биотехнология ответы на экзамен. биотехнология экзамен. 1. Предмет и задачи биотехнологии. Объектами биотехнологии

• Название: 1. Предмет и задачи биотехнологии. Объектами биотехнологии
• Анкор: биотехнология ответы на экзамен
• Дата: 29.04.2022
• Размер: 264.41 Kb.
• Имя файла: биотехнология экзамен.docx
• Тип: Задача; #503803
• страница: 3 из 10

Базовые штаммы.

Во многих биотехнологических процессах используются GRAS-микроорганизмы (generally recognized as safe), которые обычно считаются безопасными.

1) Бактерии Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, другие виды бацилл и лактобацилл, виды Streptomyces.

2) грибы Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и дрожжей Saccharomyces и др.

GRAS-микроорганизмы непатогенные, нетоксичные и в основном не образуют антибиотики, поэтому при разработке нового биотехнологического процесса следует ориентироваться на данные микроорганизмы, как базовые объекты биотехнологии

12.Требования к продуцентам, используемым в биотехнологическом производстве.

Требования к штаммам-продуцентам ферментов:

1) желательно образование внеклеточных ферментов, так как их легче выделить;

2) высокий выход фермента за короткое время;

3) очистка фермента от культуральной жидкости должна быть легкой;

4) штаммы не должны продуцировать антибиотики, токсичные вещества и не должны быть родственны штаммам, образующим токсины.

Критерии при выборе биотехнологического объекта:

1) Способен синтезировать целевой продукт.

2) Имеет высокую скорость роста;

3) Растет на доступных и недорогих питательных субстратах;

4) Устойчивость к заражению посторонней микрофлорой.

5) Непатогенный и не токсигенный для человека и животных, безопасный для окружающей среды.

Требования к продуцентам в биотехнологии

Штамм-продуцент должен характеризоваться следующими свойствами:

1) способностью расти в чистой культуре и генетической стабильностью;

2) отсутствием патогенности и токсичности;

3) высокой скоростью роста при промышленном культивировании и способностью синтезировать продукт в большом количестве и за короткий промежуток времени;

 4) устойчивостью к контаминации (например, за счет изменения физико-химических условий среды, способности к росту при повышенных температурах или к синтезу антибиотиков);

5) способности расти на недорогих и доступных питательных средах

13.Выделение и селекция микроорганизмов – продуцентов биологически активных веществ.

Получ-е ген рекомбинантов; у м.о. они получ путем слияния протопластов ( разрушкл стенки, соед-е 2х кл путем электрослияния, образ 2 генома в 1кл); дост-во этого метода сост в возм-тисовмещ в 1м геноме различн мутаций из разных родит штаммов,не прибегая к дополнит мутаген обраб и поиску нужной мутации у исходного штамма. Прим-е горизонт переноса генетического материала (коньюгация); Генетич инжененрия – введ-е чужер гена д/производ-тим.о. и оптимизации экспрессии гена (исп-е гормонов и Б-иммуномодуляторов)

А) Ген рекомбинация перераспред гены/их части и позвобъед в одном геноме признаки 2х организмов и более. В рез-те образ гибридн/рекомбикл, сочетающие св-ва родит форм. В опыты по гибридизации берут генетически марки­рованные штаммы м.о. - чаще всего ауксотрофн мутанты и мутанты, уст к ингибиторам роста. Это по­зв выявлять колонии, совмещ признаки 2х роди­телей. Гибрид-я промышл штаммов дрожжей осложняется тем, что они часто полиплоидны:содне­ск наборов хр-м, и у них редко набл слияние кл. Б) Важным комп-том бактерклявлкольц мол ДНК – плазмида,кот м находиться в автономном и в интегрированном сост по отн к хр-ме клетки- хозяина. Конъюгативнплазмидыспо­с к мобилизации хромосомных генов, что я исп д/получгенетичрекомбичантов у бактВпервыеконъюг перенос хромосомных генов был обна­ружен у Е. соli.Для конъюгационногоскрещ-я культуры донора и ре­ципиента смеш и инкубируют совместно в пит бульоне/ на пов-титвагаризованных сред. В этих услклсоед м-ду собой при помконъюгац мостика, ч/з кот в рецип клетку начиная с сайта ori Т плазмиды поступает хромосома донора. Почти кажд вид бактявл хозяином 1/ несквирулент/уме­ фагов, кот явлважн инструмен­том ген анализа и конструир-я штаммов бакте­рий с пом трансдукции и методов генетической инже­нерии. Трансдукция— перенос ген инф от клетки донора к клетке-реципиенту, кот осущ фагом. Оно основано на том, что в процразмн-я фагов в бакт иногда обр-ся частицы, кот наряду с фаговой ДНК или вместо нее сод фрагменты бактер ДНК. Такие ч-цыназтрансдуцирующими. Отбор рекомбинантов, кот назтрансдуктантами, проводят на селек­тивных средах, где не могут расти исходные реципиентныеклетки.Гл этапом обр-я трансдуиирующих ч-ц яв­лпроцупак ДНК.У разн фагов специф-тьупакки меняется в широких пределах по виду пакуемой ДНК (фаговая/бактер) и по сте­пени взаимод-я с различн участками на бактерДНК.Приобрспецифичтрансдуиирующих фагов в головку упак только фаговая ДНК и только с опредучастка.Если к ней присоед отрезок бакте­рДНК, прилеж к профагу, то они м быть упа­кованы вместе. При неспецифичтрансдукции фаговые оболочки могут начать упаковываться не только с фаговой, но и с бактерДНК в различных участках, специфичность кот м быть неодинак. Если упаковка началась с бактериальной ДНК, то головка фага полностью заполняется только ею, а избыток ДНК удаляется.

14.Использование мутагенеза для селекции штаммов.



В качестве мутагенных воздействий применяются УФ, рентгеновское и гамма-излучения, определенные химические вещества и др.

Недостатки: трудоемкость, отсутствие сведений о характере изменений, поскольку экспериментатор ведет отбор по конечному результату.

15.Отбор ауксотрофных мутантов и мутантов, устойчивых к антибиотикам как способ получения продуцентов биологически активных веществ.

Уровень экспрессии структурных генов может быть изменен в результате мутаций. Целенаправленная селекция перспективных мутантов –основная задача биотехнологии,т.к дефекты в регуляции обмена вещест обеспечивают синтез целевых продуктов метаболизма.Мутации по участкам цистрона могут провести к изменениям в конформации белка, которые делают молекулу энзима нечувствительной к концентрации конечного продукта.Это обеспечивает возможность образовывания в клетке избыточного количества целевого продукта. Мутации в гене-регуляторе проводят таким образом,чтобы его продукт белок-репрессор утрачивал способность связываться с индуктором или оператором.Мутантные организмы у которых изменены нуклеотидные последовательности в зоне гена-оператора не могут связывать нормальноый репрессор и также обретают способность к конститутивной экспрессии структурных генов.Мутанты с ограниченной способностью к образовыванию конечных продуктов называются ауксотрофными.Благодаря отсутствию ингибитора-конечного продукта использование субстрата и рост м/о продолжаются лишь при условии добавления в среду в литмитирующих количествах вещества-продукта блокированной реакции.Для отбора ауксотрофных мутантов и регуляции обмена веществ испол. След методы селекции:

1.получение мутантов,устойчивых к структурным аналогам целевого продукта

2.выделене ревентрантов из ауксотрофных мутантов.Уних восстановлена способность к синтезу конечного продукта

16.Генетическая инженерия и технология рекомбинантных ДНК. Основные открытия, обосновавшие теоретически технологический подход к наследственной информации.

Генетическая инженерия– технология получения новых комбинаций генетического материала путем проводимых in vitro манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) и переноса созданных конструкций генов в реципиентный организм.

По Э.С. Пирузян генетическая инженерия- система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, биохимии нуклеиновых кислот и др.

Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П. Бергом с сотр.) и была со­ставлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бакте­риофага X dvgal с галактозным опероном Е. coli.

Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

Цель генетической инженериизаключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками

Возможность конструировать новые гибридные молекулы ДНК in vitro возникла благодаря сделанным в середине XX в. открытиям:

1) установление комплементарной структуры ДНК,

2) механизма ее репликации и репарации,

3) расшифровка генетического кода,

4) установление механизма переноса генетической информации в клетке,

5) механизмов работы и регуляция генов и др.

Молекуларекомбинантной ДНКпредставляет собой соединенные вне живой клетки два компонента:

1) вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии,

2) фрагментклонируемой(«чу­жеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя гене­тические элементы.

Технология рекомбинантных ДНК– совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала из одного организма в другой.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

1) специфическое расщепление ДНК ферментами- рестрицирующими нуклеазами, для выделения и манипуляции с отдельными генами;

2) секвенирование (определение последовательности) всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность;

3) конструирование рекомбинантной ДНК;

4) гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

5) клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

6) введение рекомбинантной ДНКв клетки или организмы.

17.Инструменты генетической инженерии.

Инструментами в технологии рекомбинантных ДНКявляются ферменты нуклеинового обмена и, прежде всего, эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы).

В природе рестриктазы являются компонентом системы рестрикции-модификации, которая служит защитным механизмом от чужеродной ДНК у микроорганизмов Все ферменты нуклеинового обменаусловно можно разделить на следующие группы:

используемые для получения фрагментов ДНК (рестриктазы);

синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК (ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы (ревертазы), фосфатазы, полинуклеотидкиназы );

соединяющие фрагменты ДНК (ДНК-лигазы);

позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК;

применяемые для приготовления гибридизационных проб.

.В эту систему входят два фермента, специфичных для каждого штамма:

1) ДНК модифицирующий (метилтрансфераза, или метилаза). Метилтрансфераза, метилируя определенный нуклеотид в пределах сайта узнавания, защищает внутриклеточную ДНК от действия рестриктазы.

2) ДНК расщепляющий (эндонуклеаза рестрикции), Рестриктаза расщепляет фосфодиэфирные связи двухцепочечной ДНК в определенном месте участка узнавания или рядом с ним при отсутствии специфической модификации Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) II типаузнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи в определенном месте.

18.Метод полимеразной цепной реакции.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)делает возможным быстрый синтез (амплификацию) в пробирке нужных последовательностей из считанных исходных копий.

Для проведения амплификации нужны следующиекомпоненты:

ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

Праймеры (синтетические олигонкулеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента).

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК)

Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлиннение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК)

Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента) .

ПЦР представляет собой серию из трех циклически повторяющихся стадий реакции (15–30 циклов по 1–3 мин):

1) тепловая денатурация исходной ДНК при 94 °С;

2) отжиг ДНК-затравок (праймеров) при 50–60 °С на получившиеся одноцепочечные матрицы;

3) синтез двухцепочечных ДНК при 72 °С с каждым из праймеров навстречу друг другу по противоположным цепям ДНК Реакцию проводят в амплификаторе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок.

По завершении каждого цикла количество синтезированного продукта удваивается и происходит увеличение количества исходных копий ДНК в геометрической прогрессии.

Важнейшим компонентом ПЦР являются термостабильные ДНК-полимеразы, способные сохранять активность на протяжении всей реакции ПЦР, несмотря на воздействие высоких температур на стадии тепловой денатурации ДНК.

Применение ПЦР:

Фундаментальная наука и практика

• секвенирование (определение нуклеотидной последовательности )

• клонирование генов

• генная инженерия

• направленный мутагенез.

Клиническая лабораторная диагностика

• диагностика вирусных инфекций (ВИЧ, гепатит, половые инфекции и др.)

• диагностика генных болезней (выявление мутаций)

• судебная медицина

19.Векторные системы, применяемые для клонирования в клетках прокариотических организмов.

Для прокариот сконструированы векторные молекулы - «челночные векторы».

Они способны к репликации в разных клетках-хозяевах, что обеспечивается введением в вектор дополнительных областей начала репликации (ori), а также генов, требуемых для репликации и не поставляемых хозяйскими клетками.

Одни из челночных векторов способны поддерживаться в клетках разных прокариот, другие — в клетках некоторых прокариот и эукариот (дрожжей, растений, животных).

Использование челночных векторов удобно для клонирования генов и анализа их продуктов, поскольку одни и те же гены получают возможность реплицироваться и экспрессироваться в разных организмах

20.Характерные свойства векторов молекулярного клонирования.

Векторами для молекулярного клонированияявляются молекулы ДНК, которые могут доставлять в клетку-хозяина чужеродную ДНК.

Векторами для клонированияявляются:

Плазмиды – кольцевые двухцепочечные экстрахромосомные самореплицирующиеся молекулы ДНК бактерий. В плазмидах клонируют фрагменты ДНК до 10 т.п.н.

Фаги. Первыми были разработаны векторы на основе фага λ E. coli. ДНК фага λ составляет примерно 50 т.п.н. Значительная часть (20т.п.н.) несущественна для размножения фага и может быть заменена на чужеродную ДНК. В фаге можно клонировать фрагмент ДНК до 20т.п.н. Космиды– векторы, объединяющие в себе свойства плазмиды и фага. Созданы искусственно. Могут амплифицироваться в бактерии как плазмиды и упаковываться в фаговые головки. Могут включать вставку чужеродной ДНК до 40т.п.н.

Искусственная дрожжевая хромосома (yeast artificial chromosome –YAC). Вектор разработан на основе ДНК дрожжей. Применяются для клонирования больших фрагментов ДНК (от 100 до 1000 т.п.н.) эукариот.

 Характерные свойства векторов молекулярного клонирования

1) вектор должен реплицироваться в клетке-хозяине;

2) вектор должен иметь один или несколько селективных маркеров (генов), позволяющих легко отличить клетки, несущие вектор, от нетрансформированных клеток;

3) вектор должен содержать максимальное число уникальных сайтов рестрикции, в которые может быть осуществлена вставка гетерологичной ДНК;

4) идеальный вектор должен дополнительно содержать маркер, который может быть активирован или инактивирован путем встраивания фрагментов гетерологичной ДНК;

5) вектор должен быть небольшим, так как эффективность трансформации клеток-хозяев снижается по мере увеличения раз- мера плазмиды до 15 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.) и выше;

6) вектор должен быть хорошо охарактеризован относительно числа генов и их расположения, а также сайтов рестрикции и нуклеотидной последовательности

21.Векторы на основе плазмид.

Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов исполь­зуют плазмиды.

Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), стабильно насле­дуемые.

Они представляют собой двуцепочечные кольцевые моле­кулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. По разме­ру они соответствуют 1 — 3 % генома бактериальной клетки.

Плазмиды разделяют на конъюгативные, способ­ные сами перенестись в реципиентные клетки с помощью конъю­гации, и не конъюгативные, не обладающие этим свойством.

Плазмиды могут иметь в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов (R-плазмиды), гены, контролирующие катаболизм некоторых органических соединений (плазмиды биодеградации, или D-плазмиды).

Поскольку эти гены находятся в плазмидах, они представлены гораздо большим числом копий.

Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR 322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из E. coli.

Эта плазмида содержит гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину и тетрациклину, причем в генах устойчивости к этим антибиотикам имеются сайты рестрикции.

Если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется.

Успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов можно определить по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику. Но при этом сохраняется устойчивость к другому антибиотику.

Таким образом вектор дает возможность детектировать только те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду. Место начала репликации должно обеспечивать увеличение числа копий этой ДНК в клетке бактерий и тем самым передачу плазмиды в дочерние клетки при размножении бактерий.

Ген устойчивости к антибиотику ампициллину позволяет отобрать те бактерии, в клетках которых имеется плазмида-вектор.

Ген устойчивости к тетрациклину позволит определить, в каких бактериях находится плазмида, имеющая в своем составе фрагмент с клонируемым геном.

Рекомбинантные клетки будут расти на питательной среде с Ap, но не будут на среде с Tc.

В пределах последовательности определяющего устойчивость бактерий к тетрациклину гена имеются места узнавания для нескольких рестриктаз - HindIII, Bam HI и SalI.

При обработке любой из этих рестриктаз ДНК плазмиды-вектора в пределах гена tet появятся «липкие концы», по которым и может произойти встраивание клонируемого фрагмента.

Если встраивание действительно осуществляется, ген тетрациклинустойчивости, оказывается «разорван» встроившимся фрагментом ДНК.

Поэтому содержащие такую плазмиду бактерии уже не могут образовывать кодируемый геном Tet белок и размножаться на среде с тетрациклином

Поскольку плазмиды со встроенным фрагментом являются целью процесса, необходимо выделить такие плазмиды и клонировать их. Процесс идёт следующим образом:

1) Плазмиды внедряются в клетки E. coli. Для этого клетки обрабатываются ионами Ca²⁺, что делает их мембраны проницаемыми для ДНК.

2) Полученные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. В этой среде нормально растут колонии бактерий, содержащие плазмиды, остальные колонии угнетаются. По этому признаку можно отличить бактерии, содержащие плазмиды;

3) Колонии, содержащие плазмиды, перепечатываются на среду, содержащую тетрациклин. Поскольку чужеродная ДНК вклинивается внутрь гена tet, дезактивируя его, колонии бактерий с модифицированными плазмидами угнетаются тетрациклином. Таким образом они визуально отличимы от колоний бактерий с восстановленными плазмидами.

4) В результате этих действий выделяются колонии E. coli, в плазмиды которых встроен участок чужеродной ДНК. Они высеваются в обычную среду для дальнейшего клонирования.

Недостаток плазмидных векторов - в снижении числа копий на клетку при увеличении размера гибридной плазмиды. В результате клонирование фрагментов ДНК, превышающих 10 т. п. н., становится малоэффективным.