А. Левенгука, Л. Пастера, Р. Коха. 2 Открытия Открытия А. Левенгука, Л. Пастера, Р. Коха, И. Мечникова, п эрлиха
 Скачать 6.07 Mb.
|
|
протопласты. Обработка грамотрицательных бактерий лизоцимом разрушает только слой пептидогликана, не разрушая полностью внешней мембраны; такие структуры называют сферопластами. Протопласты и сферопласты имеют сферическую форму (это свойство связано с осмотическим давлением и характерно для всех безклеточных форм бактерий). К поверхностным структурам бактерий (необязательным, как и клеточная стенка), относятся капсула, жгутики, микроворсинки. Капсула или слизистый слой окружает оболочку ряда бактерий. Выделяют микрокапсулу, выявляемую при электронной микроскопии в виде слоя микрофибрилл, и макрокапсулу, обнаруживаемую при световой микроскопии. Капсула является защитной структурой (прежде всего от высыхания), у ряда микробов- фактором патогенности, препятствует фагоцитозу, ингибирует первые этапы защитных реакций- распознавание и поглощение. У сапрофитов капсулы образуются во внешней среде, у патогенов- чаще в организме хозяина. Существут ряд методов окраски капсул в зависимости от их химического состава. Капсула чаще состоит из полисахаридов (наиболее распространенная окраска- по Гинсу), реже- из полипептидов. В состав белков входят как обычные для эукариотов аминокислоты, так и оригинальные- диаминопимелиновая, D-аланин, D-глютанин, входящие в состав пептидогликанов и капсул некоторых бактерий. Только в спорах находится дипиколиновая кислота, с которой связана высокая резистентность спор. Жгутики построены из белка флагеллина, обладающего сократительной способностью и выраженными антигенными свойствами. Пили (ворсинки) содержат особый белок- пилин. Пептидную природы имеют капсулы представителей рода Bacillus, возбудителя чумы, поверхностные антигены ряда бактерий, в том числе стафилококков и стрептококков. Белок А - специфический белок S.aureus - фактор, обусловлавливающий ряд свойств этого возбудителя. Белок М - специфический белок гемолитических стрептококков серогруппы А, позволяющий дифференцировать серовары (около 100), что имеет эпидемиологическое значение. Ряд белков содержит наружная мембрана грамотрицательных бактерий, из которых 3 - 4 мажорных (основных) и более 10- второстепенных, выполняющих различные функции. Среди мажорных белков- порины, образующие диффузные поры, через которые в клетку могут проникать мелкие гидрофильные молекулы. Белки входят в состав пептидогликана- биополимера, составляющего основу бактериальной клеточной стенки. Он состоит из остова (чередующиеся молекулы двух аминосахаров) и двух наборов пептидных цепочек- боковых и поперечных. Наличие двух типов связей- гликозидных (между аминосахарами) и пептидных, которые соединяют субъединицы пептидогликанов, придают этому гетерополимеру структуру молекулярной сети. Пептидогликан- наиболее устойчивое соединение, которое образует ригидную мешковидную макромолекулу, определяющую постоянную форму бактерий и ряд их свойств. 1.Пептидогликан содержит родо- и видоспецифические антигенные детерминанты. 2.Он запускает классический и альтернативный пути активации системы комплемента. 3.Пептидогликан тормозит фагоцитарную активность и миграцию макрофагов. 4.Он способен инициировать развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). 5.Пептидогликан обладает противоопухолевым действием. 6.Он оказывает пирогенное действие, т.е. вызывает лихорадку. Из соединений белков с небелковыми компонентами наибольшее значение имеют липопротеиды, гликопротеиды и нуклеопротеиды. Эндоспоры и спорообразование. Спорообразование- способ сохранения определенных видов бактерий в неблагоприятных условиях среды. Эндоспоры образуются в цитоплазме, представляют собой клетки с низкой метаболической активностью и высокой устойчивостью (резистентностью) к высушиванию, действию химических факторов, высокой температуры и других неблагоплиятных факторов окружающей среды. При световой микроскопии часто используют метод выявления спор по Ожешко. Высокая резистентность связана с большим содержанием кальциевой соли дипиколиновой кислоты в оболочке спор. Расположение и размеры спор у различных микроорганизмов отличается, что имеет дифференциально- диагностическое (таксономическое) значение. Основные фазы “жизненного цикла” спор- споруляция (включает подготовительную стадию, стадию предспоры, образования оболочки, созревания и покоя) и прорастание, заканчивающееся образованием вегетативной формы. Процесс спорообразования генетически обусловлен. 9 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год 7) Характеристика микроскопического метода исследования. Различные способы и приемы микроскопического исследования бактерий. Способы приготовления нативных и фиксированных препаратов. Микроскопические методы исследования способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяютизуча ть строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающейспособности глаза чело века. Основу М.м.и. составляет световая и электронная микроскопия. Используют фазовоконтрастную,интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическ ую, ультрафиолетовую,инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. Пр и электронноймикроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазовоконтрастнуюмикр оскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. Приэтом измен яется длина и фаза световой волны. Объектив специального фазовоконтрастного микроскопасодержит полупро зрачную фазовую пластинку. Живые микроскопические объекты или фиксированные, но неокрашенные микроорг анизмы и клетки изза их прозрачности практически не изменяют амплитуду и цветпроходящего через них светового луча. вызывая лишь сдвиг фазы его волны. Однако, пройдя черезизучаемый объект, лучи света отклоняются от полу прозрачной фазовой пластинки. В результате междулучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона воз никает разность длины волны. Если этаразность составляет не менее 1 / 4 длины волны, то появляется зрительный эфф ект, при котором темныйобъект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазо вой пластинки. Разновидностью фазово-контрастной микроскопии является амплитудно- контрастная, или аноптральная,микроскопия, при которой применяют объектив со специальными пластинками, изме няющими только яркостьи цвет фонового света. В результате расширяются возможности исследования живых неокр ашенныхобъектов. Фазово- контрастная микроскопия находит применение в микробиологии и паразитологии приисследовании микроорганизмо в, простейших, клеток растений и животных; в гематологии для подсчета иопределения дифференцировки клеток ко стного мозга и крови; а также при изучении клеток культуры тканей ит.п. Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово- контрастная. Но если последняяпозволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерфер енционной микроскопииможно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Это дос тигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу наблюдаемогообъекта, а друг ой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумялучам и, поляризованными во взаимноперпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете. Для этогоиспользуют п ленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источникомсвета и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различныеструктурные компоненты кле ток и тканей, свойства которых неоднородны. В так называемых изотропныхструктурах скорость распространения п оляризованного света не зависит от плоскости поляризации, ванизотропных структурах скорость его распространени я меняется в зависимости от направления света попродольной или поперечной оси объекта. Если показатель прелом ления света вдоль структуры больше, чем впоперечном направлении, возникает положительное двойное лучепрелом ление, при обратныхвзаимоотношениях — отрицательное двойное лучепреломление. Широкое распространение имеет люминесцентная микроскопия. Она основана на свойстве некоторыхвеществ д авать свечение — люминесценцию в УФ-лучах или в сине- фиолетовой части спектра. Многиебиологические вещества, такие как простые белки, коферменты, некоторые витам ины и лекарственныесредства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают све титься толькопри добавлении к ним специальных красителей — флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюор охромымогут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структурыил и определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использованиелюминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях. С помощью иммунофлюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляютвирусные антигены и их концентр ацию в клетках, идентифицируют вирусы, определяют антигены и антитела,гормоны, различные продукты метаболи зма и т.д. В связи с этим люминесцентную микроскопиюприменяют в лабораторной диагностике таких инфекций, к ак герпес, эпидемический паротит, вирусныйгепатит, грипп и др., используют в экспресс- 10 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуяотпечатки со слизистой оболочки носа больных, и при ди фференциальной диагностике различных инфекций.В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии ра спознают злокачественные опухоли вгистологических и цитологических препаратах, определяют участки ишемии м ышцы сердца при ранних срокахинфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т.д. Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живыхклеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей,поглощать УФ- излучение с определенной длиной волн (400/250 нм). Этим свойством обладаютвысокомолекулярные соединения, та кие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты (тирозин,триптофан, метилалании), пуриновые и пира мидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовоймикроскопии уточняют локализацию и количество указан ных веществ, а в случае исследования живыхобъектов — их изменения в процессе жизнедеятельности. Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях структуры клеток, тканей микроорганизмов ивиру сов используют электронную микроскопию. Этот М.м.и. позволил перейти на качественно новый уровеньизучения материи. Он нашел широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии,онкологии, генетик е, иммунологии, Резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопаобеспечивается потоком эл ектронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемыеэлектромагнитными линзами. Электрон ы могут проходить через структуры исследуемого объекта(трансмиссионная электронная микроскопия) или отражат ься отних (сканирующая электронная микроскопия),отклоняясь под разными углами, в результате чего возникает из ображение на люминесцентном экранемикроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроско пии получают плоскостноеизображение структур (рис. 4), при сканирующей — объемное (рис. 5). Сочетание электр онной микроскопии сдругими методами, например с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими ме тодамиисследования (Иммунологические методы исследования), позволяет проводить электронно- радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования. Приготовление препарата для изучения микроорганизмов в нативном виде Метод "висячей капли". Препарат готовят на покровном стекле, в центре которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40Х и исследуют препарат. Метод "раздавленной" капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40Х. После микроскопии препараты "раздавленной" капли или "висячей" капли опускают в дезинфицирующий раствор. Приготовление фиксированных препаратов-мазков Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок. При таком распределении материала в мазке при микроскопии можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидком виде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать. Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют погружением на 15-20 мин. в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт и другие фиксирующие жидкости. микроорганизм бактерия гриб препарат 8) Химический состав и физико-химические свойства бактерий. Тинкториальные свойства бактерий. Просты и сложные методы окраски мазков. Окраска по Граму, Бури-Гинсу, Ожешки, Нейссеру, Цилю-янильсену. Механизм и практическое значение. Клетка - универсальная единица живой материи. По химическому составу существенных отличий прокариотических и эукариотических клеток нет. Химические элементы, входящие в состав живой материи, можно разделить на три основные группы. 11 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год 1.Биогенные химические элементы (С, О, N, H). На их долю приходится 95% сухого остатка, в т.ч. 50%- C, 20%- O, 15%- N, 10%- H). 2.Макроэлементы- P, S,Cl, K, Mg, Ca, Na. На них приходится около 5 %. 3.Микроэлементы- Fe, Cu, I, Co, Mo и др. На них приходятся доли процента, однако они имеют важное значение в обменных процессах. Химические элементы входят в состав различных веществ - воды, белков, липидов, нейтральных жиров, углеводов, нуклеиновых кислот. Синтез соединений контролируется генами. Многие вещества бактериальная клетка может получать извне - из окружающей среды или организма хозяина. Вода составляет от 70 до 90 % биомассы. Содержание воды больше у капсульных бактерий, меньше всего - в спорах. Белки встречаются во всех структурных элементах клетки. Белки могут быть более простые (протеины) и сложные (протеиды), в чистом виде или в комплексе с липидами, сахарами. Выделяют структурные (структурообразующие) и функциональные (регуляторные) белки, к последним относятся ферменты. В состав белков входят как обычные для эукариотов аминокислоты, так и оригинальные- диаминопимелиновая, D-аланин, D-глютанин, входящие в состав пептидогликанов и капсул некоторых бактерий. Только в спорах находится дипиколиновая кислота, с которой связана высокая резистентность спор. Жгутики построены из белка флагеллина, обладающего сократительной способностью и выраженными антигенными свойствами. Пили (ворсинки) содержат особый белок- пилин. Пептидную природы имеют капсулы представителей рода Bacillus, возбудителя чумы, поверхностные антигены ряда бактерий, в том числе стафилококков и стрептококков. Белок А - специфический белок S.aureus - фактор, обусловлавливающий ряд свойств этого возбудителя. Белок М - специфический белок гемолитических стрептококков серогруппы А, позволяющий дифференцировать серовары (около 100), что имеет эпидемиологическое значение. Ряд белков содержит наружная мембрана грамотрицательных бактерий, из которых 3 - 4 мажорных (основных) и более 10- второстепенных, выполняющих различные функции. Среди мажорных белков- порины, образующие диффузные поры, через которые в клетку могут проникать мелкие гидрофильные молекулы. Белки входят в состав пептидогликана- биополимера, составляющего основу бактериальной клеточной стенки. Он состоит из остова (чередующиеся молекулы двух аминосахаров) и двух наборов пептидных цепочек- боковых и поперечных. Наличие двух типов связей- гликозидных (между аминосахарами) и пептидных, которые соединяют субъединицы пептидогликанов, придают этому гетерополимеру структуру молекулярной сети. Пептидогликан- наиболее устойчивое соединение, которое образует ригидную мешковидную макромолекулу, определяющую постоянную форму бактерий и ряд их свойств. 1.Пептидогликан содержит родо- и видоспецифические антигенные детерминанты. 2.Он запускает классический и альтернативный пути активации системы комплемента. 3.Пептидогликан тормозит фагоцитарную активность и миграцию макрофагов. 4.Он способен инициировать развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). 5.Пептидогликан обладает противоопухолевым действием. 6.Он оказывает пирогенное действие, т.е. вызывает лихорадку. Из соединений белков с небелковыми компонентами наибольшее значение имеют липопротеиды, гликопротеиды и нуклеопротеиды. Удивительное таинство жизни - синтез белка осуществляется в рибосомах. Существует два основных типа рибосом - 70S (S- константа седиментации, единица Сведберга) и 80S. Рибосомы первого типа встречаются только у прокариотов. Антибиотики не действуют на синтез белка в рибосомах типа 80S, распространенных у эукариотов. |