биотехнология ответы на экзамен. биотехнология экзамен. 1. Предмет и задачи биотехнологии. Объектами биотехнологии
 Скачать 264.41 Kb.
|
|
32.Типы и режимы ферментаций: периодические и непрерывные. Биотехнологические процессы м. б 2х типов: периодическими и непрерывными. Периодическое культив. вкл. неск-ко этапов: стерилизацию сред и оборудования, загрузку биореактора пит. средой, внесение посевного материала, выращивание культуры, отделение и очистку готового продукта. После окончания последнего этапа производится мойка биореактора и подготовка его к новому циклу. При этом типе культивирования рост клеточной популяции подразделяется на неск-ко фаз: 1) После введения инокулята обычно наблюдают индукционный период (лаг-фаза), в течение кот. не происходит сколько-нибудь заметного увелич. числа клеток или образования к-либо продуктов. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, специфичные к использованию новых субстратов, активируется биосинтез белка. 2)Фаза экспоненциального роста, в течение кот. быстро накапливаются биомасса и продукты разных реакций. Эта фаза достаточно строго описывается экспоненциальной кривой. 3) В замкнутой системе экспоненциальная фаза роста не может развиваться неограниченно. Она переходит в фазу линейного роста, характеризующуюся равномерным во времени линейным ростом культуры. 4) Фаза линейного роста может смениться весьма непродолжительным периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля. Это фаза замедления роста. 5)В некоторых случаях рост культуры может переходить в достаточно устойчивую и продолжительную стационарную фазу. В этих усл. культура развивается в режиме постоянства общего числа клеток. Режим хар-ся достаточно высокими скоростями отмирания клеток. При этом скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток. 6) Если система полностью истощается по субстрату или накопление ингибирующих рост продуктов является значительным, то скорость прироста биомассы становится равной нулю, происходят существенные физиологические изменения клеток и, как правило, наблюдается фаза отмирания культуры. Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспоненциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины – т. н. первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста (антибиотики, пигменты и т. п. - так называемые вторичные метаболиты). Довольно широко в биотехнологии исп-ся периодическое культивирование с подпиткой, при котором, помимо первичного внесения питательного субстрата до засева культуры, в процессе культивирования в аппарат через определенные интервалы добавляют питательные вещества либо порциями, либо непрерывно "по каплям". Существует также отъемно-доливочное культивирование, когда часть содержимого биореактора периодически изымается и добавляется равное количество питательной среды. Такой прием обеспечивает регулярное "омолаживание" культуры и задерживает ее переход в фазу отмирания. Этот прием иногда называется полунепрерывным культивированием. Модификацией периодического культивирования является культивирование с диализом, при котором питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность. Помимо этого, диализ удаляет из культуры часть жидкости, что позволяет получать в конце процесса концентрированную биомассу. В непрерывных процессах культивирования клетки постоянно поддерживаются в экспоненциальной фазе роста. С этой целью в биореактор подается свежая пит. среда и обеспечивается отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов является точное соблюдение равновесия м/у приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в рез-те разбавления содержимого свежей средой. Различают хемостатный и турбидостатный режимы непрерывного культивирования. При хемостатном саморегулируемая система возникает в силу следующих причин: если первоначальное поступление свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток, то в рез-те разбавления культуры снижается концентрация в-в, ограничивающих ростовые процессы и скорость роста культуры повышается; увеличивающаяся популяция начинает активнее "выедать" субстрат, что в свою очередь приводит к торможению роста культуры. Конечным итогом этих процессов является установление равновесия м/у скоростью роста культуры и ее разбавлением. Турбидостатный режим культив. базируется на прямом контроле концентрации биомассы. Наиб. распростр. методом ее определения является измерение светорассеивания с пом. фотоэлементов. 33.Твердофазная ферментация. Твердофазные процессы. Многие биотехнологические процессы основаны на взаимодействии трех фаз: твердой, жидкой и газообразной. Существуют процессы, в которых роль жидкой фазы сведена до минимума: она лишь используется для увлажнения твердой поверхности или воздуха (газа). В зависимости от превалирующей фазы процессы и соответствующие им аппараты подразделяются на твердофазные и газофазные. Твердофазные осуществляются, как правило, на основе растительного сырья и используют чаще всего мицелиальные грибы и дрожжи или их комбинации. Различают три типа твердофазных процессов: • Поверхностные, когда слой субстрата не превышает 3–7 см ("тонкий слой"). В качестве "биореакторов" используются большие (до нескольких квадратных метров) подносы или культуральные камеры. • Глубинные процессы, идущие в не перемешиваемом слое ("высокий слой"). Биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды. Для аэробных твердофазных процессов разработаны приспособления, обеспечивающие диффузионный и конвекционный газообмен. • Перемешиваемые процессы, протекающие в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата, который может быть гомогенным (полужидкой консистенции) или состоять из частиц твердого вещества, взвешенных в жидкости (переходный вариант от твердофазного процесса к процессу в жидкой фазе). Для этого обычно используют биореакторы с низкоскоростным перемешиванием. Преимущества по сравнению с процессами, осуществляющимися в жидкой фазе: 1) они требуют меньших затрат на оснащение и более дешевые в эксплуатации; 2) характер субстрата облегчает отделение и очистку продукта; 3) низкое содержание воды препятствует заражению культуры продуцента посторонней микрофлорой; 4) твердофазные процессы не связаны со сбросом в окружающую среду больших количеств сточных вод. Однако и здесь существуют свои проблемы. Вследствие отсутствия хорошего перемешивания продуцент часто растет в виде колоний и лишь постепенно может распространяться по субстрату; при этом возникает локальная недостача питательных веществ, тогда как часть субстрата вообще не используется (не колонизируется) продуцентом; недостаточно эффективный контроль за аэрацией и др. Различают три типа твердофазных процессов: - поверхностные процессы: в качестве биореакторов используют подносы из алюминия или культивационные камеры, площадью несколько м2; «тонкий слой» субстрата – 3-7 см (например, солома); - глубинные процессы: биореакторами являются глубокие открытые сосуды; используют «высокий» неперемешиваемый слой субстрата, а также приспособления, обеспечивающие диффузионный и конвективный газообмен; - процессы в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата: масса может быть гомогенной, например, полужидкий навоз или состоять из частиц твердого субстрата, взвешенных в жидкости. Используют биореакторы с низкоскоростными мешалками. Однако перемешивание при обилии твердой фазы травмирует биообъект (нежелательно для мицелиальных грибов). Для мягкого перемешивания используют винтовые мешалки или биореактор в виде вращающегося барабана. Преимущества твердофазных процессов: 1) требуют меньших затрат на оборудование и эксплуатацию; 2) облегчены отделение и очистка продукта (благодаря характеру субстрата); 3) вероятность заражения культуры продуцента посторонней микрофлорой не высокая (из-за низкого содержания воды в субстрате); 4) сброс в окружающую среду сточных вод минимален. Недостатки твердофазных процессов: 1) из-за недостаточного перемешивания, рост микроорганизмов происходит неравномерно: отдельные зоны в толще субстрата избыточно населяются клетками и возникает локальная нехватка питательных веществ, хотя значительная часть субстрата остается незатронутой. Для решения этой проблемы необходимо - внесение большего количества посевного материала и распределение его по всему объему субстрата; - периодическое культивирование с многократным отъемом части субстрата с биомассой и внесение эквивалентного количества перемешиваемого свежего субстрата. 2) трудно контролировать эффективность аэрации различных участков субстрата, температуру и уровень влажности из-за неоднородности условий в толще твердого субстрата. Для решения этой проблемы разрабатывают малотравматичные режимы механического перемешивания и другие методы усиления массопередачи и теплообмена 34.Классификация продуктов биотехнологических производств. Клетки микроорганизмов, которые используют для получения биомассы. Производство пекарских, винных, кормовых дрожжей; вакцин, белково-витаминных концентратов, средств защиты растений, заквасок для получения кисломолочных продуктов и силосования кормов, микробных удобрений и т.д. Продукты метаболизмаживых клеток: Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. (структурные единицы биополимеров — аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, витамины, коферменты, органические кислоты) Вторичные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины), образующиеся по завершении фазы их роста. 3) получение ферментов микробного происхождения; 4) получение рекомбинантных продуктов; 5) биотрансформация веществ; 6) утилизация неприродных соединений. 35.Стадии биотехнологического производства. 1Подготовка сырья (питательной среды) субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) 2.Подготовка биообъекта: посевной культуры или фермента ( в т.ч. иммобилизованного). 3.Образование целевого продукта за счет биологического превращения компонентов питательной среды в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит. 4.Выделение и очистка целевого продукта. 5.Получение товарной формы продукта 6.Переработка и утилизация отходов (биомассы, культуральной жидкости и т.п.). Предферментационная стадия: Осуществляется хранение и подготовка культуры продуцента (инокулята). Перед посевом в питательную среду контролируют чистоту культуры микроорганизма - продуцента. Посевной должен иметь стабильные культурально-морфологические признаки. Подготовка и получение питательных субстратов и сред, технологических и рециркулируемых воды и воздуха, настройка ферментационной аппаратуры. Количество компонентов питательных сред выбирают на основании расчета материального баланса Стадия ферментации: Стадия ферментации - центральная среди этапов промышленного производства. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную среду инокулята до завершения процессов роста, биосинтеза или биотрансформации. Ферментация проходит в специальных емкостях, называемых ферментерами или биореакторами. 36.Конечные стадии при биотехнологических процессах. Завершающие стадии биотехнологических процессов – выделение, очистка и модификация целевых продуктов. Выбор технологии получения целевого продукта зависит от того, накапливается ли продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса. Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток Выделение целевого продукта существенно облегчается, если он экскретируется продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому биотехнологии стремятся создавать промышленные штаммы микроорганизмов, секретирующие целевые метаболиты в культуральную жидкость. Технология выделения и очистки в каждом конкретном случае зависит от природы и требуемого качества целевого продукта. Выделение продуктов культивирования. 1) Отделение биомассы продуцента от культуральной жидкости – сепарация. Используют флотацию, фильтрование, центрифугирование, осаждение. Сгущенная биомасса высушивается или прессуется (пекарские дрожжи, кормовые дрожжи). 2) Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента (например интерферонов, гормонов) требуется разрушение клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы). Очистка продуктов культивирования. Хроматография - хроматография на бумаге - хроматография в тонком слое (тонкослойная) - колоночная хроматография (в зависимости от типа носителя подразделяется на: ионообменную, гель-фильтрацию, аффинную, высокоэффективную жидкостную хроматографию.) Высокоскоростное центрифугирование Ультрацентрифугирование Электрофорез Сушка продукта. Выбор методов сушки определяется свойствами продукта. Для обезвоживания микробных взвесей применяются сушилки: барабанные, распылительные, лиофильные. Наиболее широко используются лиофильные сушки для высушивания лабильных белковых препаратов или препаратов медицинского назначения. Препараты предварительно замораживаются, и вода испаряется из замороженного состояния при высоком вакууме. Модификация продукта. Модификация продукта необходима в тех случаях, когда в результате процесса получается лишь "заготовка" целевого продукта. Например, пенициллин модифицируется до полусинтетических препаратов. Стабилизация продукта. Для сохранения требуемых свойств получаемых продуктов в процессе их хранения применяют различного рода физико-химические воздействия с целью повышения его стабильности. Могут добавлять вещества -стабилизаторы. 37.Выделение и очистка продуктов культивирования. Технология выделения и очистки в каждом конкретном случае зависит от природы и требуемого качества целевого продукта. Выделение продуктов культивирования. 1) Отделение биомассы продуцента от культуральной жидкости – сепарация. Используют флотацию, фильтрован, центрифугирование, осаждение. Сгущенная биомасса высушивает или прессуется (пекарские дрожжи, кормовые дрожжи). 2) Для выделения и очистки продктов, находящихся внутри клеток продуцента (например интерферонов, гормонов) требуется разрушение клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы). Очистка продуктов культивирования. Хроматография - хроматография на бумаге - хроматография в тонком слое (тонкослойная) - колоночная хроматография (в зависимости т типа носителя подразделяется на: ионообменную, гель-фильтрацию, аффинную, высокоэффективную жидкостную хроматографию.) Ультрацентрифугирование Электрофорез 38.Основные параметры роста культур: время генерации, удельная скорость роста, выход биомассы, экономический коэффициент. Динамика изменения биомассы и образования первичных (А) и вторичных (Б) метаболитов в процессе роста организма: 1 — биомасса; 2 — продукт  Удельная скорость роста (µ) является основным параметром характеризующим скорость роста бактериальной культуры, (ч-1)  Экономический коэффициент(Y) показывает сколько биомассы (dX) образуется при соответствующем потреблении субстрата (dS)  39.Масштабирование ферментационных процессов. Проблемы масштабирования ферментационных процессов.Технология производственного процесса отрабатывается поэтапно: в лабораторных, пилотных (опытно-промышленных) и промышленных установках. Чаще встречаются аппараты с объемами ферменторной камеры: 0,5-100 л (лабораторные), 100-5000 л (лабораторно-промышленные) и 5000-1 000 000 л и более (промышленные). На каждом этапе увеличения масштаба ферментации решаются конкретные задачи отработки (налаживания) производства и его оптимизации. Лабораторныеферменторы по устройству и форме напоминают промышленные и подразделяются на те же типы. Правда, в лабораторных масштабах наиболее часто применяются аппараты с механическим перемешиванием. По принципу теплообмена и стерилизации они делятся на две категории. К первой относятся лишенные собственных системтеплообмена и стерилизации. Такие аппараты, по сути дела, представляют собой камеры для культивирования, помещаемые в водяные бани и стерилизуемые в автоклавах. Аппараты второй категории снабжены системами теплообмена и стерилизации, принципиально не отличающимися от таковых промышленных установок. С помощью лабораторных биореакторов решаются следующие задачи: 1) кинетические - определение скорости роста клеток, эффективности утилизации субстратов и образования целевого продукта; 2) некоторые массообменные - расчет коэффициентов массопередачи, скорость поступления в среду О2 и других газов, скорость освобождения от газообразных продуктов, образующихся при культивировании продуцентов (в первую очередь СО2); 3) определение коэффициентов реакций, связывающих утилизируемые субстраты и О2 с получаемыми целевым и побочными продуктами. Пилотные установки используют для поиска (отсюда и название) наиболее целесообразных технологий и в общих чертах моделирование промышленного процесса. Поэтому на данном этапе стараются применять тот тип аппарата, который предполагается использовать в промышленном масштабе. Иными словами, отрабатываются все аспекты производства, вплоть до штатных вопросов. При масштабных переходах следует постоянно иметь в виду, что при соблюдении одинаковых условий (среда, тип аппарата, температура и рН, скорость перемешивания) уровень и скорость синтеза целевого продукта могут существенно различаться ситуация, очень четко прослеженная еще в 1940-1950 гг. при организации крупномасштабных производств антибиотиков. Вследствие сказанного при переходе от лабораторных к пилотным, а затем от пилотных к промышленным установкам, приходится наряду с объемом изменять и конструкцию, и режимы работы аппаратов. Центральной проблемой при этом является подбор надежных критериев масштабирования, обеспечивающих разработку высокоэффективных и экономичных технологий промышленного производства целевого продукта. |