биотехнология ответы на экзамен. биотехнология экзамен. 1. Предмет и задачи биотехнологии. Объектами биотехнологии
 Скачать 264.41 Kb.
|
|
22.Векторы на основе бактериофагов. При использовании фаговых векторов жизнеспособным продуктом, содержащим рекомбинантную ДНК, является не популяция клеток, как в случае с плазмидными векторами, а популяция фаговых частиц. Фаговые векторы более эффективны, чем плазмидные, при клонировании крупных вставок. Самыми распространенными для кишечной палочки являются векторы, сконструированные на основе фагов l и М13. Бактериофаги (фаги) - вирусы, поражающие клетки бактерий. Могут существовать вне клетки бактерии. Для репликации должны инфицировать клетку бактерии. Содержат ДНК или РНК, в одно- или двуцепочечной форме, линейная или кольцевая. Геном умеренного фага l представлен двухцепочечной ДНК размером 48,5 т. п. н., которая упакована в головку в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами (липкие концы). После проникновения в клетку липкие концы взаимно спариваются (в cos-сайтах), молекула замыкается в кольцо и сшивается с помощью ДНК-лигазы. Профаг l в лизогенных клетках находится в интегрированном с нуклеоидом состоянии. Важными для конструирования векторов являются: 1) вся центральная часть (более 1/3 генома) несущественна для литического цикла, а нужна только для установления лизогенного состояния. Таким образом, ее можно заместить на чужеродную ДНК, и при этом фаг сохранит способность лизировать клетки. 2) для успешной упаковки ДНК в головки фага требуется, чтобы ее длина была более 38 т. п. н., но менее 52 т. п. н. В настоящее время сконструировано большое количество разнообразных векторов на основе фага l. Типичные из них содержат сайты рестрикции для Eco RI, ограничивающие участок генома, не нужный для литического цикла. При воздействии рестриктазой Eco RI на ДНК такого вектора образуется 3 фрагмента, среди которых можно отобрать концевые (содержат гены, необходимые для литического цикла) благодаря их сравнительно большим размерам.Эти фрагменты смешивают с чужеродной ДНК, обработанной Eco RI, и получают гибридные молекулы, у которых центральная часть представлена вставочным фрагментом. Полученные гибридные молекулы упаковывают в головки фага l in vitro. Для этого используют культуры клеток E.coli, инфицированные мутантными штаммами фага l, один из которых имеет повреждение в гене, ответственном за процесс упаковки ДНК в головку, а второй — за синтез отдельных белков головки.Такие фаги не способны обусловить литический цикл, но обеспечивают накопление в клетках большого количества промежуточных продуктов, необходимых для сборки фаговых частиц: пустых головок, хвостовых отростков, ферментов, необходимых для сборки.Если экстракты таких клеток смешать с векторной ДНК, содержащей вставки определенной величины, произойдет их упаковка в головки фага и сформируются зрелые фаговые частицы. На следующем этапе этими частицами инфицируют чувствительные клетки и получают потомство фагов с клонированными ДНК. В составе векторов на основе фага l можно клонировать фрагменты длиной до 15 т. п. н 23.Векторы для клонирования в клетках грамположительных бактерий. Векторы для клонирования в клетках грамположительных бактерий Bacillus subtilis, стрептомицетов, дрожжей Saccharomyces cerevisiae представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в Е. coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. Клонирование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: В. subtilis, Е. coli, Staphylococcus aureus. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид St. aureus, Е. coli и хромосомных фрагментов В. subtilis. Полученные рекомбинантные штаммы несут признаки устойчивости к антибиотикам 24.Банки генов и клонотеки геномов. Банком генов, или библиотекой генома(клонотекой), называют совокупность клонов бактерий или фаговых частиц, в которой содержится, по меньшей мере, по одному экземпляру каждой последовательности генома исследуемого организма. Необходимое количество клонов в клонотеке определяется отношением размера генома и размеров клонируемых фрагментов ДНК. Наиболее часто используются два типа клонотек: геномные библиотеки и библиотеки кДНК. Геномные библиотекипредставляют собой собрание генов и последовательностей ДНК какого-то организма. Их получают обычно с помощью векторов, сконструированных на основе бактериофага l или космид. Эти векторы характеризуются большой емкостью, что позволяет уменьшить число клонов в клонотеке. Библиотека кДНКпредставлена набором клонов, содержащих двухнитевые ДНК-копии всех мРНК клетки. Для создания этих клонотек чаще используют плазмидные или фаговые (на основе фага l) векторы. Идентификация генов в клонотеке генома. Идентификация генов в клонотеке генома. Проводят анализ самой вставочной полинуклеотидной последовательности либо продуктов ее экспрессии в клетках-хозяевах. 1) Использование зондов, комплементарных определенным участкам генов или кДНК. 2) Скрининг основан на изменении фенотипа клеток, воспринявших определенный фрагмент ДНК, вновь синтезированного белка 25.Векторные системы для клонирования в клетках эукариот: животных, растительных и дрожжевых. Основой векторов для клонирования генов животных чаще всего является геном вируса обезьян SV40. Для растительных клеток, которые не содержат собственных плазмид, основой векторов часто служат геномы вирусов растений, а также бактериальная плазмида pTi, которая опосредует перенос сегментов плазмидной ДНК в геномы различных двудольных растений и индуцирует образование опухолей (корончатых галлов). Семейство плазмид pTi выявлено в грамотрицательных бактериях Agrobacterium tumefaciens Гены эукариотических клеток состоят из участков – экзонов (кодирующие области) и интронов. В процессе сплайсинга из первичных транскриптов удаляются интроны и объединяются участки, содержащие экзоны. Сначала из клеток выделяют зрелую матричную РНК, появляющуюся в клетке при функционировании выбранного для клонирования гена. Такая РНК содержит только соответствующие экзонам нуклеотиды, то есть фактически кодирует аминокислотную последовательность нужного белка. Затем с помощью обратной транскриптазы проводят реакцию синтеза ДНК на матрице этой РНК. Полученные таким образом молекулы (комплементарные ДНК, кДНК) объединяют с промотром прокариотического гена и вводят путем лигирования в составплазмиды-вектора. После трансформации такой векторной ДНК бактерий в их клетках будет продуцироваться эукариотический белок. Чтобы сделать ген бактерии работающим в клетках эукариот (например, клетках растений) с помощью рестрикции и последующего лигирования объединяют промотор какого-либо эукариотического гена и структурную часть прокариотического. Такая генетическая конструкцияили «гибридный ген» будет транскрибироваться эукариотической РНК-полимеразой, то есть «работать» в эукариотической клетке. Например, если структурную часть гена инсулина человека объединить с промотором какого-либо бактериального гена и ввести такую последовательность ДНК в способную реплицироваться в клетках бактерий плазмиду-вектор, то такие бактерии будут синтезировать инсулин. 26.Способы введения рекомбинантных ДНК в клетки различных организмов. Поиск клонов с рекомбинантной ДНК. Прямое введение гена в клетку осуществляют несколькими способами: Трансфекция Микроинъекция Электропорация Метод «мини-клеток» Упаковка в липосомы Электронная пушка Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией. Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий СаС12 их мембрана становится проницаемой для ДНК. Эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Отбор бактерий, подвергшихся трансформации, осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бактерий на 1 см2 поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием колонии. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. Конкретные имеющие тот или иной чужеродный для них ген бактерии обычно называют клоном,то есть совокупностью одинаковых по содержащейся в них наследственной информации клеток, а вышеописанная процедура называется клонирование генов. 27.Требования, предъявляемые к питательным субстратам, использующимся в биотехнологических процессах. В питательной среде должны присутствовать все элементы, необходимые для построения компонентов живых клеток в доступной для усвоения форме. В больших количествах клеткам необходимы макроэле-менты: углерод, азот, кислород, водород, фосфор, сера, калий, кальций, магний. Снабжение клеток кислородом и водородом осуществляется за счет воды. Углерод является составной частью всех органических соединений и его источники многочисленны и многообразны: чаще всего сахара, многоатомные спирты и органические кислоты. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного и растительного происхождения. Помимо макроэлементов, клетки в незначительных количествах нужаются также и в некоторых микроэлементах: натрий, марганец, никель, кобальт, хлор, цинк, медь, кремний, молибден, бор, ванадий и некоторые другие. Кроме основных пластических и энергетических компонентов, питательные среды могут содержать и так называемые факторы роста. Это органические соединения (витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и др.), в которых нуждаются ауксотрофные клетки икоторые они синтезировать не в состоянии. Отсутствие таких веществ при- водит к нарушению обменных процессов и прекращению роста клеток. В качестве необходимых компонентов питательных сред могут вы- ступать газы: хорошо (NH3, H2S), умеренно (CO2) или плохо (N2, O2, H2, CH4) растворимые в воде. 28.Роль факторов внешней среды в эффективности биотехнологических процессов. По отношению к температуре развития бактерии также весьма разнообразны: одни развиваются при широком диапазоне изменения температуры, другие - только при определенных температурах (низких, высоких или в узком диапазоне температур). Микроорганизмы для своего роста могут различаться оптимумом рН. При культивировании микроорганизмов на стерильных питательных средах, нужно поддерживать оптимальные или благоприятные для них условия - температуру и рН среды. При выращивании аэробных микроорганизмов, особенно в больших объемах среды, ее дополнительно аэрируют, встряхивая, перемешивая, а при необходимости пропускают через среду стерильный воздух. При культивировании строго анаэробных бактерий создают анаэробные (бескислородные) условия, используют прокипяченные питательные среды, которыми заполняют пробирки и колбы под пробку (без пузырьков воздуха) и др. 29.Питательные среды для ферментационных процессов. Среды, предназначенные для ферментационных процессов.Важно также поддерживать определенный состав питательной среды. В непрерывных процессах биосинтеза задача технолога сводится к поддержанию концентрации всех питательных веществ (и кислорода) и дозированному введению кислоты или щелочи для рН-статирования системы на заданном уровне. Простейшим вариантом управления стадией ферментации в периодическом режиме является изменение концентраций компонентов среды и её рН, а также введение необходимых добавок по заранее разработанной программе, реализуемой технологом в каждом цикле ферментации. Этот способ относительно прост и легко поддается автоматизации. Во многих случаях необходимо возможно полно исчерпывать компоненты питательной среды, чтобы они не попадали на последующие стадии переработки. Эта необходимость может быть вызвана рядом причин: - дороговизна или дефицитность субстрата; - вредное воздействие субстрата на качество готового продукта(например, при производстве дрожжей на парафинах , когда выделение остаточных количеств углеводородов из клеточной массы затруднено, поэтому добавляют дополнительные секции для дозревания или утилизации запасенных в цитоплазме углеводородов); - затруднения, возникающие на стадии выделения и очистки метаболитов при одновременном присутствии в культуральной жидкости неутилизированных веществ. Твердофазную ферментацию обычно реализуют в твердой, сыпучей или пастообразной среде, влажность которой составляет 30–80 %. Поверхностная ферментация на жидких субстратах реализуется в кюветах со средой, помещенных в вентилированные воздухом камеры. 30.Требования к биореакторам, их классификация. Биореакторы предназначены для культивирования микроорганизмов, накопления биомассы, синтеза целевого продукта. Биореакторы изготавливают из высоколигированных марок стали, иногда из титана. Внутренняя поверхность биореактора должна быть отполирована. Типовые ферментеры представляют собой вертикальные ёмкости различной вместимости (малые - от 1 до 10 л ,многотоннажные - более 1000 л) с минимальным числом штуцеров и передающих устройств. В биореакторах должны быть обеспечены оптимальные гидродинамические и массообменные условия. Ферментеры снабжены паровой рубашкой, мешалками, барботерами, стерилизующими воздушными фильтрами, отбойниками, обеспечивающими необходимые температурный, газовый режим, гидродинамическую обстановку в биореакторе (т.е. процессы массо- и теплообмена). В биореакторах имеются пробоотборники для отбора проб культуральной жидкости в процессе биосинтеза. Могут быть и другие конструктивные особенности, учитывающие специфику биотехнологического процесса. Работа отдельных узлов контролируется измерительными приборами, фиксирующими как параметры технологического процесса, так и отдельные физико-химические показатели культивирования. Биореакторные системы для выращивания микрорганизмов могут быть классифицированы как "замкнутые" и "открытые". Система рассматривается в качестве замкнутой, когда многие компоненты данной системы не могут быть из нее удалены или добавлены. Так, например, в традиционных однократных (т. е. замкнутых) ферментационных системах все питательные компоненты добавляются в начале ферментации и, как результат этого, скорость роста, находящегося в таких условиях организма, в конечном счете будет снижена до нуля вследствие уменьшения количества питательных веществ или накопления токсических продуктов отхода метаболизма. Системы, функционирующие в таких условиях, называются как batch-системы (замкнутые системы). Большинство современных биотехнологических систем функционируют как batch-процессы, при которых однажды оптимизированные условия обеспечивают максимальное накопление целевого (требуемого) продукта, например, приготовление пива, производство антибиотиков и ферментов и т. п. Модификацией процесса с разовой загрузкой является возобновляемая ферментация (feеdbatch – от feеd-насыщающий), при которой количество питательного вещества может быть добавлено в ходе ферментации с целью восполнения частично израсходованного субстрата или для активации процесса. Однако в своей принципиальной основе подобные системы остаются замкнутыми, поскольку у них нет постоянного оттока содержимого. В противоположность этому, ферментационная система, рассматривается как открытая, если ее компоненты ( микроорганизмы и питательные субстраты) могут постоянно добавляться и удаляться из биореактора. Такие ферментеры оснащены приспособлениями, постоянно подающими свежую питательную среду и удаляющими биомассу и другие продукты. В таких системах скорость конверсии субстрата в биомассу или в целевой продукт должна быть точно сбалансирована со скоростью35 поступления вышеуказанных компонентов, что обеспечивает устойчивое состояние метаболических процессов в реакторе. 31.Устройство и основные конструкторские детали ферментеров. Для обеспечения необходимых условий протекания биотехнологических процессов используются ферментеры или биореакторы. Биореакторы варьируют от простых сосудов до сложных систем с различным уровнем к Биореакторы бывают: 1) Для нестерильных систем. Например, ферментация при пивоварении, производство пекарских дрожжей и т. п. 2) Для стерильных процессов. Производство антибиотиков, аминокислот, полисахаридов и одноклеточного бактериального белка. омпьютерного оснащения. Биореакторы должны обеспечивать оптимальные условия роста продуцента или накопления синтезируемого им продукта. Требования к биореакторам: Должны обеспечивать благоприятные условия для роста культивируемого микроорганизма. Исключить попадание посторонних микроорганизмов. Объем культивирумой смеси должен оставаться постоянным, чтобы не было утечки или испарения содержимого. Параметры культивирования (температура, рН, уровень аэрации и т.д.) должны постоянно контролироваться. Культура при выращивании должна хорошо перемешиваться. Биореакторы могут быть классифицированы по ряду критериев 1) по размеру и целевому назначению: - лабораторные; - опытно-промышленные (пилотные); - промышленные; 2) по режиму работы: - периодические; - периодический режим с доливом субстрата; - полупериодические; - непрервно-проточные. 3) по условиям культивирования: - аэробные и анаэробные; - мезофильные и термофильные; - для поверхностного и глубинного культивирования; - аппараты для жидких питательных сред, твердофазные и газофазные. |