биотехнология ответы на экзамен. биотехнология экзамен. 1. Предмет и задачи биотехнологии. Объектами биотехнологии
 Скачать 264.41 Kb.
|
|
40.Кривая роста популяции клеток, характеристика отдельных фаз и получение целевых продуктов. Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени культивирования, называется кривой роста Типичная кривая роста имеет S-образную форму и позволяет различить несколько фаз роста Лаг-фаза Экспоненциальная фаза Стационарная фаза Фаза отмирания Лаг-фазаохватывает промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления Продолжительность лаг-фазы зависит от предшествовавших условий культивирования, возраста инокулята, пригодности для роста питательной среды Экспоненциальная фаза (фаза экспоненциального роста) характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток Экспоненциальную фазу называют также фазой логарифмического роста вследствие прямолинейной зависимости логарифма числа клеток от времени культивирования Во время экспоненциальной фазы все клетки имеют приблизительно одинаковый размер и отличаются максимальным содержанием РНК и белка Стационарная фаза – число живых клеток достигает максимума и перестает увеличиваться Скорость размножения бактерий в этот период равна скорости их отмирания В стационарной фазе в клетках и в среде накапливаются продукты вторичного метаболизма Фаза отмирания - заключительная фаза периодической культуры Отмирание бактерий идет быстрее, чем их новообразование, причем число живых клеток может снижаться экспоненциально Под действием собственных ферментов происходит распад клеток – автолиз продуктов. 41.Культивирование клеток высших растений, примеры получаемых продуктов Метод культуры клеток высших растений лежит в основе изучения биологии клетки, существующей вне организма. Популяциям растительных клеток, выращиваемым в искусственных условиях, присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференциальной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции наблюдается преимущественное размножение клеток, фенотип которых наиболее соответствует данным условиям выращивания, и популяция эволюционирует. Изменчивость, наследуемость возникших изменений, адаптивный отбор и эволюция, свойственные культивируемым клеткам растений, позволяют считать, что они являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока еще мало изучены. Однако знать их очень важно, потому что культивируемые клетки высших растений широко используются в фундаментальных исследованиях и в практике. Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения. Отличия культивируемых клеток от клеток организма, часто специально усиленные созданием биохимических мутантов, гибридных или трансформированных клеток - помогают глубже проникнуть в механизм процессов происходящих в растениях. Простота клеточных моделей, возможность быстро получать достаточную массу в асептических, контролируемых по многим параметрам условиях выращивания являются преимуществами такого моделирования. На основе культивируемых клеток и тканей растений созданы технологии для промышленности и сельского хозяйства. Углубление знаний биологии культивируемых растительных клеток обязательно для дальнейшего прогресса в разработках принципиально новых, перспективных для практики технологий.. 42.Культивирование клеток животных, получение моноклональных антител. Самая мощная белоксинтезирующая система находится в клетках молочной железы. Если поставить гены чужих белков под контроль казеинового промотора, то экспрессия этих генов будет мощной и стабильной, а белок будет накапливаться в молоке. Такие трансгенные животные, секретирующие в молоко гормоны, ферменты, антитела, факторы свертывания крови и роста и др., уже начинают использовать как биореакторы, т. е. продуценты биологически активных лекарственных белков человека. Традиционно такие белки выделяли из донорской крови, дефицит которой и низкая концентрация этих белков в ней не позволяют полу-чать необходимое количество препаратов для фармакологии. Первоначально необходимо получить трансгенное животное, у которого чужой ген экспрессируется в клетках молочной железы и его продукт выделяется в молоко. Для этого создают генетическую конструкцию, содержащую рекомбинантную ДНК трансгена и промотор гена (3-казеина — белка, входящего в состав молока. Генетическую конструкцию вводят в зиготу. Причем генетическая конструкция должна работать только в клетках молочной железы и только во время лактации, не оказывая побочного действия на организм трансгенного животного. В Англии в 1988 г. впервые удалось получить трансгенных овец, продуцирующих с молоком фактор свертывания крови, необходимый для лечения людей, больных гемофилией. В последующие годы в мире созданы трансгенные мыши, кролики, овцы, козы, свиньи, коровы, в молоке которых секретируются белки человека (ценнейшие фармацевтические вещества) — антитрипсин, антитромбин, белок С, сывороточный альбумин (используемый при операциях), разл. моноклональные антитела, эритропоэтин, инсулиноподобный фактор роста, интерлейкины и др. Уже получены трансгенные коровы, в молоке которых содержится человеческий белок лактоферрин. Этот белок планируют применять для проф-ки гастроэнтерологических забол. у людей с низкой иммунорезистентностью. Это больные СПИДом, недоношенные младенцы, больные раком, прошедшие радиотерапию. В России в 1995 г. были предприняты попытки создать овец, продуцирующих химозин. Это ключевой фермент сыроделия. Трансгенных жив. получают и для целей ксенотрансплантации, т. е. как источник органов для пересадки человеку. Учёные разработали методы выращивания в искусственных условиях клеток растений, животных и даже человека. Метод соматической гибридизации используется и для клеток животных. Сливаться могут разные виды клеток одного организма и клетки разных, иногда очень далеких видов, например, мыши и крысы, кошки и собаки, человека и мыши. Примером практического применения метода соматической гибридизации является создание гибридом – клеток, способных производить высокоспецифичные антитела. Гибридому получают путем слияния клетки В-лимфоцита и опухолевой клетки. В результате гибридомы сочетают в себе свойство лимфоцита производить определенные антитела и свойство опухолевой клетки активно делиться В последние годы появились технологии получения трансгенных животных. Для этого нужный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки, которую имплантируют (внедряют) в женскую особь (суррогатную мать) и добиваются успешного развития эмбриона. Трансгенные животные широко используются как для решения большого числа теоретических задач, так и в практических целях для медицины и сельского хозяйства. Существует множество трансгенных животных, моделирующих различные заболевания человека (рак, атеросклероз, ожирение). На этих моделях ученые успешно изучают эти заболевания и отрабатывают способы лечения. Перенос новых генов позволяет получать трансгенных животных, отличающихся повышенными продуктивными свойствами (например, усиление роста шерсти у овец, понижение содержания жировой ткани у свиней, изменение свойств молока). Получены животные с высокой устойчивостью к различным заболеваниям, вызываемым вирусами. Получены также некоторые трансгенные рыбы. Например, в яйцеклетки лосося был введен ген, отвечающий за синтез гормона роста. Полученный таким образом годовалый трансгенный лосось весил в 11 раз больше, чем нетрансгенный. Разработаны способы клонирования животных – создания генетически идентичных животных. Для этого из яйцеклетки одного животного удаляют ядро и заменяют его на ядро, полученное из соматической клетки другого животного. Такую яйцеклетку внедряют в суррогатную мать и добиваются успешного развития эмбриона. Поскольку генетическая информация содержится в ядре, вырастающее животное генетически идентично животному, из клеток которого полу Овца по имени Долли была клонирована с помощью переноса ядра клетки молочной железы в яйцеклетку чено ядро 43.Конечные стадии получения целевого продукта биотехнологического производства. Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы – сепарация. Существуют различные методы сепарации: 1) флотация, если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости; 2) фильтрация на пористой фильтрующей перегородке; 3) центрифугирование. Метод основан на осаждении взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Ценрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтруется медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие. Центрифугирование и фильтрация в некоторых производственных процессах реализуются в комбинации – речь идет о фильтрационных центрифугах. Широко применяют центрифуги, где разделение жидкой и твердой фаз не связано с фильтрацией и основано лишь на центробежной силе. Следующим этапом получение целевого продукта является разрушение клеток. Разрушение клеток (дезинтеграцию) проводят физическим, химическим и химико-ферментативным методами. Наибольшее индустриальное значение имеет физическое разрушение: ультразвуком; с помощью вращающихся лопастей или вибраторов – метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках; встряхиванием со стеклянными бусами; продавливанием через узкое отверстие под высоким давлением; раздавливанием замороженной клеточной массы; растиранием в ступке; осмотическим шоком; замораживанием – оттаиванием; сжатием клеточной суспензии с последующим резким снижением давления (декомпрессия). За дезинтеграцией клеток следует этап отделения фрагментов клеточныхстенок. Используют те же методы, что и при сепарации клеток: центрифугирование или фильтрацию. Однако применяют более высокоскоростные центрифуги и фильтры с меньшим диаметром пор (часто мембранные), чем при сепарации клеток. Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или адсорбции. Современные методы разделения веществ включают: хроматографию, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировку, основанные на принципах экстракции и адсорбции. Разделение веществ путем хроматографии связано с их неодинаковым распределением между двумя несмешивающимися фазами. Различают хроматографию на бумаге, пластинках, колонках. При хроматографии на бумаге или на пластинках одной из несмешивающихся фаз служит движущийся растворитель, например бутанол, а другой, неподвижной, фазой – волокна бумаги или частицы покрывающего пластинку силикагеля или другого материала. При колоночной хроматографии подвижная фаза – текущий через колонку растворитель, неподвижная – заполняющий колонку адсорбент, чаще всего гранулированный гель. Разделяемая смесь вводится в контакт с подвижной и неподвижной фазами. Колоночная хроматография допускает масштабирование – увеличение размеров и пропускной способности. Она применяется в промышленных условиях и имеет несколько разновидностей. Ионообменная хроматография – гранулы адсорбента, например карбоксиметилцеллюлозы, несут на себе заряженные группы, катионные (NH4+), анионные (SO3-2), способные к захвату ионов противоположного знака. Она применяется для выделения ионизированных соединений из жидкости, а также для очистки нейтральных соединений от примесей ионной природы. Метод «молекулярных сит», гель-хроматография, гель-фильтрация. Хроматография, основанная на разделении веществ с различной молекулярной массой и диаметром. Частицы адсорбента захватывают и удерживают, скажем, только низкомолекулярные соединения, пропуская высокомолекулярные. Аффинная хроматография – задерживается компонент, образующий прочный комплекс с лигандом, фиксированным на частицах носителя. Применяют агенты, специфически связывающие одно индивидуальное вещество. Например, фермент очищают путем связывания на колонке, несущей субстрат или специфический ингибитор. Аффинная хроматография может обеспечить полную очистку продукта из сложной многокомпонентной смеси – культуральной жидкости, экстракта клеток – в одну стадию, в то время как более традиционные методы осаждения и ионообменной хроматографии требуют многоэтапной очистки, сопряженной с большими затратами труда и времени. Наряду с аффинной хроматографией, называемой также аффинной адсорбцией в геле, для крупномасштабного отделения и очистки продуктов биотехнологических процессов предполагают применять аффинную преципитацию и аффинное разделение. При аффинной преципитации лиганд прикрепляют к растворимому носителю. При добавлении смеси, содержащей соответствующий белок, образуется его комплекс с лигандом, который выпадает в осадок сразу после его формирования или после дополнения раствора электролитом. Аффинное разделение основано на применении системы, содержащей два водорастворимых полимера. Один из полимеров, например полиэтиленгликоль, несет специфические лиганды. Другой полимер, например высокомолекулярный декстран, обладает сродством к остальным, примесным компонентам. Аффинное разделение представляет собой наиболее высокоэффективный из аффинных методов очистки. 44.Классификация продуктов биотехнологического производства. I. В зависимости от количества. 1. Продукты тонкого биологического синтеза - от 100 кг до 1000 т в год - вакцины, витамины, антибиотики для медицины. основная стоимость связана с очисткой и анализом. 2. Продукты маломасштабного биосинтеза - до 20 тыс. тонн в год - аминокислоты для пищевой промышленности, напитки, продукты получаемые ферментацией, антибиотики для с/х. 3. Крупномасштабный биологический синтез - сточные воды после биологической очистки, биополимеры для отдельных отраслей промышленности - полисахариды для извлечения остатков нефти, выщелачивания Ме из руд. Основное условие - дешевизна. Более 20 тыс. тонн в год. II. По товарным формам. 1. Биопрепараты - основной компонент - жизнеспособные клетки м/о или др. организмы закваски, бактериальные удобрения. 2. Инактивированная биомасса м/о - белок одноклеточных организмов. 3. Биопрепараты на основе очищенных метаболитов - ферменты, витамины, гормоны, антибиотики. III. Образование биотехнологических продуктов в зависимости от стадии роста биологических объектов. 1. Первичные метаболиты. 2. Вторичные метаболиты. По отношению к процессам роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные метаболиты. Первичные метаболиты - это низкомолекулярные соединения (молекулярная масса менее 1500 Да), необходимые для роста микроорганизмов. Одни из них являются строительными блоками макромолекул, другие участвуют в синтезе коферментов. Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, растворители и витамины. Вторичные метаболиты - это низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре и образующиеся по завершении фазы их роста. К вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины. 45.Микроорганизмы - продуценты ферментов. Требования к штаммам - продуцентам. Требования к штаммам - продуцентам. Ферментные препараты представляют собой концентраты ферментов, полученные с помощью микроорганизмов, содержащие в своем составе наряду с ферментами балластные вещества. Ферментные препараты применяют в пищевых производствах как катализаторы соответствующих биохимических процессов. В качестве продуцентов ферментов используют разнообразные источники: растения, животные ткани и микроорганизмы. Способностью активно продуцировать целлюлолитические ферменты обладают представители ряда несовершенных грибов родов Alternaria, Trichoderma, Fusarium и др. Важным требованием к применяемому продуценту является его способность к образованию большого количества какого-либо одного фермента при незначительном количестве других ферментов. Микроорганизмы культивируют на средах, богатых углеводами, азотистыми и минеральными веществами, витаминами. В производстве ферментных препаратов используют синтетические и комплексные среды, являющиеся смесью синтетических сред с естественными материалами растительного, животного и микробного происхождения. Синтетические среды готовят из различных минеральных солей и органических соединений, являющихся источником углерода - углеводов, спиртов, органических кислот. В кач-ве естественных материалов применяют отходы пищевых производств: отруби, мелассу, жмыхи, кукурузный экстракт, солодовые ростки, пивные дрожжи, зерно-картофельную барду. Для накопления ферментов в культуральной среде необходимо обеспечить оптимальные условия для их синтеза: состав среды, температуру, значение рН, снабжение клеток кислородом воздуха. Для нужд пищевой промышленности вырабатываются амилолитические ферментные препараты. Препараты представляют собой тонкоизмельченные порошки бежевого или светло-серого цвета влажностью не более 13 %. Они хорошо растворимы в воде без постороннего запаха и вкуса. Протеолитические ферментные препараты используют в мясной промышленности для мягчения мяса, придания ему нежного вкуса и консистенции; в молочной промышленности — для получения гидролизатов белков молока, в пивоварении — для стабилизации пива от помутнения и др. Применяют два способа выращивания продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный. Поверхностный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на поверхности твердых, жидких, полужидких или сыпучих материалов. Этот способ создает хорошие условия для максимального контакта микроорганизмов с кислородом воздуха. Его используют в основном при выращивании мицелиальных грибов. Глубинный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на жидких средах. Этот способ применяют преимущественно при использовании в качестве продуцентов ферментов бактерий и других микроорганизмов, способных интенсивно развиваться в условиях недостаточного контакта клеток с кислородом. Он может быть применен и для культивирования аэробных микроорганизмов. |