы мешающих ферментов, денатурирующие температуры, экстремальная кислотность среды, органические растворители и другие факторы. Например, термаинактивация мешающего фермента R-типа у пекарских дрожжей удается повысить энантиоселективность восстановления этилацетоацетата в S-этил-3-оксибутират, который является важным синтуном (предшественником) ряда феромонов насекомых.



Нативные клетки дрожжей проявляют низкую селективность в этом процессе. Они накапливают целевой S-энантиомер с примесью его антипода до 25%. Это обусловлено тем, что в клетках пекарских дрожжей содержатся, по крайней мере, 5 ферментов, который могут восстанавливать этилацетоацетат. Большинство из этих ферментов относятся к S-типу, но один фермент синтетаза жирных кислот относится к R-типу. Именно благодаря его активности существенно снижается качество целевого продукта.

Оказалось, что синтетаза жирных кислот быстро инактивируется при 50 град Цельсия, тогда как остальные ферменты сохраняют свою активность. Это позволило решить проблему селективности путем предварительного прогрева клеток пекарских дрожжей при данной температуре в течение 30 минут. Прогретый биокатализатор трансформирует субстрат только в S-энантиомер этил-3-оксибутирата. Аналогичный эффект был получен при предварительной обработке клеток аллиловым спиртом, являющимся специфическим ингибитором синтетазой жирных кислот.

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ С НАРУШЕННЫМ СИНТЕЗОМ МЕШАЮЩИХ ФЕРМЕНТОМ

Селективность клеток можно увеличить путем инактивации генов, кодирующих синтез мешающих ферментов с помощью мутагенов. В этом случае мешающие ферменты вообще перестают синтезироваться или имеют такие серьезные дефекты, что не могут осуществлять катализ. Например, на основе микроорганизмов – деструкторов эпихлоргидрина были получены мутанты с блокированной стадией дегидрогалогенирования 3-хлор-1,2-пропандиола.



Полученные мутанты трансформируют эпихлоргидрин в оптически чистый S-3-хлор-1,2-пропандиол с количественным выходом.

Помимо мутантов с блокированным синтезом ферментов представляет интерес получение мутантов, устойчивых к повышенным концентрациям токсичных субстратов и продуктов трансформации и толерантных к органическим растворителям.

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ОПТИМИЗАЦИЯ СИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ

Иногда селективность клеток удается увеличить путем оптимизации их физиологического состояния. С этой целью подбирают такие условия роста, а именно: состав среды, температуру, рН, интенсивность аэрации и другие параметры, которые позволяют разобщить процессы синтеза целевого и мешающего фермента во времени.

Например, можно попытаться подобрать такие условия, в которых мешающий фермент будет синтезироваться позднее целевого фермента. В этом случае, рост культуры прекращают до того, как начнет вырабатываться ненужный фермент. Для этого клетки отделяют от ростовой среды центрифугированием и создают условия, в которых они теряют жизнеспособность, но не целевую активность или, в которых они не могут расти из-за дефицита питательных веществ. Например, клетки можно обработать ацетоном или высушить, или просто поместить в буферный раствор.



Если активность мешающего фермента в клетках снижается в процессе культивирования, то можно поискать условия, в которых он будет наименее активным тогда, как целевой фермент останется достаточно активным. В этом случае целесообразно выращивать культуру до полного исчезновения активности мешающего фермента.



ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК

Для увеличения активности клеточного биокатализатора приходится решать проблему транспорта субстрата и продукта трансформации через мембрану. Интенсификация транспортных процессов осуществляется путем пермеабилизации, то есть увеличением проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны.

Иногда для этого достаточно просто высушить клетки. Однако, чаще приходится обрабатывать их различными органическими растворителями. Например такими, как толуол, хлороформ, ацетон и другие. Растворами органических кислот – муравьиной кислотой или поверхностно активными веществами – твинами, тритонами и другими детергентами. Эти вещества разрыхляют мембрану или клеточную стенку путем экстракции из них отдельных компонентов – липидов, ионов кальция, стабилизирующих белков и других компонентов.

Через эти разрыхленные структуры клеток могут проникать многие низкомолекулярные соединения, в то же время ферменты остаются в клетке.



Пермеабилизация оказалась весьма полезной при трансформации сложных эфиров внутриклеточными липазами. Например, активность обработанных ацетоном клеток иногда возрастает от 2 до 10 раз по сравнению с необработанными клетками. Следует отметить, что обработка клеток органическими растворителями, спешивающимися с водой (например, ацетоном) приводит к их обезвоживанию. Это позволяет их использовать для катализа в органических растворителях несмешивающихся с водой. Обезвоженные клетки приобретают порошкообразный вид и могут суспендироваться в гидрофобных растворителях.

Кроме того, пермеабилизованные клетки теряют свою жизнеспособность, что позволяет затормозить синтез нежелательных ферментов, в том числе протеаз, которые могут разрушить целевой фермент. Например, липолитический биокатализатор на основе бактерий рода Bacillus быстро теряют активность после начала спорообразования культуры.



Обработка клеток ацетоном предотвращала спорообразование и стабилизировала липолитическую активность.

Однако, пермеабилизация может приводить к нежелательным последствиям. Это связано с тем, что из клеток начинают выходить низкомолекулярные соединения, содержащиеся в цитоплазме. В частности из клетки выходят коферменты NADPH. Поэтому для проведения NADPH-зависимых трансформация с помощью таких биокатализаторов приходится использовать экзогенный кофермент. Например, система с экзогенным NADPH на основе пермеабилизованных клеток грибов Geotrichum candidum предложено для энантиоселективного восстановления карбонилсодержащих соединений.