1. Понятие об инфекционном процессе. Механизмы, пути и факторы передачи инфекции. Входные ворота инфекции
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
32. Иммуноблотинг. Механизм и применение. Метод идентификации Аг или АТ с помощью соотв. известных сывороток или Аг. На практике применяется для выявления спектра антител к антигенным смесям Относится к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции. Принцип метода на примере выявления антител к ВИЧ Реакция проводится в несколько этапов: 1) Антигены, экстрагированные из исследуемого объекта — ВИЧ (белки-р гликопротеины-др), подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле — разделению антигенов на фракции по молекулярной массе. 2) Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной, и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигена. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге Мембрану разрезают на полоски (стрипы). 3) Стрип с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала. 4) Сгрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают. 5) Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют зоне локализации комплекса АГ-АТ. 33. Типы вакцин. Получение живых, убитых, субъединичных и рекомбинантных вакцин. Проверка их безвредности, реактогенности и иммуногенности. По природе составляющих компонентов вакцины разделяют на живые, убитые, химические, анатоксины. Живые гетеровакцины при введении в организм вызывают лёгкие формы заболевания, прекрасно защищающие от более тяжёлых формю Например, вакуина против коровьей оспы позволяет создать иммунитет против натуральной оспы. Живые ослабленные (аттенуированные) вкцины содержат изменённые формы возбудителей инфекционных заболеваний (вакцинные штаммы, которые потеряли вирулентные свойства, но сохранили способность индуцировать выработку иммунитета). Снижение вирулентности осуществляется следующими основными методами: а)культивирование бактерий на средах с изменённым составом или температурой (вакцины против туберкулёза, сибирской язвы, чумы, туляремии); б) пассаж микроорганизма через организм невосприимчивых или маловосприимчивых животных (антирабическая вакцина); в) создание в лабораторных условиях штаммов-рекомбинантов. Кроме этих методов, используются выявление и селекция штаммов возбудителей, потерявших в естественных условиях вирулентность для человека. Живые вакцины вызывают субклиническое заболевание и обеспечивают эффективную защиту. В то же время они могут стать тяжёлых персистентных инфекций, вызвать поражение генетического аппарата клеток. Поэтому при иммунизации людей с иммунодефицитными состояниями необходима максимальная осторожность. Убитые корпускулярные вакцины (инактивированные) получают из свежевыделенных вирулентных и иммуногенных штаммов возбудителей, инактивированных температурой, либо с помощью химических веществ. В зависимости от применяемого химического вещества различают формоловые, спиртовые, ацетоновые, мертиолятные, хлороформенные вакцины. Убитые вакцины безопаснее живых, но менее эффективныи требуют повторного введения (ревакцинаций). В настоящее время применяются убитые вакцины против коклюша, холеры, лептоспирозов, клещевого энцефалита и др.Субъединичные вакцины (Инфлювак, Гриппол, Агриппал) состоят лишь из двух поверхностных вирусных белков, гемагглютинина и нейраминидазы, которые наиболее важны для индукции иммунного ответа против гриппа. Остальные белки вириона и куриного эмбриона удаляются при очистке. Для создания любой субъединичной вакцины прежде всего нужно идентифицировать те компоненты патогенного микроорганизма, которые индуцируют выработку антител. В ответ на введение этого гликопротеина мышам у них вырабатываются антитела, нейтрализующие ин-тактный HSV (вирус простого герпеса). Рекомбинантные вакцины - вакцины, полученные с помощью генной инженерии. В генетический аппарат неболезнетворного вируса встраивают участок ДНК болезнетворного вируса. Проверка вакцин. Безвредность включает проверку на лабораторных животных и других биологических системах токсичности, пирогенности, стерильности, аллергенности, тератогенности, мутагенности препарата. Реактогенность, т.е. побочные местные и общие реакции на введение В., оценивают на животных и при прививках людей. Иммуногенность проверяют на лабораторных животных и выражают в иммунизирующих единицах, т.е. в дозах антигена, защищающих 50% иммунизированных животных, зараженных определенным числом инфицирующих доз патогенного микроба или токсина. В противоэпидемической практике эффект вакцинации оценивают по соотношению инфекционной заболеваемости в привитых и непривитых коллективах. 34. Анатоксины. Получение анатоксинов. Адъюванты, механизм их действия. Анатоксины – обезвреженные токсины. Токсин обезвреживают формальдегидом (0,4 %) при 37—40˚С в течение 4 нед. При таком режиме полностью утрачивается токсичность, но сохраняются антигенность и иммуногенность токсинов. Получение анатоксина: • культивирование токсигенного штамма (микроорганизм выделяет в среду экзотоксин); • фильтрование через бактериальные фильтры; • обезвреживание формалином; • очистка и стандартизация; • добавление адъюванта. Анатоксины контролируют по основным показателям: остаточной токсичности, концентрации, стерильности, безвредности, аллергенности, иммуногенности и др. В практике применяются анатоксины против столбняка, дифтерии, ботулизма, газовой гангрены, стафилококковых инфекций. При этом все анатоксины подлежат контролю на стерильность, безвредность, специфическую активность, рН, содержание консерванта и сорбента. Адъювантами (adjuvant — помощник) называют группу веществ, обладающих свойством повышать иммуногенность при добавлении их к АГ и вакцинам. Адъювантами могут быть: • минеральные соединения; • микробные структуры (белки, нуклеиновые кислоты, липополисахариды); • синтетические вещества (полинуклеотиды, гликопептиды, полиоксидоний); • цитокины и пептиды; Соединения алюминия сорбируют АГ, длительно удерживают его вблизи от места инъекции, что обеспечивает лучшее взаимодействие с представляющими АГ клетками. Иммуногенность сорбированных препаратов повышается в сотни раз. Механизмы действия адъювантов: • создание «депо» АГ в месте введения вакцин; • воспалительная реакция, активирующая иммунокомпетентные клетки; • активация процесса захвата АГ и его переработки фагоцитами. 35. Получение лечебных иммуноглобулинов и антитоксических сывороток. Проверка их реактогенности и иммуногенности. Иммуноглобулины - это глобулины человека и животных, выполняющие функцию антител. Применяются для лечения и экстренной профилактики ряда инфекционных заболеваний. Представляют собой растворы гамма-глобул и но во и фракции сывороточных белков, содержащей 10±1% белка. Гамма-глобулиновая фракция составляет не менее 97% общего белка. Главным компонентом препарата является 1IgС и в небольших концентрациях 1IgА и 1IgМ. Основным сырьем для изготовления иммуноглобулина (против сибирской язвы, лсптоспироза, бешенства) служит иммунная сыворотка животных (в основном лошадей), гипериммунизированная соответствующим антигеном, а также кровь иммунизированного человека (донора). Для выделения иммуноглобулина из сыворотки крови применяется несколько методов, основанных на фракционировании сывороточных белков (спиртовыи, риванол-спиртовый, риваноловый). Наибольшее распространение в условиях производства получил спиртовыи (этано-ловый) метод осаждения при температуре ниже нуля. Антитоксические гетерогенные сыворотки получаются путем гипериммунизации различных животных. Они называются гетерогенными т.к. содержат чужеродные для человека сывороточные белки. Более предпочтительным является применение гомологичных антитоксических сывороток, для получения которых используется сыворотка переболевших людей (коревая, паротидная), или специально иммунизированных доноров(противостолбнячная, противоботулинистическая), сыворотка из плацентарной а так же абортивной крови, содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания. Для очистки и концентрирования антитоксических сывороток используют методы: осаждение спиртом или ацетоном на холоде, обработка ферментами, аффинная хроматография, ультрафильтрация. Антитоксические сыворотки нейтрализуют бактериальные экзотоксины и применяются для лечения и профилактики токсинемических инфекций. К ним относятся противодифтерийная, противоботулиническая, противостолбнячная, антигангренозная и антистафилококковая сыворотки. Реактогенность вакцины (реакция + греч. gennaō создавать, порождать) — свойство вакцины вызывать при введении в организм какие-либо побочные эффекты (повышение температуры тела, местный отек и др.). Иммуногенность — способность антигена вызывать иммунный ответ вне зависимости от его иммунной специфичности. Степень иммуногенности зависит не только от свойств молекулы антигена, но и от условий введения в организм, а также дополнительных воздействий. применяют для экстренной профилактики или лечения инфекционных заболеваний. 36. Диагностические препараты. Антигенные препараты (диагностикумы, эритроцитарные диагностикумы, антигены). Идентификация вирусов, бактерий, грибов, а также диагностика инфекционных и неинфекционных заболеваний производится с помощью специальных диагностических препаратов. Такие препараты позволяют достоверно выявлять аллергические и иммунопатологические расстройства, определять иммунный статус и иммунологическую совместимость тканей. Диагностикумы представляют собой взвесь убитых бактерий, либо антигенов, которые используются в серологических исследованиях, а также для того чтобы определить наличие антител в сыворотке крови. В диагностиках содержатся в зависимости от их целевого назначения различные иммунореагенты (иммуномодуляторы, антитела, антигены, аллергены). Идентифицировать микроорганизмы можно также с помощью реакции иммунитета больного на диагностические иммунные сыворотки. В диагностических целях при обнаружении антител в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосителей используются серологические реакции. Для постановки таких реакций применяются диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроорганизмов или определенные антигены. Необходимость использования диагностикумов для серологических реакций связана не только с явным их преимуществом перед живыми культурами микробов (безопасность в работе), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувствительностью к антителам и способностью длительно сохранять антигенные свойства. Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко. В серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы. Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации. Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами. Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации. 37. Диагностические сыворотки. Получение и применение. Способ получения адсорбированных агглютинирующих сывороток по Кастеллани. Диагностические сыворотки (диагностикумы) представляют собой взвесь убитых бактерий определенного вида. К диагностическим специфическим сывороткам, применяемым для обнаружения в тех или иных материалах антигенов или для определения вида и даже типа микроба или вируса, относятся агглютинирующие, преципитирующие и лизирующие (комплементсвязывающие). Такая классификация основана на функциональной способности специфических гамма-глобулинов склеивать (агглютинировать), осаждать (преципитировать), растворять (лизировать) соответствующие антигены. Наиболее широко агглютинирующие сыворотки применяют при дифференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, рода Brucella, Listeria, возбудителей риккетсиозных и вирусных инфекций. Агглютинирующие сыворотки готовят путем гипериммунизации животных различными корпускулярными антигенами, введением их парентеральным путем. В качестве антигенов используют живые или убитые различными способами культуры соответствующих микробов. Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы. Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки обладают высоким титром — до 1 : 12 800 — 1 : 25 600. Для получения таких сывороток применяют метод Кастелляни — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственными гетерогенными бактериями происходит адсорбция групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворотке. В зависимости от полноты истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные сыворотки — сыворотки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглютинации с двумя — тремя родственными бактериями, имеющими общий антиген, в отношении которого проводилась адсорбция. Адсорбированные сыворотки применяют при идентификации выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод). Преципитирующие сыворотки предпочтительно готовят для диагностики сибирской язвы. Иммунизируют внутривенным способом лошадей слабовирулентной культурой возбудителя сибирской язвы. Реакции преципитации используют в судебно-медицинской и ветеринарной экспертизе. При ряде инфекционных заболеваний образуются так называемые комплементсвязывающие антитела. При их определении в практике используются специфические диагностические сыворотки, содержащие такие антитела. Показательным примером является приготовление специфических диагностических ящурных сывороток. Идентификацию штамма циркулирующего вируса ящура проводят с помощью реакции связывания комплемента (РСК). Специфическую типовую и вариантную сыворотки получают от морских свинок, которых заражают вирусосодержащей суспензией соответствующего типа, Диагностические комплементсвязывающие сыворотки используются как контрольные при постановке РСК на бруцеллез, сап, кампилобактериоз, вирусные респираторные болезни, грипп и другие бактерийные, вирусные и паразитарные инфекции. При постановке РСК непременным условием является применение в качестве одного из ее компонентов комплемента. Комплемент-- это неспецифический фактор гуморального иммунитета, содержащийся в сыворотках крови теплокровных и холоднокровных животных. Наиболее изучен комплемент морской свинки. Поэтому при постановке РСК в качестве комплемента используют сыворотку крови морских свинок. 38. Аллергия. Классификация гиперчувствительности по Джеллу и Кумбсу. ^ Аллергические заболевания широко распространены, что связано с рядом отягощающих факторов - ухудшением экологической обстановки и широким распространением аллергенов, усилением антигенного давления на организм (в том числе- вакцинация), искусственным вскармливанием, наследственной предрасположенностью. Аллергия ( allos + ergon, в переводе- другое действие) - состояние патологически повышенной чувствительности организма к повторному введению антигена. Антигены, вызывающие аллергические состояния, называют аллергенами. Аллергическими свойствами обладают различные чужеродные растительные и животные белки, а также гаптены в комплексе с белковым носителем. ^ Аллергические реакции - иммунопатологические реакции, связанные с высокой активностью клеточных и гуморальных факторов иммунной системы (иммунологической гиперреактивностью). Иммунные механизмы, обеспечивающие защиту организма, могут приводить к повреждению тканей, реализуясь в виде реакций гиперчувствительности. ^ Классификация Джелла и Кумбса выделяет 4 основных типа гиперчувствительности в зависимости от преобладающих механизмов, участвующих в их реализации. По скорости проявления и механизму аллергические реакции можно разделить на две группы - аллергические реакции (или гиперчувствительность) немедленного типа (ГНТ) и замедленного типа (ГЗТ). ^ Аллергические реакции гуморального (немедленного) типа обусловлены главным образом функцией антител классов IgG и особенно IgE (реагинов). В них принимают участие тучные клетки, эозинофилы, базофилы, тромбоциты. ГНТ делят на три типа. По классификации Джелла и Кумбса к ГНТ относятся реакции гиперчувствительности 1, 2 и 3 типов, т.е. анафилактическая (атопическая), цитотоксическая и иммунных комплексов. ГНТ характеризуется быстрым развитием после контакта с аллергеном (минуты), в ней участвуют антитела. Тип 1. ^ Анафилактические реакции - немедленного типа, атопические, реагиновые. Они вызываются взаимодействием поступающих извне аллергенов с антителами класса IgE, фиксированными на поверхности тучных клеток и базофилов. Реакция сопровождается активацией и дегрануляцией клеток- мишеней с высвобождением медиаторов аллергии (главным образом гистамина). Примеры реакций типа 1 - анафилактический шок, атопическая бронхиальная астма, поллиноз. Тип 2. ^ Цитотоксические реакции. В них участвуют цитотоксические антитела (IgM и IgG), которые связывают антиген на поверхности клеток, активируют систему комплемента и фагоцитоз, приводят к развитию антитело- зависимого клеточно- опосредованного цитолиза и повреждения тканей. Пример- аутоиммунная гемолитическая анемия. Тип 3. ^ Реакции иммунных комплексов. Комплексы антиген- антитела откладываются в тканях (фиксированные иммунные комплексы), активируют систему комплемента, привлекают к месту фиксации иммунных комплексов полиморфноядерные лейкоциты, приводят к развитию воспалительной реакции. Примеры- острый гломерулонефрит, феномен Артюса. ^ Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) - клеточно- опосредованная гиперчувствительность или гиперчувствительность типа 4, связанная с наличием сенсибилизированных лимфоцитов. Эффекторными клетками являются Т- клетки ГЗТ, имеющие CD4 рецепторы в отличие от CD8+ цитотоксических лимфоцитов. Сенсибилизацию Т- клеток ГЗТ могут вызывать агенты контактной аллергии (гаптены), антигены бактерий, вирусов, грибов, простейших. Близкие механизмы в организме вызывают антигены опухолей в противоопухолевом иммунитете, генетически чужеродные антигены донора- при трансплантационном иммунитете. Т- клетки ГЗТ распознают чужеродные антигены и секретируют гамма- интерферон и различные лимфокины, стимулируя цитотоксичность макрофагов, усиливая Т- и В- иммунный ответ, вызывая возникновение воспалительного процесса. Исторически ГЗТ выявлялась в кожных аллергических пробах (с туберкулином- туберкулиновая проба), выявляемых через 24 - 48 часов после внутрикожного введения антигена. Развитием ГЗТ на вводимый антиген отвечают только организмы с предшествующей сенсибилизацией этим антигеном. Классический пример инфекционной ГЗТ - образование инфекционной гранулемы (при бруцеллезе, туберкулезе, брюшном тифе и др.). Гистологически ГЗТ характеризуется инфильтрацией очага вначале нейтрофилами, затем лимфоцитами и макрофагами. Сенсибилизированные Т- клетки ГЗТ распознают гомологичные эпитопы, представленные на мембране дендритных клеток, а также секретируют медиаторы, активирующие макрофаги и привлекающие в очаг другие клетки воспаления. Активированные макрофаги и другие участвующие в ГЗТ клетки выделяют ряд биологически активных веществ, вызывающих воспаление и уничтожающих бактерии, опухолевые и другие чужеродные клетки - цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, альфа- фактор некроза опухолей), активные метаболиты кислорода, протеазы, лизоцим и лактоферрин. ^ Методы лабораторной диагностики аллергии : выявление уровня сывороточных IgE, фиксированных на базофилах и тучных клетках антител класса Е (реагинов), циркулирующих и фиксированных (тканевых) иммунных комплесов, провокационные и кожные пробы с предполагаемыми аллергенами, выявление сенсибилизированных клеток тестами in vitro - реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), цитотоксические тесты. |