1. Возбудители холеры. Биологические свойства, факторы вирулентности. Правила забора и транспортировки материала в лабораторию. Особенности патогенеза
 Скачать 79.01 Kb.
|
|
1. Возбудители холеры. Биологические свойства, факторы вирулентности. Правила забора и транспортировки материала в лабораторию. Особенности патогенеза. Семейство: Vibrionaceae Род: Vibrio Вид: V. cholerae Биовары: V. cholerae cholerae (asiaticae, classicae) V. cholerae eltor V. cholerae bengalii (О139) Всего род Vibrio включает 36 видов (V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. metschnigovii, V. proteus, V. albensis, V. alginoluticus, V. mimicus, V. damsela… – возбудители холероподобных заболеваний) Возбудители холеры относятся к роду Vibrio, семейства Vibrionaceae. Внутри вида Vibrio cholerae различают два ос-новных биовара: биовар cholerae classic, открытый Р. Кохом в 1883 г., и биовар Elor, выделенный в 1906 г. в Египте Ф. и Е. Готшлихами на карантинной станции Эль-Тор. Морфология и тинкториальные свойства. Холерный вибрион - грамотрицательная палочка в форме запятой, длиной 2-4 мкм, толщиной 0,5 мкм. Не образует спор и капсулы, монотрих, чрезвычайно подвижен. Слегка изогнутые грамотрицательные палочки (хорошо окрашиваются анилиновыми красителями) В старых культурах – полиморфны (кокковидные и нитевидные формы). В мазках из нативного материала располагаются в виде «стайки рыб». При лечении антибиотиками подвижность уменьшается и может превращаться в L-формы. Культуральные свойства. Является факультативным анаэробом, но предпочитает аэробные условия роста, поэтому на поверхности жидкой питательной среды образует пленку. Холерный вибрион неприхотлив в росте и может расти на простых средах. Оптимальная температура роста 37 °С и рН 8,5-9,0. Для оптимального роста требует присутствия в среде 0,5% натрия хлорида. Средой накопления является 1% щелочная пептонная вода, на которой он образует пленку в течение 6-8 ч. Элективной средой является TCBS-среда (тиосульфат-цитратный сахарозо-желчесодержащий агар), на котором образует колонии желтого цвета. Щелочной агар и триптонсоевый агар (ТСА) используют для субкультивирования. Но требователен к pH (галофил), оптимальная pH 8,0-9,0. В 1% щелочной пептонной воде через 6-8 часов отмечается рост в виде нежной, тонкой, голубоватой пленки (при встряхивании разрушается). На плотной среде (щелочной агар) через 10-12 часов вырастают мелкие (1,5-2 мм), маслянистые, гладкие, прозрачные, голубоватые колонии с ровным краем (S-формы). При длительном культивировании колонии увеличиваются в размерах, становятся мутными, с плотным центром, пигментированные (коричневого или желтого цвета), шероховатые (R-формы), бактерии из них не чувствительны к бактериофагам, антибиотикам и не агглютинируются О-сывороткой. На щелочно-кровяном агаре V. eltor дает зону гемолиза. Биохимические свойства. Биохимически активен. Оксидазоположителен. Обладает протеолитическими и сахаролитическими свойствами: продуцирует индол, лизиндекарбоксилазу, разжижает в воронковидной форме желатин, сероводород не продуцирует. Ферментирует глюкозу, сахарозу, маннозу, крахмал, лактозу (медленно). Не сбраживает рамнозу, арабинозу, дуль-цит, инозит, инулин. Обладает нитратредуктазной активностью. Активны, оксидазоположительны, V. cholerae eltor и V. cholerae bengalii могут давать положительную реакцию Фоге-са-Проскауэра, расщепляют многие сахара (глюкозу, лактозу, мальтозу, маннит, гликоген, крахмал…) с образованием кислоты без газа. По способности ферментировать сахарозу, арабинозу и маннозу все вибрионы по классификации Хейберга разделены на 6 групп. Холерные вибрионы принадлежат к 1 группе – расщепляют сахарозу, маннозу и не расщепляют арабинозу. Также не сбраживают рамнозу, дульцит, инулин, инозит. Разжижают желатин в виде ворон-ки, образуют индол, разлагают мочевину до аммиака, восстанавливают нитраты в нитриты, свертывают кроличью плазму, разжижают свернутую сыворотку, молоко. Н2S не образуют. Антигенная структура. Холерный вибрион обладает О- и Н-антигенами. В зависимости от строения О-антигена различают более 200 серогрупп, среди которых возбудителями холеры являются серогруппы О1 и О139. Внутри серогруппы О1 в зависимости от сочетания А-, В- и С-субъединиц происходит подразделение на серовары: Огава (АВ), Инаба (АС) и Гикошима (АВС). Вибрионы серогруппы О139 агглютинируются только сывороткой О139. Н-антиген является общеродовым антигеном. v О-антиген – группо- и типоспецифический, термостабильный ЛПС КС. В роду Vibrio по О-антигену выделяют более 200 серогрупп. Холерный вибрион относится к О1 и О139 группам. Внутри О1 группы О-антиген неоднороден и вклю-чает три компонента – А, В и С, по сочетанию которых выделяют три серотипа: АВ – Огава (Ogava), АС – Инаба (Inaba), АВС – Гикошима (Hicoshima). Вибрионы, не агглютинирующиеся сыворотками групп О1 и О139, называются неагглю-тинируемыми – НАГ вибрионами, вызывают холероподобные заболевания. v Н-антиген – термолабильный, общий, белковой природы. v Эндотоксин – стимулирует выработку вибриоцидных антител. v Холероген – запускает синтез антитоксических антител. Факторы патогенности. Факторы патогенности. Главными факторами патогенности являются холерный энтеротоксин (СТ), токсинкорегулируемые пили (Тср), нейраминидаза и растворимая гемагглютининпротеаза. Токсинкорегулируемые пили являются пилями IV типа, которые обеспечивают колонизацию микроворсинок тонкой кишки, участвуют в образовании биопленок на поверхности панциря гидробионтов, а также являются рецепторами для конвертирующего бактериофага СТХ. Холерный энтеротоксин - белок с молекулярной массой 84 000 Д, синтез которого осуществляется геном, локализо-ванном на бактериофаге СТХ. Только серогруппы О1 и О139 лизогенизированы этим бактериофагом. Токсин состоит из 1 субъединицы А и 5 субъединиц В. Субъединица А состоит из 2 полипептидных цепочек А1 и связанных между собой дисульфидными мостиками. В субъединичном комплексе В 5 одинаковых полипептидов соединены друг с другом нековалентной связью в виде кольца. В-субъединицы ответственны за связывание всей молекулы токсина с клеточным рецептором, которым является моносиаловый ганглиозид GM1, им очень богаты эпителиальные клетки слизистой оболочки тонкой кишки. Для того чтобы В-субъединицы могли взаимодействовать с рецептором GM1, от него должна быть отщеплена сиаловая кислота, что осуществляется ферментом нейраминидазой, которая способствует реализации действия токсина. Прикрепление В-субъединичного комплекса к мембране кишечного эпителия позво-ляет субъединице А1 проникнуть в клетку, где она активирует аденилатциклазу, переводя ее в постоянное активное состояние, следствием чего является усиление синтеза цАМФ. Под влиянием цАМФ в кишечнике изменяется актив-ный транспорт ионов. В области крипт эпителиоцитами усиленно выделяются ионы Cl-, а в области ворсинок затруд-няется всасывание Na и Cl, что составляет осмотическую основу для выделения в просвет кишечника воды. Растворимая гемагглютининпротеаза играет важную роль в откреплении возбудителя от поверхности кишечника в результате ее деструктивного действия на рецепторы кишечного эпителия, ассоциированные с вибрионами, давая возможность возбудителю инфицировать новые участки тонкой кишки. Кроме того, у холерного вибриона имеется эндотоксин, который, активируя каскад арахидоновой кислоты, запускает синтез простагландинов, результатом дей-ствия которых являются сокращение гладкой мускулатуры кишечника и развитие тенезм, а также добавочные белко-вые токсины (zonulo и энтеротоксины), которые участвуют в увеличении проницаемости стенки кишечника. Токсины: v Эндотоксин – ЛПС клеточной стенки, термостабильный, вызывает местное воспаление в тонком кишечнике, его сокращение (запускает каскад арахидоновой кислоты, что приводит к синтезу простагландинов E, F) и индуцирует синтез антител. v Экзотоксин=энтеротоксин=холероген (основная роль в патогенезе) – термолабильный белок, состоит из двух ком-понентов: А и В. Компонент В – нетоксичный, обладает способностью соединяться с рецепторами эпителиальных клеток тонкого кишечника, облегчая проникновение в клетку компонента А. Компонент А составляют субъединица А1 (активный центр) и субъединица А2, связывающая А и В. Субъединица А1 активирует внутриклеточную аденилатцик-лазу, приводя к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ и выходу жидкости и электролитов из клеток либеркюновых желез в просвет кишечника. Ферменты патогенности: v Нейраминидаза; v Гиалуронидаза; v Муциназа; v Протеазы; v Лецитиназа; v Гемолизин V. eltor. Структурные и химические компоненты клетки: v Пили I типа; v Жгутик, обусловливающий движение, а также преодоление слизистого слоя и взаимодействие с эпителиальными клетками; v Фактор G – фактор проницаемости. Резистентность. Отношение к факторам окружающей среды. Возбудители холеры чувствительны к УФ-лучам, высушиванию, дезинфектантам (за исключением четвертичных аминов), кислым значениям рН, нагреванию. Источниками инфекции являются больной человек, бактерионосители, а также водная среда и гидробионты. Носительство вибриона Эль-Тор встречается чаще, чем классического вибриона (на 1 больного холерой приходится 10-1000 носителей). Возбудитель холеры, особенно биовар Эль-Тор, способен к существованию в воде в симбиозе с гидробионтами, водорослями, в неблагоприятных условиях может переходить в некультивируемую форму. Эти свойства позволяют отнести холеру к антропонозно-сапронозным инфекциям. Выживаемость во внешней среде зависит от pH среды, вибрионы чувствительны к действию прямых солнечных лучей, высокой температуре (при 500С погибают за 30 минут, 1000С – через несколько секунд), высушиванию. В открытых водоемах сохраняются от нескольких дней до 3 месяцев, в почве от 8 дней до 3 месяцев, в выгребных ямах – до 3-4 месяцев, в морской воде до 47 суток, в сточных водах – 1-2 суток. Сохраняются в молоке и молочных продуктах от 5 дней до 4 недель, на фруктах 1-2 дня, на сырых овощах – 2-4 дня. Устойчивы к действию низких температур (во льду могут сохраняться до 1-4 месяцев). Высокочувствительны к кислотам (KMnO4 – 15 минут), хлорсодержащим дезсред-ствам (10 минут), антибиотикам тетрациклинового ряда, V. eltor устойчив к полимиксину в отличие от V. cholerae asiatica Патогенез и клинические особенности. Инкубационный период от 2 ч до 6 дней. Болезнь развивается остро с повышения температуры тела до 38-39 °С, рво-ты, поноса, болей в животе, тенезм. Стул имеет вид рисового отвара. Резкое обезвоживание приводит к нарушениям деятельности сердечно-сосудистой и дыхательной систем, развитию почечной недостаточности. При отсутствии ле-чения болезнь может перейти в стадию холерного алгида (от лат. algidus - холодный), характерным признаком кото-рого является снижение температуры тела до 34 °С. При отсутствии лечения холерный алгид заканчивается летально. Входные ворота – тонкий кишечник, основная роль принадлежит холерогену, вызывающему дегидратацию и обессо-ливание организма. Вибрион находится только в тонком кишечнике, размножается, не распространяясь по организ-му, вибрионемия отсутствует. Инкубационный период – от нескольких часов до 2-3 дней. Клинические периоды холеры: 1. Холерный энтерит: на фоне нормальной температуры редкий жидкий стул, боли в животе, тенезмы, через 1-2 дня присоединяется рвота. 2. Острый гастроэнтерит: частая рвота, урчание в животе, испражнения приобретают вид «рисового отвара» (мутная жидкость с плавающими остатками слизи и клетками эпителия), акты дефекации учащаются (выделяют до 30 литров в сутки), язык покрывается налетом, количество мочи уменьшается, выраженная жажда, обезвоживание. 3. Холерный алгид – t 35°C, кожные покровы серые, синюшные, морщинистые, лицо Гиппократа (facies hippocratica): нос заострен, глаза запавшие, выступающие скулы, афония, гипотония. Смерть наступает от сердечно-сосудистой и почечной недостаточности в результате обезвоживания и интоксикации Микробиологическая диагностика. Основу микробиологической диагностики составляют выделение и идентификация возбудителя. Материалом для исследования служат испражнения, рвотные массы, пищевые продукты, вода, гидробионты, смывы с объектов окружающей среды. Материал засевается на элективную питательную среду, TCBS-агар с последующим субкультивированием на неселективных средах и идентификацией по антигенной структуре и биохимическим свойствам. Дополнительно факультативно можно сделать посев и на щелочную пептонную воду с последующим субкультивированием на TCBS-агаре. Для экспресс-диагностики используют РИФ и ПЦР. Исследуемый материал – фекалии, рвотные массы, желчь, секционный материал, мухи, пищевые продукты, вода, ил, гидробионты, сточные воды. 1. Бактериоскопический метод. 2. Бактериологичекий метод (основной). 3. Экспресс-методы – РИФ, реакция иммобилизации вибрионов О1-сывороткой и бактериофагом, ПЦР. 4. Серологический метод – РА, РПГА, РИФ, ИФА. Предварительный положительный ответ при диагностике холеры выдается через 5-6 часов на основании обнаружения в посевах культур, агглютинирующихся на стекле холерной О1-сывороткой (в разведении не менее 1:100) и положительном результате ускоренных методов исследования. Окончательный положительный ответ выдается через 18-48 часов на основании выделенных культур, имеющих типичные морфологические признаки с учетом данных развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, пробы с холерными диагностическими фагами, принадлежности к 1 группе Хейберга. 3. Возбудители вибриогенных диарей. Биологические свойства. Особенности патогенеза. Помимо вида V. cholerae, еще 12 видов рода Vibrio способны вызвать заболевание у человека. Вибрионы многих ви-дов являются галофильными, они обитают в морях, концентрация соли в воде которых колеблется от 5 до 30%, по-этому при культивировании в искусственных условиях они требуют присутствия в питательных средах 2-3% концен-трации NaCl. Они обладают выраженной биохимической активностью, их дифференциация проводится по биохими-ческим свойствам и тесту тяжа (string-test). Среди галофильных вибрионов по частоте и тяжести вызываемых ими заболеваний особое место занимают парагемолитические вибрионы. V. parahaemolyticus является обитателем аква-торий, омывающих Японию, Юго-Восточную Азию, Латинскую Америку. Заражение происходит при использовании в пищу термически не обработанных обитателей моря. Больной человек не представляет опасности для окружающих, если исключена возможность инфицирования им пищевых продуктов. Отличительными биохимическими признака-ми V. parahaemolyticus является неспособность ферментировать сахарозу, целлобиозу, салицин. Возбудитель обла-дает лизиндекарбоксилазой. Патогенность обусловлена продукцией энтеротоксина, термолабильного и прямого термостабильного гемолизина, который обладает кардиотоксическим и энтеротоксическим свойством. Антигенная структура представлена О-антигеном (12 сероваров) и К-антигеном (66 сероваров). Каждый К-антиген сочетается с определенным О-антигеном, образуя ту или иную серогруппу. К группе галофильных вибрионов, которые вызывают преимущественно септицемии или раневые инфекции, относят V. vulnificus, V. damsela, V. alginolyticus. V. vulnificus обитает в прибрежных водах и устьях рек Тихоокеанского и Атлантического побережья. Микроб вызывает у людей первичный сепсис, раневые инфекции, в основном у лиц, занимающихся ручной разделкой продуктов моря. Синдром первичного сепсиса может развиться после употребления в пищу сырых моллюсков, как правило, у лиц с иммунодефицитом. V. vulnificus продуцирует лизиндекарбоксилазу, ферментирует целлобиозу, салицин, лактозу. Патогенность связана с наличием капсулы, выработкой коллагеназы, фосфолипазы, цитотоксина. Среди вибрионов известна также группа способных к биолюминесценции вибрионов (V. phosphorescens, V. albensis). Для микробиологической диагностики используют бактериологический метод. Для идентификации галофильных вибрионов применяют те же среды, что и для возбудителей холеры, но с увеличением до 1,5% натрия хлорида. Ма-териалом для исследования в зависимости от характера заболевания являются испражнения, рвотные массы, желчь, раневое отделяемое, кровь, спинномозговая жидкость. · genus Vibrio (V.cholerae, V. parahaemolyticus, V.fluvialls and others Vibrio cholerae относится к семейству Vibrionaceae, роду Vibrio. Морфология. Холерные вибрионы имеют форму изогнутой палочки линой 1,5 — 3,0 мкм, толщиной 0,3 мкм ; очень подвижны, обычно монотрихи, не образуют спор и капсул, грамотрицательны. Под влиянием физических, химических и биологических факторов холерные вибрионы подвержены изменчивости. На искусственных средах и в старых культурах они могут принимать форму зерен, шаров, колбовидных образований, палочек, нитей, спиралей, образовывать L-формы; при пересеве на свежие среды вибрионы возвращаются к своим исходным формам. Культивирование. Холерные вибрионы — факультативные анаэробы, хорошо развиваются на средах с рН 7,2 — 8,6, на плотных средах образуют прозрачные, с голубоватым оттенком выпуклые дисковидные колонии с ровными краями. На желатине микроорганизмы образуют прозрачные зернистые колонии которые при ис-следовании под микроскопом походят на битое стекло. Через 48 часов питательная среда вокруг колоний разжижается и колонии погружаются в зону разжижения. На щелочном бульоне и пептонной воде через 6 ч роста появляется нежная пленка, состоящая из холерных вибрионов. Холерные вибрионы изменяются и в культуральном отношении, они диссоциируют из S-формы в R-форму. Этот мутационный процесс сопровождается глубокими изменениями антигенной структуры. Патогенез заболевания у человека. Холерные вибрионы передаются от больных и носителей через пищу, во-ду, мух и грязные руки. Микробы через рот после прохождения кислотного барьера желудка проникают в тонкий кишечник. Благодаря наличию щелочной среды и обилию продуктов белкового распада в кишечнике создаются благоприятные условия для размножения холерных вибрионов и продукции ими сильного энтеро-токсина, называемого холерным токсином (холероген). В развитии болезни различают три периода: 1) холерный энтерит (холерный понос или диарея) продолжи-тельностьюсут; у части больных на этом этапе заканчивается инфекционный процесс и наступает выздоров-ление; 2) холерный гастроэнтерит, при котором обильный понос и многократная рвота приводят к обезвожи-ванию организма больных, что влечет за собой снижение температуры, уменьшение диуреза, резкое умень-шение минеральных и белковых веществ в крови, появление судорог; испражнения напоминают рисовый от-вар; 3) холерный алгид, проявляющийся тяжелыми симптомами: тургор кожи снижен, она собирается в складки; появля-ется цианоз, голос становится охриплым, иногда наблюдается полная афония; температура тела снижается до 35,5 – 34 °С, развиваются резкое ослабление сердечной деятельности вследствие повышения вязкости крови, задержка мочеиспускания. В ряде случаев развивается холерная кома, приводящая к прострации и смерти. V.parahaemolyticus — парагемолитический вибрион Парагемолитический вибрион имеет три типа антигенов: термолабильные жгутиковые Н-антигены, термостабиль-ные, не разрушающиеся при нагревании до 120 °С в течение 2 ч О-антигены и поверхностные К-антигены, разрушаю-щиеся при нагревании. Свежевыделенные культуры V рага-haemolyticus имеют хорошо выраженные К-антигены, которые предохраняют живые вибрионы от агглютинации гомологичными О-сыворотками. Н-антигены у всех штам-мов одинаковы, но Н-антигены монотрихов отличаются от Н-антигенов перитрихов По О-антигену V.parahaemolyticus разделяют на 14 серогрупп. Внутри серогрупп вибрионы подразделяют на серотипы по К-антигенам, общее количе-ство которых составляет 61 Антигенная схема Vparahaemolyticus разработана применительно только к его штаммам, выделяемым от людей. Патогенность V.parahaemolyticus связана с его способностью синтезировать гемолизип, обладающий энтеротоксиче-ским свойством. Последнее выявляется с помощью метода Кана!авы Сущ- ность его заключается в том, что патогенные для человека V.parahaemolyticus вызывают четкий гемолиз на кровяном агаре, содержащем 7% NaCl. На кровяном агаре, содержащем менее 5% NaCl, гемолиз вызывают многие штаммы V.parahaemolyticus, а на кровяном агаре с 7% NaCl — только штаммы с энтеропатогенными свойствами. Парагемоли-тический вибрион обнаружен на побережьях Японского, Каспийского, Черного и других морей. Он вызывает пище-вые токсикоин-фекции и дизентериеподобные заболевания. Заражение происходит при употреблении в пищу сырых или полусырых морских продуктов, инфицированных V.parahaemolyticus (морская рыба, устрицы, ракообразные и т. п.). V.fluvialls впервые как возбудитель гастроэнтерита был описан в 1981г. Он относится к подгруппе нехолерных пато-генных вибрионов, у которых есть аргининдигидролаза, но нет орнитин-и лизиндекарбоксилаз (V.fluvialis, V.furnissii, V.damsela, т. е. фенотипически сходных с Aeromonas). V.fluvialis — частый возбудитель гастроэнтеритов, которые сопровождаются сильной рвотой, поносом, абдоминальными болями, повышением температуры и сильной или сред-ней тяжести дегидратацией. Главным фактором патогенности является энтеротоксин |