А. Левенгука, Л. Пастера, Р. Коха. 2 Открытия Открытия А. Левенгука, Л. Пастера, Р. Коха, И. Мечникова, п эрлиха
 Скачать 6.07 Mb.
|
|
Липиды (главным образом форфолипиды) содержатся в цитоплазматической мембране (липидный бислой), в также в наружной мембране грамотрицательных бактерий. Есть микроорганизмы, содержащие большое количество липидов (до 40% сухого остатка)- микобактерии. В состав липидов входят различные жирные кислоты, весьма специфичные для разных групп микроорганизмов. Их определение имеет в ряде случаев диагностическое значение, например у анаэробов, микобактерий. У микобактерий туберкулеза в составе липидов имеется ряд кислотоустойчивых жирных кислот- фтионовая, миколовая и др. Высокое содержание липидов и их состав определяют многие свойства микобактерий туберкулеза: -устойчивость к кислотам, щелочам и спиртам; -трудная окрашиваемость красителями (используют специальные методы окраски, чаще- по Цилю- Нильсену); -устойчивость возбудителя к солнечной радиации и дезосредствам; - патогенность. Тейхоевые кислоты встречаются в клеточных стенках грамположительных бактерий. Представляют собой водорастворимые линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибола, связанные фосфодиэфирными связыми. С тейхоевыми кислотами связаны главные поверхностные антигены ряда грамположительных бактерий. Углеводы встречаются чаще в виде полисахаридов, кторые могут быть экзо- и эндоклеточными. Среди экзоклеточных полисахаридов выделяют каркасные (входят в состав капсул) и истинно экзополисахариды (выходят во внешнюю среду). Среди бактериальных полисахаридов многие находят медицинское применение. Декстраны- полисахариды с большой молекулярной массой, по виду напоминают слизь. 6% раствор- кровезаменитель полиглюкин. Декстрановый гель сефадекс используется в колоночной хроматографии как молекулярное сито. 12 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год Эндоклеточные полисахариды- запасные питательные вещества клетки (крахмал, гликоген и др.). Липополисахарид (ЛПС) - один из основных компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий, это соединение липида с полисахаридом. ЛПС состоит из комплекса: 1.Липид А. 2.Одинаковое для всех грамотрицательных бактерий полисахаридное ядро. 3.Терминальная сахаридная цепочка (О- специфическая боковая цепь). Синонимы ЛПС- эндотоксин, О- антиген. ЛПС выполняет две основные функции- определяет антигенную специфичность и является одним из основных факторов патогенности. Это- эндотоксин, токсические свойства которого проявляются преимущественно при разрушении бактериальных клеток. Его токсичность определяется липидом А. ЛПС запускает синтез более 20 биологически активных веществ, определяющих патогенез эндотоксикоза, обладает пирогенным действием. Нуклеиновые кислоты- ДНК и РНК. Рибонуклеиновые кислоты (РНК) находятся главным образом в рибосомах (р-РНК- 80- 85%), т(транспортные)- РНК- 10%, м(матричные)- РНК- 1- 2%, главным образом в одноцепочечной форме. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) может находиться в ядерном аппарате (хромосомная ДНК) или в цитоплазме в специализированных образованиях- плазмидах- плазмидная (внехромосомная) ДНК. Микроорганизмы отличаются по структуре нуклеиновых кислот, содержанию азотистых оснований. Генетический код состоит всего из четырех букв (оснований) - А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин). Наиболее часто для характеристики микроорганизмов используют как таксономический признак процентное соотношение Г/Ц, которое существенно отличается у различных групп микроорганизмов. Микроорганизмы синтезируют различные ферменты- специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов. 1.Оксидоредуктазы- катализируют окислительно- восстановительные реакции. 2.Трансферазы- осуществляют реакции переноса групп атомов. 3.Гидролазы- осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений. 4.Лиазы- катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям. 5.Лигазы или синтетазы- обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата. 6.Изомеразы - определяют пространственное расположение групп элементов. В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов: - конститутивные, синтез которых происходит постоянно; - индуцибельные, синтез которых индуцируется наличием субстрата; - репрессибельные, синтез которых подавляется избытком продукта реакции. Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты. Экзоферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий- способность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие тканевые барьеры. Примеры: гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость тканей (клостридии, стрептококки, стафилококки и многие другие микроорганизмы); нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточном пространстве (холерный вибрион, дифтерийная палочка, вирус гриппа и многие другие). К этой же группе относятся энзимы, разлагающие антибиотики. В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов. 1.Сахаролитические. 2.Протеолитические. 3.Аутолитические. 4.Окислительно- восстановительные. 5.Ферменты патогенности (вирулентности). Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белков- кислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный. Основные ферменты вирулентности- гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии. Ряд ферментов микроорганизмов широко используется в медицине и биологии для получения различных веществ (аутолитические, протеолитические), в генной инженерии (рестриктазы, лигазы). Тинкториальные свойствабактерий (лат. tinctura, от tingo - окрашиваю) способность к окрсаке: восприимчивость к окраске, кислото-спирто-щелочеустойчивость, равномерность окраски, метахроматичность, отношение к окраске 13 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год по методу Грама. Восприимчивость к окраскеу большинства видов бактерий является высокой, они легко и быстро воспринимают окраску. Как правило, перед окраской бактерии фиксируют в пламени или химическими фиксаторами, в результате чего бактерии погибают и лучше воспринимают красители. При окраске в живом состоянии ферментные системы бактерий могут разрушать и обесцвечивать краситель, оттого прижизненное (витальное) окрашивание редко применяется в микробиологии. Отдельные структурные элементы бактериальной клетки по-разному воспринимают красители. Споры и капсулы, которые имеют дифференциальное значение плохо воспринимают красители и не окрашиваются при обычных методах окраски. Но, их можно заметить в обычных окрашенных препаратах: спора видна как светлое тельце на фоне окрашенной цитоплазмы или ее остатков, капсула в виде светлого ореола на окрашенном фоне препарата вокруг интенсивно окрашенного тела бактерий. Разработаны и используются в диагностической практике специальные сложные методы окраски спор и капсул, с которыми студенты знакомятся на практических занятиях. Не воспринимают окраски в обычных условиях некоторые бактерии, которые являются кислото-спирто- щелочеустойчивыми,то есть не погибают при действии растворенных кислот, щелочей и спирта. К ним относятся микобактерии туберкулеза, проказы, некоторых актиномицеты. Кислотоустойчивость этих бактерий обусловлена высоким содержанием липидов, наличием миколовых кислот и физико-химическими особенностями их клеточной стенки. У микобактерий до 40 % сухого остатка составляют липиды. Выявленные три фракции липидов: фосфатидная (растворимая в эфире), жировая (растворимая в эфире и ацетоне) и восковая (растворимая в эфире и хлороформе). Кислотоустойчивость является дифференциально-диагностическим признаком и используется для выявления и идентификации бактерий. Кислотоустойчивость бактерии окрашивают интенсивным методом – концентрированным раствором карболового фуксина при подогревании. Восприняв красную окраску, кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются при обработке кислотой, щелочью или спиртом. Поэтому после окраски фуксином препарат дифференцируют 5 - 10 % серной кислотой или подкисленным спиртом и после промывания водой дополнительно окрашивают обесцвеченные кислоточувствительные микроорганизмы контрастным красителем, например метиленовым синим. Равномерность окраски. Большинство патогенных бактерий окрашивается равномерно, причем детали внутренней структуры бактериальной клетки не оказываются. Часто видимая гомогенность окраски обусловлена тем, что краситель интенсивно связывается с оболочками клетки и маскирует окраску внутренних структур. Например, только при использовании очень разбавленных растворов кристаллвиолета удается получить избирательное окрашивание гранул волютина, в то время, как краситель в обычной концентрации дает равномерную окраску клетки. Однако, некоторые бактерии (палочки чумы) и при обычных методах окраски могут окрашиваться биполярно, в виде «английской булавки}, то есть более интенсивно по полюсам, а центр остается слабоокрашенным. Неравномерно окрашиваются также спороносные палочки, поскольку спора не проокрашивается. Методы окраски мазков Простой метод. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать. Сложные методы. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоты и др. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Окраска по Граму является сложным методом. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя. Промыть водой. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный. Окраска по Бурри (обнаружение капсул). Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с неокрашенными бактериями. Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши; Высушить на воздухе и бактериоскопировать. 14 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные. Метод Ожешко. нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2- 3 минуты); слить кислоту, промыть водой, высушить; зафиксировать в пламени; окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена. Окраска включения волютина (по Нейссеру). Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты); Промыть; Окрасить раствором Люголя (30 секунд); Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута) Промыть препарат и высушить Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные. Окраска по Цилю-Нильсену. Методика: нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут); бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды); тщательно промыть водой; окрасить дефферовской синькой (3-5 минут); промыть водой и высушить. Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску. 9. Физиология микробов.питание и дыхание прокариотов.культивирование аэробных и анаэробных бактерий. значение окислительно-востановительного потенциала(rH2)среды и методы его измерения. Лекция № 4. Физиология и принципы культивирования микроорганизмов. Метаболизм микроорганизмов. Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т.е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих - анаболизм и катаболизм. Анаболизм- синтез компонентов клетки (конструктивный обмен). Катаболизм энергетический обмен, связан с окислительно-восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот)- осмотрофы, или в виде отдельных частиц - фаготрофы. Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: -пассивная диффузия- по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности; - облегченная диффузия - по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз; - активный транспорт - против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде; - транслокация (перенос групп)- против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде. Основные химические элементы- органогены, необходимые для синтеза органических соединений - углерод, азот, водород, кислород. В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на аутотрофы (используют CO2) и гетеротрофы (используют готовые органические соединения). В зависимости от источника энергии 15 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза - например, цианобактерии) и хемотрофы (энергия добывается за счет химических, окислительно-восстановительных реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы, если органические - органотрофы. Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы. Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы. Основными факторами роста для труднокультивируемых бактерий являются пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, некоторые (обычно незаменимые) аминокислоты, кровяные факторы (гемин) и др. Дыхание микроорганизмов. Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание - биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О 2 ), при анаэробном - связанный кислород ( -NO 3 , =SO 4 , =SO 3 ). Примеры. О 2 Аэробное дыхание донор водорода H 2 O Анаэробное дыхание нитратное окисление NO 3 (факультативные анаэробы) донор водорода N 2 сульфатное окисление SO 4 (облигатные анаэробы) донор водорода H 2 S По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов. 1.Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания. 2.Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO 2 , например до 10- процентной концентрации. 3.Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание. 4.Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях, т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется. Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ). В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H 2 O 2 - перекись водорода, -О 2 - свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно-восстановительного потенциала (rH 2 ). Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов. 1.Физический - откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N 2 - 85%, CO 2 - 10%, H 2 - 5%). 2.Химический - применяют химические поглотители кислорода. 3.Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов). 4.Смешанный - используют несколько разных подходов. Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов - очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно-восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях. Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов- предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система “Газпак” со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях. |