биотехнология ответы на экзамен. биотехнология экзамен. 1. Предмет и задачи биотехнологии. Объектами биотехнологии
 Скачать 264.41 Kb.
|
|
54.Протопласты растительных клеток, их получение, методы регенерации и культивирования. Изолированный протопласт – это содержимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой. Протопласт (от греч. Protos - первый и platos - вылепленный, образованный) - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, способная осуществлять активный метаболизм, выполнять биосинтез и трансформировать энергию. Главное достоинство протопластов – простота введения генетической информации из органелл и клеток других растений, бактерий и клеток животных. Изолированные протопласты способны к слиянию, в результате чего можно добиться получения гибридов от таксономически отделенных видов. Основными этапами при получении протопластов являются следующие: 1) удаление эпидермиса в стерильных условиях; 2) измельчение ткани; 3) помещение в мацерирующий раствор, состоящий их сахара, минеральных солей, ферментов типа целлюлаз, пектиназ, гемицеллюлаз; 4) отделение образовавшихся протопластов путем фильтрования, центрифугирования и др.; 5) промывание протопластов. Для выделения протопластов существуют 2 принципиальных подхода. 1) заключается в механическом удалении клеточной стенки в среде, содержащий осмотический стабилизатор. 2) ферментативное удаление клеточной стенки. При этом желательным является удаление клеточной стенки без необратимых изменений (лизиса, разрушения клетки и пр Среда при выделении протопластов должна содержать несколько необходимых компонентов: 1) осмотический стабилизатор. Сахар или солевой раствор в концентрации 0,3 – 0,7 М; 2) солевую основу; 3) ферментные препараты, от состава, концентрации и времени действия которых зависит дальнейшая судьба протопластов. Их выбор обусловлен строением клеточной стенки растений. Такие препараты получают из бактерий и грибов. Время выделения протопластов зависит от концентрации ферментов и может составлять от 1-4 до 18-20 часов. При культивировании протопластовбольшое значение имеет рН (кислое), температура культивирования, освещенность, плотность высева протопластов. При правильно подобранных условиях выделения и культивирования, через 3-4 суток наблюдается первое деление и соответственно регенерация клеточной стенки. Затем образуются многоклеточные агрегаты, развивающиеся в каллус, способные регенерировать целые растения. 55.Слияние протопластов растительных клеток. Гибридизация соматических клеток растений. Использование изолированных протопластов стало особенно перспективными после разработки метода их слияния. В качестве индукторов при слиянии протопластов используются концентрированные растворы солей (нитраты натрия и калия, хлористый кальций и др.), поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль. ПЭГ – сильно гидрофильное вещество, способное связывать значительные количества воды. Мембраны могут слипаться и сливаться в последующем. ПЭГ является сильным стимулятором эндоцитоза, в его присутствии клетки способны поглощать крупные частицы: хлоропласты, бактерии, липосомы Во всех случаях слияния на первом этапе происходит их агрегация, которая связана с изменением электрических свойств поверхностей: снижается отрицательный заряд и отталкивание протопластов. На втором этапе происходит собственно слияние мембран в результате увеличения их текучести На основе метода слияния протопластов был разработан метод соматической гибридизации растений. Суть его состоит в том, что в качестве родительских используются не половые, а соматические клетки тела растений, из которых получают протопласты. Соматический гибрид- продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цитоплазматический гибрид) – растение - регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Скрининг таких клеток проводится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Используются большие популяции обоих родителей. Основная задача – выделить из общей массы гибридные экземпляры. В качестве селективных маркеров могут выступать, например, пластиды. Такая селекция была проведена при слиянии клеток моркови и табака. Существуют и другие способы отбора: физическое обогащение, механическая изоляция и т.п. Соматическая гибридизацияимеет важные особенности. 1) этому процессу доступны практические любые скрещивания. 2) слияние протопластов способствует объединению цитоплазматических генов родительских клеток, чего не бывает при скрещивании половых. 56.Клональное микроразмножение растений. Клональное микроразмножение растений- размножение растений in vitro неполовым путем с помощью метода культуры тканей, позволяющее получать растения генетически идентичные исходному. В основе лежит способность соматической растительной клетки полностью реализовать потенциал своего развития (тотипотентность). Клональное микроразмножение растенийимеет следующие преимущества: 1) высокий коэффициент размножения. Например, герберы при клональном размножении могут давать до 1 млн растений в год, тогда как при обычных способах только 100. 2) Получение генетически однородного материала. 3) Возможность оздоровления растений, освобождения их от вирусов благодаря клонированию меристематических тканей. 4) Воспроизведение посадочного материала круглый год. 5) Возможность размножения растений, которые в естественных условиях репродуцируются трудно. 6) Сокращение продолжительности селекционного При клональном микрооразмножении используется материал, полностью сохраняющий генетическую стабильность, т.е. меристематические ткани. Меристематические ткани — обобщающее название для тканей растений, состоящих из интенсивно делящихся и сохраняющих физиологическую активность на протяжении всей жизни клеток, обеспечивающих непрерывное нарастание массы растения и предоставляющих материал для образования различных специализированных тканей В качестве экспланта желательно использовать молодые, слабодифференцированные ткани. Лучше всего использовать экспланты, содержащие меристемы: кончики стеблей, пазушные почки, зародыши, молодые листья, черенки, соцветия, чешую луковиц. Обязательное условие клонального микроразмножения– использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса, от экспланта до растений в поле. Такому требованию удовлетворяют стеблевые апексы и пазушные почки органов стеблевого происхождения, т. е. меристематические ткани. Процесс клонального микроразмноженияможно разделить на следующие стадии: 1.Выбор растения - донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры 2.Собственно микроразмножение путем микрочеренкования, активизации меристем, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов. 3.Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений - регенерантов при пониженной температуре (+2°С, +10°С). 4.Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле. Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования (удаление верхушечной меристемы, добавление цитокининов). Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков. Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro, а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений. 57.Культивирование клеток и тканей животных. Приемы культивирования в суспензионной культуре и в адгезированном состоянии. Культивирование клеток– это метод сохранения и выращивания клеток вне организма в искусственно созданных условиях. используется два направления в культивировании животных клеток: 1) культура клеток 2) культура органов и тканей. Для ведения культуры клеток используются различные источники. Таковыми могут являться взрослые или эмбриональные ткани, а также нормальные и опухолевые. Каждая такая культура клеток будет характеризоваться рядом морфологических, биохимических и физиологических особенностей. Наиболее часто культивируются следующие элементы: 1) соединительной ткани – фибробласты; 2) скелетной – кость и хрящи; 3) мышечной – скелетные, сердечные и гладкие мышцы; 4) эпителиальной – печень, легкие, кожа, мочевой пузырь, почки, молочная железа; 5) нервной – глиальные клетки и нейроны (хотя они лишены способности к пролиферации); 6) эндокринной системы – гипофиз, надпочечники, клетки островков Лангерганса; 7) различные типы опухолевых клеток. различают 3 основных типа культур животных клеток: 1)первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева; 2)диплоидные культуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие до 50 пересевов диплоидный набор хромосом; 3) трансформированные постоянные гетероплоидные культуры, способные к существованию вне организма неограниченно долгое время. Культуры тканей могут подразделяться 1) по виду животного, от которого они происходят; 2) по типу ткани-источника; 3) по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные, опухолевые), 4) по способу выращивания (монослойные, суспензионные, на микроносителях и т. п.). Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной дезагрегации Образованиепостоянной клеточной культурыотражается на комплексе морфофизиологических особенностях клеток: уменьшение размеров клеток, падение адгезивности клеток, округление клеток, увеличение ядерно/цитоплазматического отношения, увеличение времени удвоения клеток с 3 часов до 12 часов Суспензионное культивирование Первые суспензионные культуры клеток животных, как правило, основывались на клетках злокачественных тканей. Это — клетки HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют. Но если некоторые клетки культивировать во вращающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу (0,1-0,2%), предотвращающую агрегацию клеток, можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы. для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния с последующим длительным периодом адаптации, сопровождающимся различными манипуляциями, предотвращающими возврат к монослою. Перемешивание осуществляют лопастными магнитными мешалками (100-200 об/мин) и круговыми качалками (15-40 об/мин). Для предотвращения оседания клеток на стенки сосудов производят их силиконирование, поскольку силиконовое покрытие в силу своей гидрофобности препятствует прикреплению клеток. такие манипуляции при введении клеток в суспезию необходимы не во всех случаях. Некоторые клетки (трансформированные клетки, кроветворные клетки и асцитные опухоли) способны расти как на субстрате, так и в суспензии в зависимости от солевого состава среды культивирования. А культуры лимфоцитов вообще не обнаруживают тенденции к адгезии к поверхности субстрата и выживают на дне культивационного сосуда под тонким слоем среды. Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд наполнен средой наполовину. Для обеспечения этих условий необходимо каждый день или – в случае медленно растущих культур – через день удалять половину суспензии через боковое горлышко и добавлять равный объем свежей среды. Максимальный рост клеток в суспензии наблюдают при рН 7,0-7,2. Суспензионные культуры широко используется в вирусологических исследованиях и для накопления больших количеств вируссодержащего материала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов. 58.Получение трансгенных организмов. Трансгенный организм - организм, геном кот. содержит чужеродный ген. материал, включенный методами генной инженерии. Трансгенные организмы - животные, растения, м/о, вирусы, генетическая программа кот. изменена с применением методов генной инженерии. Получение трансгенных организмов предст. собой альтернативу традиционным методам селекции жив. и раст. Необходимые условия для осуществления генной инженерии: 1. Нужен такой биообъект, который способен синтезировать чужеродный белок, воспринимал бы и передавал генетическую информацию. 2. Организм человека не должен отторгать продукт, синтезированный продуцентом. 3. Клетка должна делиться, необходимо, чтобы гены, продуцирующие целевой продукт у клеток, образующихся после деления, экспрессировались (работали). 4. Необходимо иметь транспортное устройство для внесения ДНК в клетку продуцента: вектор в виде плазмид, космиды, фага. Вектор вводится разными путями: 1. коньюгация – генетический материал клеток при сближении переходит из одной клетки в др. в виде плазмиды. 2. трансдукция – передача клетке генетического материала через вирус или фаг. 3. трансформация – передача клетке генетического материала изолированной ДНК, в результате чего изменяется геном. Процесс трансформации – перенос ген. материала, при кот. фрагмент ДНК, выделенный из клетки донора, поступает в клетку-реципиент. В генной инженерии включение нового гена происх. с пом. фермента рестриктазы. Рестриктаз в клетке может быть очень много. Рестриктазы разрушают фосфодиэфирные связи м/у нуклеотидами в строго определенном месте, т.е. они обладают строгой специфичностью, действуя на определенную посл-ть нуклеотидов в цепи. После разрыва связей образуются «липкие концы» и в разрывы включаются гены с помощью ферментов ДНК-лигаз, кот. соединяют нуклеотиды м/у собой. Рестриктаза действует в строго определенной последовательности на одну нить ДНК. Другая рестриктаза расщепляет вторую нить ДНК на другом участке. Рестриктазы расщепляют ковалентные фосфодиэфирные связи м/у нуклеотидами. После расщепления связей образуются «липкие концы» и в место разрыва можно включить ген, кот. «сшивается с ДНК с пом. ДНК-лигаз. 59.Производство белка одноклеточных организмов. БОО - это высококачественный продукт, т.к. содержание белка может достигать 60% от сухой массы. При этом такой продукт содержит определенное количество углеводов, витаминов, микро- и макроэлементов. Отсутствие посевных площадей. Процесс не зависит от погоды, климата, поддается точному планированию и автоматизации. Получаемые продукты стандартны, возможна утилизация промышленных отходов. Для микробного белка придумано специальное название — белок одноклеточных организмов (БОО). Производство его связано с крупномасштабным выращиванием определенных микроорганизмов, которые собирают и перерабатывают в пищевые продукты. В основе лежит технология ферментации — ветвь бродильной промышленности и производства антибиотиков. Чтобы осуществить возможно более полное превращение субстрата в биомассу микробов, требуется многосторонний подход. Выращивание микробов в пищевых целях представляет интерес по двум причинам. Во-первых, они растут гораздо быстрее, чем растения или животные: время удвоения их численности измеряется часами. Это сокращает сроки, нужные для производства определенного количества пищи. Во-вторых, в зависимости от выращиваемых микроорганизмов в качестве субстратов могут использоваться разнообразные виды сырья. Что касается субстратов, то здесь можно идти по двум главным направлениям: перерабатывать низкокачественные бросовые продукты или ориентироваться на легкодоступные углеводы и получать за их счет микробную биомассу, содержащую высококачественный белок. И в том и в другом случае технология ферментации играет ключевую роль. Здесь важно подобрать оптимальный состав среды, создать определенные условия для роста, разработать конструкции ферментеров, правила их эксплуатации и системы контроля, выработать методы отделения биомассы от культуральной среды. Промышленное производство белка одноклеточных организмов всегда осуществляется методом глубинного культивирования в жидких средах; применяются как одноэтапное, так и непрерывное культивирование. Непрерывное культивирование сложнее, чем одноэтапное, но более экономично: производительность ферментеров выше. Именно этот метод был избран для промышленного производства БОО. 60.Биотехнология и медицина. В медицине — разработка мед. биопрепаратов, моноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы. На сегодняшнем этапе развития науки начинается эпоха индивидуализированной медицины, в кот. генетические различия пациентов будут учитываться для наиб. эффективного применения лекарств. Используя данные функциональной геномики, можно выявлять ген. варианты, отвечающие за предрасположенность конкретных пациентов к отрицательным побочным эффектам одних препаратов и за восприимчивость — к другим. Такой индивидуальный терапевтический подход, базирующийся на знании генома пациента, получил название фармакогеномики. Биотехнология предоставляет медицине новые пути получения ценных гормон. препаратов. Особенно большие сдвиги произошли в последние годы в направлении синтеза пептидных гормонов. С применением генноинженерного штамма Е. coli в наст. время получают до 100 мг гормона роста на 1 л среды культивирования. К лечению диабета приложена также технология инкапсулирования: клеткиподжел. железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в теч. года. Методы микробиол. трансформации позволили резко сократить число этапов хим. синтеза кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного артрита. При производстве стероидных гормонов широко используют иммобилизованные микробные клетки. Помимо получения лечебных средств, биотехнология позволяет проводить раннюю диагностику инф. заболеваний и злокачественных новообразований на основе применения препаратов антигенов, моноклональных антител, ДНК/РНК-проб. С пом. новых вакцинных препаратов возможно предупреждение инф. болезней. Стало возможным не только создание «биологических реакторов», трансгенных животных, генно-модифиц. растений, но и проведение ген. паспортизации (полного исследования и анализа генотипа человека, проводимого, сразу после рождения, для определения предрасположенности к различным заболев, возможную неадекватную (аллергическую) реакцию на лекарства, а также склонность к определенным видам деятельности). |