А. Левенгука, Л. Пастера, Р. Коха. 2 Открытия Открытия А. Левенгука, Л. Пастера, Р. Коха, И. Мечникова, п эрлиха
 Скачать 6.07 Mb.
|
|
10. Характеристика процессов роста и размножения у бактерий. фазы развития 16 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год бактериальной популяции. закономерности развития культуры на жидких пит средах. периодическое, глубинное и проточное культивирование. Рост и размножение микроорганизмов. Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях: - лаг- фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прироста биомассы бактерий); - экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n); - стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток); - стадия гибели - уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH 2 , концентрации ионов и других условий культивирования). Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов. Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе - это хемостатные (непрерывные) культуры. Процесс размножения культуры микробов на несменяемой среде протекает не¬равномерно. В нем определяют четыре основные фазы. 1. Начальная фаза (лаг-фаза), или фаза покоя. В это время культура приспосабливается к питательной среде. В микробной клетке увеличивается содержание РНК ис ее помощью происходит синтез необходимых фермен¬тов. 2. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза ха¬рактеризуется максимальным увеличением клеток в культуре, оно идет в геометрической прогрессии (1, 2,4, 8, 16, 256 и т. д.). В это время в среде большинство молодых и биологически активных клеток. В конце фа¬зы, когда среда истощается, исчезают необходимые для данного микроба вещества, уменьшается количество кис¬лорода, происходит увеличение продуктов обмена — рост культуры замедляется. Кривая постепенно принимает горизонтальное направление. 3. Стационарная фаза, или период зрелости, гра¬фически представляет линию, идущую параллельно оси абсцисс. Наступает равновесие между числом вновь об¬разованных и погибших клеток. Уменьшается количе¬ство среды, увеличивается плотность клеток в попу¬ляции, усиливается токсическое действие продуктов об¬мена — все это обусловливает гибель клеток. 4. Фаза отмирания. В этой фазе наблюдается не только уменьшение, но и изменение клеток. Появляют¬ся деградированные формы, а также споры. Через не¬сколько недель или месяцев культура погибает. Так происходит потому, что ядовитые продукты жизнедея¬тельности не только тормозят, но и убивают микробные клетки. Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение. Чистая культура- популяция одного вида микроорганизмов. Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн.др.). При периодическом способе производства простерилизованный ферментер заполняется питательной средой, часто уже содержащей нужные микроорганизмы. Биохимические процессы в этом ферментере продолжаются от нескольких часов до нескольких дней. При этом типе культивирования клеточная культура может пройти все фазы своего развития: Синтез первичных метаболитов наиболее интенсивно идет с середины Log-фазы до середины стационарной. Ближе к концу стационарной фазы может начаться синтез вторичных метаболитов. Способ глубинного культивирования бактерий применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следовательно, максимальному выходу биомассы. Метод проточных сред Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.). 11.Характеристика и этапы бактериологического метода исследования. Питательный среды. Чистые культуры и их получение. Способы идентификации выделенной культуры 17 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год Чистая культура- популяция одного вида микроорганизмов. Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн.др.). Основным методом лабораторной диагностики инфекционных болезней является бактериологический метод. Суть бактериологического метода заключается в выделении возбудителей из исследуемого материала и его идентификации (определения рода, вида, разновидностей). Бактериологический метод позволяет определить: 1. Вид возбудителя и поставить диагноз заболевания 2. Антибиотики, убивающие возбудителя и назначить соответствующее лечение 3. Фаговары и серовары возбудителя для выявления источника инфекции Первый этап — первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Первичный посев проводят на накопительные среды и ДДС (чашечные среды). Второй этап — характеристика изолированных колоний и получение из них чистой культуры путем пересева на скошенный столбик основной среды. Третий этап — идентификация чистой культуры — определение рода, вида, разновидностей возбудителя, определение антибиотикочувствительности, определение фаговаров. Культура микроорганизмов — это бактерии, выросшие на питательных средах. Чистая культура — это бактерии одного вида, выросшие на питательных средах. Внутри вида встречаются разновидности, отличающиеся по одному признаку: 1. Морфовары — отличаются по морфологии 2. Хемовары — отличаются по биохимическим свойствам 3. Серовары — отличаются по антигенным свойствам 4. Фаговары — отличаются по чувствительности к фагам Чистая культура необходима для проведения идентификации, определения сероваров, фаговаров, чувствительности к антибиотикам. Штамм — это бактерии одного вида, выделенные из конкретного источника (река Волга, больной Иванов и т. д.). Колония — видимое скопление бактерий одного вида, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде. Первый этап исследования — первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Перед первичным посевом проводят микроскопию исследуемого материала. Исследуемый материал как правило содержит смесь различных бактерий, в том числе и возбудителей болезни. Для выделения возбудителя необходимо получить изолированные колонии (бактерии одного вида) путем подбора питательной среды и специальными методами посева. Существует два метода получения изолированных колоний: 1. Метод Дригальского 2. Метод Коха Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах. 1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов. 2.Оптимальные температура, рН, rH 2 , концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление. Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации. 18 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов. 1.Психрофилы - растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия. 2.Мезофилы - растут в диапазоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С). 3.Термофилы - растут при температурах выше плюс 45 градусов. Краткая характеристика питательных сред. По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды. Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны- продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты - мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др. По назначению среды разделяют на ряд групп: - универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо - пептонный бульон - МПБ, мясо - пептонный агар - МПА); - специальные - среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза); - дифференциально - диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам ( среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса); - селективные (элективные)- для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера. По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические. Выделение чистой культуры Основным методом выделения чистых культур бактерий является метод, предложенный Р. Кохом, принцип которого заключается в получении культуры бактерий из изолированных колоний. При выделении чистой культуры аэробов накопительную культуру или исследуемый материал высевают на плотную питательную среду. Порядок работы следующий. Расплавленную питательную среду разливают в стерильные чашки Петри. После того как среда застынет, на её поверхность наносят каплю исследуемого материала и стерильным шпателем Дригальского распределяют каплю сначала по одной стороне поверхности питательной среды в чашке Петри, затем по второй. Этим же шпателем протирают поверхность плотной среды во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Чашки инкубируют при оптимальной для микробов температуре (чаще всего - 37°С) до 2-х суток. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микробов, тогда как в последующих - изолированные колонии. Рассеивать накопительную культуру можно методом истончающегося штриха. В этом случае накопительную культуру или её разведение отбирают петлей и проводят штрихи по плотной питательной среде в чашке Петри в определенном порядке. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют. Чашки термостатируют 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизма. Выросшие изолированные колонии методом штриха отсевают петлей в пробирки на поверхность скошенной среды или в жидкую среду. Изолированные колонии анаэробов и факультативных анаэробов получают методом глубинного посева. С этой целью в пробирки с расплавленной питательной средой, охлажденной до 40-37°С, высевают по 0,5-1,0 мл разведения исследуемого материала с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Среду быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла. Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение агаризованной среды с посевом. Конец капилляра запаивают. При удачно выбранном разведении в пробирке или пипетке вырастают изолированные колонии. Для их извлечения пробирку (или пипетку) слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки или быстро опустив в теплую воду, при этом агар, прилегающий к стенке, плавится и содержимое столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным скальпелем и извлекают колонии, захватывая их стерильной капиллярной пипеткой или петлей. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции его разламывают стерильным пинцетом и участки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду. Определение чистоты выделенной культуры Чистота колоний, отсеянных на косой агар, может быть проверена несколькими способами: визуальным, контролем под микроскопом и высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной питательной среды. Если рост по штриху неоднороден, то культура считается загрязненной. Однако, такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных питательных сред. Поэтому чистоту культуры обязательно нужно контролировать под микроскопом. Для этого готовят препарат окрашенных клеток и просматривают его с иммерсией. Чистая культура должна быть морфологически однородна и может иметь лишь незначительное варьирование размеров клеток. Определение систематического положения бактерий включает изучение совокупности признаков: морфологических, культуральных и физиолого-биохимических. Культуральные признаки 19 Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год К культуральным или макроморфологическим признакам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. Рост на плотных питательных средах. На поверхности плотных питательных сред микробы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона. Колонией называется изолированное скопление клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки, различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием. При их описании учитывают следующие признаки: форму колоний - округлая, амёбовидная, неправильная, ризоидная и т.д.; поверхность колонии - гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, радиально исчерченная, с концентрическими кругами; профиль колонии - плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный, выпуклый в центре с валиком по краю, вдавленный в центре, с валиком по краю и др.; блеск и прозрачность - блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная; цвет колонии - бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная - белая, жёлтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, чёрная. Особо отмечают выделение пигмента в субстрат; край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый, корневидный и др.; структуру колонии - однородная, мелко- и крупнозернистая, струйчатая (край и структуру колонии определяют с помощью лупы или при малом увеличении микроскопа); консистенцию колонии - её определяют, прикасаясь к колонии петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, пленчатой (снимается целиком), хрупкой. Глубинные колонии довольно однообразны. Чаще всего они похожи на сплющенные чечевички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными концами. Колонии немногих бактерий напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микробы образуют газы. Донные колонии самых разнообразных микроорганизмов имеют вид тонких прозрачных пленок, стелящихся по дну. Размеры и некоторые другие признаки колоний меняются с возрастом и зависят от состава среды, поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды, температуру культивирования. При описании роста микроорганизма по штриху отмечают следующие особенности: рост скудный, умеренный или обильный, сплошной с ровным или волнистым краем, четко видный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоидный. Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверхность и консистенцию. Рост на жидких питательных средах. Различают следующие формы роста бактерий на жидких питательных средах: Помутнение среды. Такой рост характерен для многих патогенных микробов, относящихся к группе факультативных анаэробов. Придонный рост. Характеризуется образованием осадка на дне пробирки. Он может быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев. Консистенция осадка бывает вязкая, слизистая, хрупкая или пастообразная. Если культура не образует пигмента, то цвет среды не изменяется и осадок приобретает серовато-белый или желтоватый цвет. Придонный рост характерен для бактерий с анаэробным типом дыхания. Пристеночный рост бактерий выражается в том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остаётся прозрачной. Бактерии растут в виде крупных рыхлых хлопьев или компактных зёрен, прикреплённых к внутренней поверхности стенок пробирки. Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности жидкой питательной среды плёнки. Плёнка может быть тонкой, бесцветной, исчезающей при встряхивании или взбалтывании, влажной, вязкой, слизистой, плотной, сухой, при взятии с неё материала сниматься целиком в виде круглого диска. Нередко рост микроорганизмов в жидкой питательной среде сопровождается появлением газа и запаха. 12. Морфология и анатомия микроскопических грибов и спирохет. Особенности метаболизма и принципы культивирования спирохет, грибов. Морфологическая характеристика грибов. Грибы и простейшие имеют четко ограниченное ядро и относятся к эукариотам. Грибы крупнее бактерий, в эволюционном плане близки к растениям (наличие клеточной стенки, содержащей хитин или целлюлозу, вакуолей с клеточным соком, неспособность к перемещению, видимое движение цитоплазмы). Ядерный материал грибов отделен от цитоплазмы ядерной мембраной. Дрожжевые грибы образуют отдельные овальные клетки. Плесневые грибы формируют клеточные нитеподобные структуры- |