биотехнология ответы на экзамен. биотехнология экзамен. 1. Предмет и задачи биотехнологии. Объектами биотехнологии
 Скачать 264.41 Kb.
|
|
46.Технология производства ферментов в промышленных условиях. Ферментные препараты представляют собой концентраты ферментов, полученные с помощью микроорганизмов, содержащие в своем составе наряду с ферментами балластные вещества. Ферментные препараты применяют в пищевых производствах как катализаторы соответствующих биохимических процессов. В качестве продуцентов ферментов используют разнообразные источники: растения, животные ткани и микроорганизмы. Способностью активно продуцировать целлюлолитические ферменты обладают представители ряда несовершенных грибов родов Alternaria, Trichoderma, Fusarium и др. Важным требованием к применяемому продуценту является его способность к образованию большого количества какого-либо одного фермента при незначительном количестве других ферментов. Микроорганизмы культивируют на средах, богатых углеводами, азотистыми и минеральными веществами, витаминами. В производстве ферментных препаратов используют синтетические и комплексные среды, являющиеся смесью синтетических сред с естественными материалами растительного, животного и микробного происхождения. Синтетические среды готовят из различных минеральных солей и органических соединений, являющихся источником углерода — углеводов, спиртов, органических кислот. В качестве естественных материалов применяют отходы пищевых производств: отруби, мелассу, жмыхи, кукурузный экстракт, солодовые ростки, пивные дрожжи, зерно-картофельную барду. Для накопления ферментов в культуральной среде необходимо обеспечить оптимальные условия для их синтеза: состав среды, температуру, значение рН, снабжение клеток кислородом воздуха. Для нужд пищевой промышленности вырабатываются амилолитические ферментные препараты. Препараты представляют собой тонкоизмельченные порошки бежевого или светло-серого цвета влажностью не более 13 %. Они хорошо растворимы в воде без постороннего запаха и вкуса. Протеолитические ферментные препараты используют в мясной промышленности для мягчения мяса, придания ему нежного вкуса и консистенции; в молочной промышленности — для получения гидролизатов белков молока, в пивоварении — для стабилизации пива от помутнения и др. Применяют два способа выращивания продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный. Поверхностный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на поверхности твердых, жидких, полужидких или сыпучих материалов. Этот способ создает хорошие условия для максимального контакта микроорганизмов с кислородом воздуха. Его используют в основном при выращивании мицелиальных грибов. Глубинный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на жидких средах. Этот способ применяют преимущественно при использовании в качестве продуцентов ферментов бактерий и других микроорганизмов, способных интенсивно развиваться в условиях недостаточного контакта клеток с кислородом. Он может быть применен и для культивирования аэробных микроорганизмов. 47.Преимущества использования иммобилизованных ферментов в биотехнологии. Иммобилизация – физическое разделение биообъекта (клетка, фермент) и растворителя, то есть биообъект закреплен на нерастворимом носителе, а субстрат и продукты свободно обмениваются между биообъектом и растворителем. Иммобилизация ферментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением ( частичным или полным) каталитической активности. Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ: 1.Такие ферменты представляют собой гетерогенные катализаторы, легко отделяющиеся от реакционной среды; 2. Могут использоваться многократно; 3.Обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Кроме того, иммобилизация ведёт к изменению свойств фермента:- Субстрактной специфичности;- Устойчивости; - Зависимости активности от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговечны и в десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65°С термоинактивациялактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60%-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативнымферментом. Это обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты. Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ:1.отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;2.снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;3.более высокая активность и стабильность;4.возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов;5.способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов. 48.Преимущества использования иммобилизованных клеток в биотехнологии. Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ как перед иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками: 1) отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов; 2) снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции; 3) более высокая активность и стабильность; 4) возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов; 5) способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов. 49.Характеристика используемых носителей, способы иммобилизации клеток и ферментов. Способы иммобилизации ферментов: а - адсорбция на нерастворимых носителях, б – включение в поры геля. в – отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны, г – использование двухфазной реакционной среды . Для получения иммобилизованных ферментов используют большое количество различных органических и неорганических носителей. Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут служить для иммобилизации ферментов, следующие: 1) высокая химическая и биологическая стойкость; 2) высокая механическая прочность; 3) достаточная проницаемость для фермента и субстратов, большая удельная поверхность, высокая пористость; 4) возможность получения трубок, листов и т.п.; 5) легкая активация (переведение в реакционноспособную форму); 6) высокая гидрофильность, позволяющая проводить реакции связывания с ферментом в водной среде; 7) невысокая стоимость. В зависимости от природы носители делятся на органические и неорганические материалы. Органические полимерные носители: природные и синтетические полимерные носители. Среди природных полимеров выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических - полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные. К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам - биодеградируемость и достаточно высокую стоимость Наиболее часто из природных полимеров для иммобилизации ферментов используют полисахариды: 1) целлюлоза, 2) хитин (производное - хитозан), 3) декстран (товарные названия "сефадекс" (Швеция) и "молселект" (Венгрия)), 4) крахмал, 5) агароза, 6) альгиновые кислоты Носители белковой природы: 1) структурные протеины (кератин, фиброин, коллаген) 2) продукт переработки коллагена — желатина. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значительных количествах, дешевы и имеют большое число функциональных групп для связывания фермента. Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании иммобилизованных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность. Носители неорганической природы. Применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей — легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости. 50.Преимущество использование ферментов перед неорганическими катализаторами. 1) Благодаря своему разнообразию ферменты потенциально способны катализировать множество промышленно важных химических реакций. 2) Действуют при нормальном давлении, температуре от 20 до 70 ºС, рН от 4 до 9. 3) Имеют высокую субстратную специфичность, что позволяет в сложной смеси субстратов направленно воздействовать только на определенные соединения. 4) Специфичность ферментов позволяет получать очень чистые продукты, что важно для фармакологической, пищевой и сельскохозяйственной промышленности 51.Промышленные технологические процессы с использованием иммобилизованных ферментов. Промышленные технологические процессы с использованием иммобилизованных ферментовотносятся в основном к производству пищевых продуктов и лекарственных препаратов. 1. Получение глюкозофруктозных сиропов. 2. Получение оптически активных L-аминокислот из их рацемических смесей. 3. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония. 4. Синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты. 5. Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты. 6. Получение безлактозного молока. 7. Получение сахаров из молочной сыворотки. 8. Получение 6-аминопенициллановой кислоты. Исходным сырьем для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала в присутствии минеральных кислот. Для получения биокатализатора глюкозоизомеразу сорбируют на пористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Во многих случаях используют иммобилизованные клетки разного происхождения (Aspergillus niger, Коммерческие препараты иммобилизованной глюкоизомеразы имеют вид гранул, шариков, волокон или аморфной массы. Получающийся в результате каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42 —45 % фруктозы, около 51 % глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы. Производство глюкозофруктозных сиропов с использованием иммобилизованной глюкоизомеразы в 1,5 раза выгоднее получения сахарозы из сахарной свеклы по традиционной технологии. Получение L-аминокислот из их рацемических смесей. В результате химических реакций, используемых для синтеза аминокислот, содержащих асимметрические атомы углерода, с одинаковой скоростью образуются как D-, так и L-стереоизомеры, т.е. всегда возникает рацемическая смесь. В живых клетках обмену подвергаются лишь L-аминокислоты. Разделение рацемических смесей на составляющие их оптические изомеры явилось первым промышленным процессом с использованием иммобилизованных ферментов, осуществленным в Японии при помощи аминоацилазы, иммобилизованной на ДЕАЕ-целлюлозе. Получение L-аспарагиновой кислоты. Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель и подкислитель). Производят синтез L-аспарагиновой кислоты из получаемого химическим путем фумарата. В ней используются иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки Е. coli, содержащие аспартатаммиаклиазу Получение 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). Бензилпенициллин является исходным сырьем для получения (6-АПК), но в его молекуле присутствует очень лабильное беталактамное кольцо. Поэтому проведение химического деацилирования бензилпенициллина довольно сложно. Поэтому в промышленности использовали для обработки бензилпенициллина бактериальную массу E. coli, которая содержит фермент пенициллинамидазу. Этот фермент расщеплял именно ту амидную связь, которая необходима для образования 6-АПК. В результате применения иммобилизованных бактериальных клеток, содержащих пенициллинамидазу, а затем и самой иммобилизованной пенициллинамидазы, удалось значительно повысить продуктивность и экономичность промышленного получения 6-АПК. 52.Применение иммобилизованных ферментов в медицине. Получают тромболитические ферменты, используемые при сердечнососудистых заболеваниях. В клинической практике используется препарат «стрептодеказа», содержащий стрептокиназу — активатор предшественника протеиназы плазмина, предотвращающий образование тромбов в кровеносной системе. Аспарагиназу используют для борьбы со злокачественным ростом опухолей. Протеолитические ферменты(трипсин, химотрипсин, субтилизин, коллагеназа), иммобилизованные на волокнистых материалах (целлюлоза, полиамидные волокна, декстран и др.), применяют для эффективного лечения ран, язв, ожогов, абсцессов, а их белковые ингибиторы — в заместительной терапии для лечения эмфиземы и панкреатитов. 53.Каллусные и суспензионные культуры клеток высших растений, методы их получения и область применения. В зависимости от способа культивирования и происхождения можно выделить несколько типов культур клеток и тканей. Если культивирование происходит на поверхности агаризованной среды, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четко выраженной структуры и различается по плотности. Каллус – неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В норме каллусная ткань выполняет следующие функции: 1) Защищает места повреждения; 2) Запасает питательные вещества; 3) Регенерация утраченных органов. Для растения каллус представляет собой ткань, возникающую вместах пораненияи функционирующую непродолжительное время. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Эта ткань защищает место поранения, накапливает питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа. У интактных растений дедифференцировка и индукция каллусогенезавозникают вследствие образования раневых гормонов (травматиновая кислота) при механическом повреждении. Каллус может образовываться и на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro. Образование и рост каллусной культуры регулируется ауксинами и цитокининами. Культура каллусных тканей– выращивание в длительной пересеваемой культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов растений. Образование и рост каллусной ткани контролируются фитогормонами из группы ауксинов и цитокининов. Под действием ауксинов происходит дедифференцировка, а под влиянием цитокининов – интенсивное деление, в результате которого образуется каллус. Каллусную культуру можно инициировать из разных частей растения: стеблей, корней, тканей клубня, листьев, зародышей и др. Такие фрагменты называются эксплантами Культура каллусных тканейвыращивается поверхностным способом на полужидкой агаризованной среде (концентрация агар-агара 0,6-1%), среде с применением других желирующих полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги или дисках из пенополиуретана, погруженных в жидкую питательную среду. Для того чтобы сохранить способность к делению и дальнейшему росту, кусочек каллусной ткани через определенное время культивирования переносят на свежую питательную среду. При многократном его повторении возможно «привыкание», которое выражается в приобретении автономности по отношению к гормонам и утрате или к значительному ослаблению способности каллусных клеток к регенерации целого растения. Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом на агаре, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющих строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают рыхлые с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. Как правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми Индуцировать морфогенезв культуре каллусной ткани можно с помощью различных факторов: света, температуры, состава питательной среды, и в первую очередь – изменения соотношения фитогормонов. В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляциив культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило Скуга - Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги. Суспензионные культурыполучают из рыхлой каллусной ткани, помещая ее в жидкую питательную среду того же состава, что и для каллуса, и выращивают в колбах на качалке (100-120 оборотов в минуту). Рекомендуется использовать жизнеспособную, интенсивно пролиферирующую каллусную культуру, которая легко распадаться на небольшие клеточные агрегаты и отдельные клетки. Состояние клеточных суспензий характеризуется либо плотностью клеточной популяции или по сырой (сухой) биомассе. За 14-16 дней плотность популяции клеток может быть повышена в 100 раз. При культивировании используются все возможные варианты, разработанные для микроорганизмов: закрытые и открытые системы, периодические и непрерывные. Культивирование изолированных клеток достаточно сложно из-за длительности процесса, чувствительности клеток к механическому повреждению, медленного роста (время удвоения - 1-3 суток). |