Бактериальной клетки. Основные морфологические формы бактерий и методы их изучения. Принципы классификации бактерий по Берджи
 Скачать 3.01 Mb.
|
|
3.Углеводный обмен, горение, брожение. Углеводный обмен – это процесс синтеза и распада углеводов. Сложные углеводы внешней среды могут расщепить только те бактерии, которые выделяют ряд экзоферментов (полисахаридазы, олигосахаридазы). Внутрь клетки из углеводов может поступать только глюкоза. ЕЕ судьба двояка. Меньшая ее часть идет на синтез собственных полисахаридов клетки. А большая подвергается дальнейшему расщеплению. Оно может идти двумя путями: Горение – это расщепление углеводов в аэробных условиях. Конечные продукты газ и вода. Брожение – это расщепление углеводов в анаэробных условиях. В зависимости от промежуточных продуктов различают спиртовое, молочнокислое, пропионокислое, масляно-кислое и др.виды брожения. Способность бактерий расщеплять углеводы обозначается как сахаролитическая активность. Изучается углеводный обмен в процессе культивирования исследуемых бактерий на средах Гисса (полужидких средах, содержащих углевод и индикатор, реагирующий на появление кислых продуктов распада углеводов). 4.Белковый обмен. Белковый обмен – это процесс синтеза собственных аминокислот и белков путем ассимиляции необходимых компонентов из внешней среды. Во внешней среде содержатся сложные белки. Их расщепляют только те бактерии, которые выделяют ферменты протеазы. Расщепление белков идет до пептонов. Тление –расщепление белков в аэробных условиях. Гниение –расщепление белков в анаэробных условиях. Протеолитические свойства - способность расщеплять белки до промежуточных продуктов распада – пептонов - изучается при посеве на желатин и (или) лакмусовое молоко. При наличии протеаз у бактерий желатин разжижается, а в молоке образуется сгусток кремового цвета, а над ним светлая, прозрачная жидкость). Пептолитические свойства - способность расщеплять только промежуточные продукты распада белков – пептоны, до элементарных радикалов) изучается при посеве бактерий в мясо – пептонный бульон. Под крышку пробирки помещают индикаторные полоски, способные изменять свой цвет в присутствии летучих продуктов распада пептонов(аммиака, сероводорода, индола). Протео - и пептолитические свойства изучают для идентификации возбудителей. Вопрос 5. Питание бактерий, механизмы питания, системы секреции Питание – процесс потребления различных органических и минеральных соединений, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов. Бактериальная клетка не имеет специальных органов питания - является голофитной по способу потребления питательных веществ. Существуют три основных механизма поступления питательных веществ в бактериальную клетку : пассивная диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт. 1)Пассивный транспорт. Осуществляется за счет различного содержания питательных веществ в среде и в клетке и происходит в направлении от большой концентрации к меньшей, т.е. по градиенту концентрации. Таким путем в клетку проникает вода и выходит из нее вместе с растворенными в ней различными мелкими молекулами, способными проходить через мелкие поры мембраны. Для пассивной диффузии характерно отсутствие субстратной специфичности и она не требует затраты энергии. 2)Облегченная диффузия Характеризуется выраженной субстратной специфичностью и протекает при обязательном участии специфических белков, локализованных в мембране – это пермиазы – «проходящие сквозь». Они распознают и связывают молекулу субстрата на внешней стороне мембраны и обеспечивают ее перенос через мембрану. Облегченная диффузия происходит только по градиенту концентрации – поэтому не требует затрат энергии. 3)Активный транспорт. С помощью этого механизма растворенные вещества могут поступать в клетку против градиента концентрации, поэтому активный транспорт требует от клетки затраты энергии. У бактерий этот механизм преобладает. По способу питания бактерии делятся на: Автотрофы – синтезируют все углеводсодержащие компоненты клетки из СО2 как единственного источника углерода. Гетеротрофы – организмы, которые не могут удовлетворять свои потребности в углероде только за счет СО, а также требует для своего питания готовые органичесике соединения. В свою очередь, гетеротрофов, подразделяют на сапрофитов – источник питания мертвые органические соединения, паразитов – живущих за счет живых тканей животных и растений. · В зависимости от источников энергии все организмы можно подразделить на три группы. 1)Фотолитотрофы источник энергии солнечный свет, доноры электронов – неорганические соединения. 2)Хемолитотрофы - источник энергии окислительно-восстановительные реакции, доноры электронов – неорганические соединения. 3)Хемоорганитрофы –источник энергии окислительно-восстановительные реакции, доноры электронов – органические соединения. По источникам азота: 1)Азотофиксирующие бактерии способны усваивать молекулярный азот из атмосферы или неорганический азот из солей аммония, нитратов или нитритов. 2)Нитрифицирующие бактерии, которые способны использовать для синтеза белков в качестве основных источников азота соли аммиака, азотистой и азотной кислоты. 3)Прототрофы – микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения (углеводы, аминокислоты,) из глюкозы и солей аммония. 4)Ауксотрофы – микроорганизмы, не способные синтезировать какое – либо из указанных соединений и ассимилирующие их в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина (человека, животного). Бактерии способны жить и размножаться не только в естественных условиях, но и на искусственных средах. Системы секреции Бактериальная клетка в процессе жизнедеятельности продуцирует во внешнюю среду белковые молекулы и ферменты секреции. Секреция – это активный транспорт белков из цитоплазмы во внешнюю среду. Это необходимо: 1.Для построения клеточной стенки, жгутиков, ворсинок. 2.Прикрепления бактерий к клетки за счет ворсинок. 3.Патогенные бактерии выделяют в окружающую среду, либо в пространство клетки - эффекторные молекулы. У Гр(+) бактерий выделение идет в один этап. У Гр(-) – обнаружены системы секреции. 5 систем – они отличаются по строению и конечной локализации белка. 1 тип секреции – транспорт образовавшихся эффекторных молекул во внешнюю среду. В этой системе участвуют три белка: А. делают порины в ЦПМ Б. протягивают молекулу белка через периплазматическое пространство. В. делают поры в клеточной стенке – через которые белок выделяется во внешнюю среду. 2 тип секреции : Транспортировка осуществляется в два этапа: 1 этап – белок проникает в периплазматическое пространство и там остаются; 2 этап – некоторые белки через пору в клеточной стенки поступает во внешнюю среду. 3тип секреции : Принимают участие 20 белков. Белки первой группы образуют структуру напоминающую шприц. 2 группа белков протягивает эффекторную молекулу по этому каналу в клетку макроорганизма. 4 группа секреторные белки попадают непосредственно в цитозоль эукариотической клетки. Таким образом, секреция 3 типа доставляет факторы вирулентности непосредственно в клетку человека, вызывая нарушения ее жизнедеятельности. 4 система секреции – осуществляется особыми белками - автотранспортерами. Во внешнюю среду. ВОПРОС 6. ОСОБЕННОСТИ ДЫХАТЕЛЬНОГО АППАРАТА БАКТЕРИЙ. ТИПЫ О-В ПРОЦЕССОВ У БАК. КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ ПО ТИПУ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНЕРГИИ Для осуществления различных обменных процессов бактерии нуждаются в определенном количестве энергии, которую получают в ходе О-В процессов. Они протекают в дыхательном аппарате. Особенности дых аппарата бактерий: - бактерии лишены митохондрий, их функцию выполняет ЦПМ и ее инвагинации - мезосомы, на которых локализуются специальные дыхательные Еn ; - у бактерий могут быть значительные колебания в качественном и количественном составе ферментов, образующих дыхательную цепь; - у бактерий тонкие процессы регуляции дыхания затруднены, т.к. их дыхательный аппарат соприкасается как с внеш ср, так и с цитоплазмой. По типу дыхания или по типу получения Е микроорганизмы делятся на I. Аэробы-нуждаются в свободном О2. Облигатные (строгие) аэробы (NB, некоторые виды псевдомонад) не могут жить и размножаться в отсутствии молекулярного О2, т.к. используют его в качестве акцептора электронов. Молекулы АТФ образуются или при окислительном фосфорилировании с участием цитохромоксидаз, флавинзависимых оксидаз и дегидрогеназ. При этом, если конечным акцептором электронов является О2, выделяется значительное количество энергии. II. Анаэробы –получают энергию при отсутствии доступа О2 путем ускоренного, но не полного расщепления пит в-в. Облигатные анаэробы (NB, ВОЗБУДИТЕЛИ СТОЛБНЯКА, БОТУЛИЗМА) не переносят даже следов О2. Они могут образовывать АТФ в результате окисления УВов, белков, липидов путем субстратного фосфорилирования до пирувата. При этом выделяется сравнительно небольшое кол-во энергии. III. Факультативные анаэробы, могут расти и размножаться как в присутствии О2 воздуха, так и без. Они образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилировании. Различают 2 основных О-В процесса : на 2 группы в зависимости от хар-ра конечного акцептора водорода (Н). Ø ДЫХАНИЕ (окисление)- биологический процесс окисления различных органических в-в, при котором происходит перенос протонов и электронов от: -субстрата (донора) к кислороду (акцептору) и образование молекул АТФ. Ø БРОЖЕНИЕ (ферментация)- это метаболический процесс, при котором: происходит перенос протонов и электронов от субстрата(донора) к субстрату(акцептору). Если конечным акцептором водорода выступает кислород (может быть свободным и связанным), то этот тип носит название дыхание. Если органическое соединение - брожение. У всех перечисленных групп О-В процессы происходят в дыхательном аппарате. v Еn дегидрогеназы отщепляют водород от субстрата, передают его на НАД. НАД превращается в восстановленную форму, передает водород на НАДФ и затем на систему 2 ФАД. v Следующий этап – система цитохромов. Их функции – отщепление электрона от водорода и превращение водорода в протон. Этот окислительный процесс сопровождается выделением энергии. § Параллельно идет процесс окислительного фосфорилирования, в ходе кот выделенная энергия аккумулируется в макроэргических фосфатных связях типа АТФ. v Последнее звено ЦПЭ у аэробов – цитохромоксидаза, кот передает электрон на молекулярный О2 и активирует его: в результате он получает способность соединяться с протоном с образованием воды. Т.о. аэробные бактерии получают энергию путем дыхания, причем в качестве конечного акцептора водорода они требуют наличия молекулярного кислорода. Подавляющее большинство патогенных бактерий относится к ФАКУЛЬТАТИВНЫМ АНАЭРОБАМ. Они, в зависимости от условий внеш ср (наличие или отсутствие О2), могут получать энергию и путем дыхания, и путем брожения. !! ПОДОБНАЯ ГИБКОСТЬ ЭНЕРГОДАЮЩИХ ПРОЦЕССОВ характерна только для бактерий. ü Бактерии у которых отсутствует Еn цитохромоксидаза. В качестве конечного акцептора О2 могут использовать не свободные молекулы О2, а находящиеся в составе окисных соединений. ü ü Облигатно-анаэробные бактерии получают энергию только путем брожения. · У них отсутствует и система цитохромов, и цитохромоксидаза. · Окислительное фосфорилирование осуществляется на уровне субстрата. · В ряде случаев водород может передаваться системой флавиновых ферментов не на субстрат, а на молекулярный О2 с образованием Н2О2. У них отсутствует Еn каталаза, поэтому Н2О2 накапливается и оказывает на бактерии токсическое действие. Вопрос 7. Рост и размножение бактерий.Рост на питательный средах(фазы). Современные представления о колониях. Под ростом клетки понимают координированное воспроизведение клеточных компонентов и структур, ведущее в конечном итоге к увеличению массы клетки. Термином «размножение» обозначают увеличение числа клеток в популяции. Большинство прокариот размножаются поперечным делением, некоторые почкованием. Грибы размножаются путем спорообразования. При размножении микробной клетки наиболее важные процессы происходят в нуклеоиде, содержащем всю генетическую информацию в двунитевой молекуле ДНК. Репликация ДНК происходит полуконсервативным способом, обеспечивающим равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками. Надежность процесса репликации и правильность расхождения (сегрегация) дочерних цепей обеспечивается связью ДНК с цитоплазматической мембраной. Репликация начинается в определенной точке (локусе) ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлениях. Синтез дочерних нитей ДНК идет ступенчато, короткими фрагментами, которые сшиваются специальными ферментами лигазой. Когда бактерия готова к делению, то начинается процесс репликации. При этом начинается выработка фермента инициатора под действием которого раскручивается ДНК на две равноценные нити. Вторая нить прикрепляется на противоположном участке ЦПМ – прорепликон . Затем каждая нить достраивается. И после достройки прорепликон превращается в репликатор.Фермент инициатор освобождается для нового цикла. Спирали растягиваются к полюсам клетки. ЦПМ образует инвагинации – септальные мезосомы – за счет которых формируется клеточная стенки. Оставшаяся ЦПМ – лизируется соответственным ферментом клетки – аутолизанами ВЕСЬ процесс находится под строгим генетическим контролем. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ Для культивирования используют бактерий используют питательные среды. При культивировании изучаются культуральные свойства – характер роста бактерий на питательной среде. Выделяют несколько фаз развития бактерий в питательной среде. 1 фаза покоя – лаг. фаза – продолжительность 3-4 часа с момента внесения бактерий в свежую питательную среду. В эту фазу бактерии растут, адаптируются и готовятся к делению. 2 фаза интенсивного роста – логарифмического роста. ЕЕ продолжительность 6-8 часов - она характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток, и значительным увеличением числа клеток в популяции; 3 фаза – стационарная , она наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться – М-фаза – в эту фазу микробы начинают отмирать. Остальные делятся. Достигается наибольшая концентрация бактерий. В это время (время генерации между 2 делениями) является величиной постоянной. Для E.coli – 20мин. Для M. tuberculosis – 16, 18 часов. Это связано с тем, что наступает равновесие между числом в вновь образующихся и гибнущих клеток. Число живых бактериальных клеток в популяции на единицу объема питательной среды в стационарной фазе обозначается как М – концентрация. Этот показатель является характерным признаком для каждого вида бактерий. 4 фаза – фаза отмирания (логарифмической гибели), которая характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции. Прекращение роста численности (размножения) популяции, микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и или накопления в ней продуктов метаболизма микробных клеток. Поэтому удаляя продукты метаболизма или заменяя питательную среду, регулируя переход микробной популяции из стационарной фазы в фазу отмирания, можно создать открытую биологическую систему, стремящуюся к установлению динамического равновесия на определенном уровне развития популяции. Такой процесс выращивания микроорганизмов называется проточным культивированием. Для изучения метаболических процессов на протяжении цикла клеточного деления возможно также использовать синхронные культуры – это все члены популяции, которые находятся в одной фазе цикла. Некультивируемые формы бактерий У многих видов Гр(-) бактерий существует особое приспособительное, генетически регулируемое состояние, эквивалентное цистам, в которое они могут переходить под влиянием неблагоприятных условий и сохранять свою жизнеспособность до нескольких лет. Главная особенность такого состояния в том, что бактерии в нем не размножаются и не образуют колоний на питательной среде. Такие не размножающиеся, но жизнеспособные бактерии и называются некульвируемыми формами бактерий (НФБ). Клетки этих бактерий находятся в метаболически активном состоянии, они высокоустойчивы к воздействию условиям внешней среды. Для их обнаружения используют методы молекулярногенетического анализа (ДНК-гибридизацию, ПЦР). Колония – видимое невооруженным глазом скопление бактерий на плотной питательной среде; Культуральные свойства бактерий При росте на жидких питательных средах бактерии чаще всего вызывают равномерное помутнение, иногда — выпадение осадка: крошковатого (стрептококки), хлопьевидного (стрептобациллы), бульон при этом остается прозрачным. Некоторые бактерии образуют пленку на поверхности жидкой среды: сухую чешуйчато-бородавчатую (туберкулезная палочка), тонкую, нежную (холерный вибрион), рыхлую, с отходящими вниз отростками — «сталактитами» (возбудитель чумы) . Еще более разнообразен рост бактерий на плотных питательных средах. Образуемые при этом колонии различаются по многим признакам: размерам, форме, консистенции, структуре, прозрачности, цвету и др. Колонии бывают очень мелкими (0,1-0,5 мм), мелкими (0,5-3,0 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупными (более 5 мм в диаметре). Они могут быть круглыми (дисковидными); плоскими; иметь форму, напоминающую львиную гриву («голову Медузы»); ризоидными и т. п.. Края колонии могут быть гладкими, зазубренными, фестончатыми, изрезанными. Поверхность колонии бывает гладкая или шероховатая, влажная или сухая, ровная или складчатая, плоская или выпуклая, а ее консистенция — плотная, рыхлая, слизистая. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными, непрозрачными и различаться по другим признакам, например у некоторых бактерий центр мутный, а периферическая зона полупрозрачна. Все эти признаки, как правило, видоспецифичны, поэтому они имеют важное диагностическое значение, т. е. их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры. ВОПРОС 8. Бактериальная биопленка. Строение. “Quorum sensing” - механизмы. Биопленка - это высокоорганизованное сообщество бактерий, необратимо прикрепленных к субстрату и друг другу и защищенных пленкой. Образование биопленки объясняет социальное поведение в популяции. (у бактерий обнаружены вещества, которые аналогичны гормонам и цитокинам человека. Эти вещества обеспечивают межклеточное взаимодействие) Формирование биопленка: 1. Бактерии прикрепляются к поверхности. 2. Рост. 3. Во время роста продуцируют экзогенные полисахариды, которые образуют матрикс. 4. Покидают пленку. В организме человека бактерии нормальной микрофлоры находятся в составе биопленки. Биопленочные инфекции связаны с установкой катетера, проведением искусственной вентиляции легких, имплантацией искусственных клапанов сердца. “Quorum sensing” Внутри колонии клетки существуют в разной стадии (делящиеся, спонтаннообразующиеся, покоящиеся) . Особенности структуры колоний: 1. Имеются вертикальные слои клеток и горизонтально расположенные зоны. В колониях образуются микроскопические воздухоносные каналы, через которые поступают питательные вещества и выводятся продукты метаболизма - структуры для транспорта кислорода. 2. В колониях обнаружен бактериальный аппоптоз (запрограммированная гибель) и альтруизм. Аппоптоз начинается в максимальную стационарную фазу, когда истощаются питательные вещества, следовательно, часть клеток погибает и образуются продукты метаболизма, которые служат для питания другим клеткам. В 1994 году был предложен термин “Quorum sensing” - это многоклеточный механизм бактериального общения, предназначенный для контроля экспрессии генов, в зависимости от плотности бактериальной популяции. ключевым сигналом к запуску является увеличение плотности популяции. Описан ряд процессов, протекающих при высокой плотности: 1. Продукция экзоферментов и других факторов вирулентности; 2. Продукция антибиотиков; 3. Образование спор; 4. Образование биопленки. В реализации данного механизма принимают участие различные Механизмы: 1. Механизм непосредственного контакта клеток - передача информации. осуществляется за счет пили и других поверхностных структур. 2. Выработка бактериями диффундирующих химических агентов - химический способ общения. бактерии выделяют во внешнюю среду сигнальные молекулы. показано, что выработка сигнальных молекул начинается при определенной плотности популяции - М-фаза. эти сигнальные молекулы воспринимаются сенсорными молекулами, передают сигнал клеткам и связываются с рецепторами белка репрессора. следовательно, блокируют репрессор и нарушается связь рецептора с соответствующими генами, что запускает синтез соответствующего продукта. 3. Доказано, что между клетками в популяции действуют физические факторы дистантной коммуникации. под действием этих факторов культура одного вида посылает сигналы другому виду и другой вид начинает усиленно размножаться. Вопрос 9. Бактериологическое исследование. Основные биологические свойства бактерий, определяемых в ходе бактериологического исследования и методы их изучения. Бактериологическое исследование – это один из основных видов работы бактериологической лаборатории, ее цель – выделение из исследуемого материала чистой культуры и ее идентификация Этапы бактериологического исследования: 1. Первичная микроскопия исследуемого материала (необязательный этап), (поможет выбрать нужную питательную среду; дает ориентировочные представления о наличии в исследуемом материале микроогранизмов) 2. Первичный посев с целью выделения чистой культуры 3. Накопление чистой культуры 4. Изучение биологических свойств выделенной чистой культуры и ее окончательная идентификация 1 день исследования. Осуществляют 2 первых этапа. Первичная микроскопия обязательна для гнойного материала, но не микроскопируют кровь и фекалии). Выбор метода исследования зависит от задачи исследования. Если его проводят с целью выделения какого-то конкретного вида бактерий, то используют элективные среды. Если обнаружены разные виды возбудителей, то используют метод механического разобщения на поверхности твердой питательной среды. ПЕРВИЧНЫЙ ПОСЕВ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ТОЛЬКО НА ТВЕРДОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ!!! ИСКЛЮЧЕНИЕ – КРОВЬ. Кровь сеют в жидкую питательную среду. 2 день исследования. Задача 2 дня изучение культуральных свойств и накопить чистую культуру. Культуральные свойства – это характер роста на жидких и твердых средах, включая описания колоний на твердых средах. Изучение особенностей роста на чашках с МПА включает: 1. Общая характеристика роста – однородная или неоднородная, обильный или скудный рост. 2. Изучение выросших колоний – для это отбирают колонии и определяют МАКРОСКОПИЧЕСКИ: * ФОРМА * ВЕЛИЧИНА * ПРОЗРАЧНОСТЬ * ПОВЕРХНОСТЬ * ЦВЕТ МИКРОСКОПИЧЕСКИ: * КРАЯ * СТРУКТУРУ Из колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Списывают морфологию бактерий, образующих колонию. Во время взятия мазка определяют консистенцию колонии. При изучении колоний и микроскопии мазков из них обращают внимание на следующие детали: 1. Наличие капсулы. Для выявления капсул используют метод окраски по Бурри- Гинсу. 2. Наличие спор. Для выявления используют окраску по Клейну. Изучение колоний заканчивается пересевом на скошенный агар для накопление чистой культуры. 3 день исследования. 1. Описание роста на скошенном агаре. 2. Подтверждение чистоты накопленной культуры. Готовят мазки, окрашивают по Граму. Чистая культура подвергается дальнейшей идентификации до рода и вида на основании особенностей метаболизма – биохимическая идентификация и антигенного строения – серологическая идентификация. 3. Изучение биохимических свойств – это способность бактерий расщеплять те или иные субстраты за счет продукции соответствующих продуктов. Для изучение этих свойств используют дифференциально-диагностические среды, содержащие различные субстраты (пестрые ряды). Сахаролитические свойства – способность расщеплять углеводы и многоатомные спирты; изучают на средах Гисса. Протеолитические свойства – способность расщеплять белки. Изучают на посеве на желатин или лакмусовое молоко. Пептолитические свойства – способность расщеплять промежуточное продукты распада – пептоны. Их можно обнаружить с помощью индикаторной бумаги: лакмусовая – аммиак, смоченная щавелевоуксусной кислотой - индол, смоченная ацетатом свинца – для выявления сероводорода. 4 день исследования. 1. Учет результатов биохимических тестов. После обнаружение вида изучают признаки – чувствительность к антибиотикам, токсигенность и т д 2. Серологическая идентификация. Внутривидовая дифференциация – это определение принадлежности штамма к тому или ином фаговару, биовару, резистовару. Он позволяет выявить эпидемиологические связи между штаммами одного вида. 3. Окончательная идентификация выделенной культуры. 10. Санитарно-микробиологическое исследование воды, воздуха. Санитарная микробиология – наука, которая изучает микрофлору окружающей среды (воды, воздуха, почвы, предметов обихода), продуктов питания, лекарственных средств и ее влияние на здоровье человека. Одной из важнейших задач санитарно-микробиологического исследования объектов окружающей среды, пищевых продуктов, лекарственных средств является решение вопроса о наличии или отсутствии санитарно-показательных микроорганизмов как индикаторов загрязнения. На основании многочисленных исследований были сформулированы требования, которым должны отвечать санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ): Постоянно содержаться в выделениях человека и теплокровных животных и постоянно поступать в окружающую среду в большом количестве; Не иметь другого природного резервуара, кроме организма человека и животных (исключая пищевые продукты); После выделения в окружающую среду – сохранять жизнеспособность в течение сроков, близких к срокам выживания патогенных микроорганизмов, выводимых из организма теми же путями; Не размножаться интенсивно в окружающей среде; Незначительно изменять свои биологические свойства в окружающей среде; Быть достаточно типичными для своего вида (рода), с тем чтобы их идентификация осуществлялась без особого труда; Индикация, идентификация и количественный учет могут проводиться современными, простыми, легкодоступными и экономичными методами. II. Санитарная микробиология воды . Вода– естественная среда обитания разнообразных микроорганизмов. На качественный состав микрофлоры основное влияние оказывает происхождение воды и характер ее использования. Для каждого вида вод существуют определенные ГОСТы, по которым можно определить качество воды. Нас в первую очередь интересует питьевая вода. Микрофлора поверхности водоема может служить источником заболеваний, передающихся фекально-оральным, преимущественно водным путем (холера, брюшной тиф, лептоспироз, полиомиелит, гепатит А, Е, менингиты, вызываемые энтеровирусами). В соответствии с санитарными правилами и нормативами питьевая вода должна быть безопасна в эпидемиологическом отношении, что определяется соответствующими нормативами: Общее число микроорганизмов (ОМЧ) (КОЕ/мл); Для водопроводной воды- прямой посев1 мл на МПА, для воды открытых водоемов по 1 мл из серийных разведений (10-кратных) Общие колиформные бактерии (ОКБ) (КОЕ/100,0мл)- это аэробные и факультативно- анаэробные не образующие спор Гр(-) оксидозоотрицательные палочки, сбраживающие лактозу с образованием К и Г при температуре 37С в течение 24 – 48ч Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) (КОЕ/100,0мл)- это аэробные и факультативно-анаэробные не образующие спор Гр(-) оксидозоотрицательные палочки, сбраживающие лактозу с образованием К и Г при температуре 42С в течение 24 часов. Споры сульфитредуцирующих клостридий (КОЕ/20,0мл)-это анаэробные спорообразующие палочки, восстанавливающие сульфит натрия при росте на железосульфитном агаре при 44С (в течение 16-18 часов образуют колонии черного цвета). Колифаги (БОЕ/100,0мл). Санитарно-гигиенические показатели Нормативы качества воды Общее микробное число (ОМЧ) (КОЕ/мл) Не более 50 Общие колиформные бактерии (КОЕ/100,0мл) отсутствие Термотолерантные колиформные бактерии( КОЕ/100,0мл) отсутствие Споры сульфитредуцирующих клостридий (КОЕ/20,0мл) отсутствие Коли-индекс(количество КП в 1 л) не больше 3 Коли-титр (1 КП на минимальный объем воды) 300мл В воде находятся патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, которые являются возбудителями ряда инфекционных заболеваний: Летопсирозов; Туляремии; Гепатита А; Дизентерии; Брюшного тифа; Холеры. Методы посева: 1.Метод мембранных фильтров- воду фильтруют, далее фильтр помещают на среду Эндо, после 18-24 ч и Т=37 подсчитывают число красных колоний (ферментирующих лактозу) (опр. коли-титра/индекса) 2.Бродильный метод- разные объемы воды засевают на среду Эйкмана (с глюкозой и индикатором) – определяется бродильный титр –наименьший объем воды, содержащий газообразующие бактерии . После их идентификации, подсчитывают число КП и опр. коли- титр. При массовом поступлении ленивых, фекально-бытовых, промышленных сточных вод и в водоемах, и в почве начинает увеличиваться количество заносных микробов. В том числе и болезнетворных для организма. Хотя и вода, и почва не очень способствуют существованию такого рода микроорганизмов, многие из них определенное время способный выживать в столь неблагоприятных условиях. Это время в значительной степени определяется интенсивностью процессов самоочищения воды и почвы, а также таксономической принадлежностью самого микроорганизма, т.е. его биологическими свойствами, в первую очередь, способностью к спорообразованию, устойчивостью к высушиванию или солнечной радиации. Воздух – среда, самая неблагоприятная для размножения микроорганизмов, поскольку отсутствие питательны веществ и влаги, а также солнечные лучи обусловливают их быструю гибель. В достаточно прогретом и влажном воздухе находится гораздо больше микроорганизмов, чем в сухом и холодном. В воздухе закрытых помещений содержаться патогенные и условно-патогенные бактерии – представители нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей, а также вирусы и грибы, которые попадают в воздух в основном транзиторно в процессе жизнедеятельности человека и могут существовать в воздухе в течение времени, достаточного для инфицирования находящихся в помещении людей. Это возбудители воздушно-капельных инфекций: Коклюш; Скарлатина; Дифтерия; Туберкулез; Корь; Грипп; Парагрипп и др. Следовательно, загрязнение объектов окружающей среды условно-патогенными и патогенными микроорганизмами представляют серьезную эпидемиологическую опасность. Для воздуха ОМЧ – общее количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха – оценивается только в закрытых помещениях, а его максимально допустимый предел нормируется только для медицинских учреждений и спецпроизводств, для остальных – уровень поддержания обсемененности воздуха по ОМЧ только рекомендуется. Для оценки чистоты воздуха используют ряд показателей: 1. Органолептические. Органолептические свойства воздуха основных помещений ЛПУ (при применении 6-балыюй шкалы Райта) должны соответствовать следующим параметрам: оценке 0 (отсутствие запаха), воздух подсобных помещений - оценке 1 (едва заметный запах). 2. Химические. 1. Концентрация кислорода - 20-21%. 2. Концентрация углекислоты до 0,05% (очень чистый воздух), до 0,07% (воздух хорошей чистоты), до 0,17с (воздух удовлетворительной чистоты). 3. Концентрации химических веществ соответствуют ПДК для атмосферного воздуха. 4. Окисляемость воздуха (количество кислорода в мг, необходимых для окисления органических веществ в 1 м 3 воздуха): чистый воздух - до 6 мг/м 3 , умеренно загрязненный - до 10 мг/м 3 ; воздух плохо проветриваемых помещений - более 12 мг/м 3 3.Физические 1. Изменение температуры воздуха и относительной влажности. 2. Коэффициент униполярности - отношение концентрации тяжелых ионов. Чистый атмосферный воздух имеет коэффициент униполярности 1,1-1.3. При загрязнении воздуха коэффициент униполярности увеличивается. 3. Показателем электрического состояния воздуха является концентрация легких ионов (сумма отрицательных и положительных.) порядка 1000-3000 ионов в 1 см 3 воздуха (±500). 4. Бактериологические Методы посева: Седиментационный метод- оседание под действие силы тяжести определенного количества МО на определенную площадь среды за определенное время и и при опр. температуре. Аспирационный метод-протягивание определенного объема воздуха через поглотительные приборы (аппарат Кротова) над питательной средой(МПА). Для выявления стрептококков и стафилококков (опр. гемолитической и плазмокоагуляционной активности) используют кровяной агар. Вопрос 11.Нормальная микрофлора тела человека.Строение,состав,основные функции.Эпигеномика. НОРМАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА -рассматривается как совокупность множества микроорганизмов, характеризующихся определенным видовым составом и занимающих тот или иной биотоп в организме. В любом микробиоценозе различают: Постоянно встречающиеся виды микроорганизмов- автохтонная микрофлора (резидентная). Количество автохтонных видов относительно невелико, но численно они всегда представлены наиболее обильно. Аллохтонные, добавочные (транзиторные). Видовой состав транзиторных видов микроорганизмов разнообразен, но они немногочисленны. Строение нормальной микрофлоры Нормальная микрофлора рассматривается как самостоятельный экстракорпоральный орган. Это подтверждается следующими позициями: 1.Нормальная микрофлора имеет характерное анатомическое строение, как и любой орган организма. 2.Нормальная микрофлора выполняет присущие только ей функции 3.Нормальная микрофлора имеет свои собственные болезни. Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору, образуют четкую морфологическую структуру – биопленку, толщина которой колеблется от 0,1 до 0,5 мкм. Биопленка представлена полисахаридным каркасом, состоящим из микробных полисахаридов и муцина, который продуцируется клетками макроорганизма. В структуре каркаса находятся микроколонии бактерий, которые могут располагаться в несколько слоев. Например, в биопленке покрывающей кожу, микроколонии располагаются в 1-2 слоя, а в биопленке толстого кишечника – в 500-1000 слоев. Образование биопленки лежит в основе выживания бактерий в окружающей среде, так как в составе биопленки они защищены от антибактериального воздействия. Многие хронические инфекции, возникшие при протезировании или имплатировании искусственных клапанов сердца, обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок, возникающих на поверхности этих устройств. Среди возбудителей, образующих биопленки, наибольшее клиническое значение имеют P.aeruginosa, S.aureus, K. pneumoniae, Coagulasae – negative staphylococcus(CNS), Enterococcus spp., Candida spp. Функции нормальной микрофлоры Защита от экзогенной инфекции и контроль за собственным микробным гомеостазом – это функция колонизационной резистентности . Способность нормальной микрофлоры защищать поверхность слизистых оболочек и кожи от патогенных бактерий – мощный механизм противомикробной резистентности. Нормальная микрофлора – мощный иммуномодулятор. Она поддерживает иммунокомпетентные клетки в состоянии «постоянной готовности» праймирования (субактивации), что обеспечивает более быстрый и эффективный ответ на инфекцию. Нормальная микрофлора принимает участие в метаболических процессах за счет продукции большого количества ферментов, и образования метаболитов. Нормальная микрофлора – неограниченный банк генетического материала. Между представителями нормальной микрофлоры постоянно происходит обмен генетического материала, а так же его передача патогенным видам, попадающим в ту или иную экологическую нишу. Нормальная микрофлора обладает детоксикационными свойствами как в отношении органов, попавших из внешней среды, так и в отношении эндогенной флоры, образующей токсические продукты метаболизма. Нормальная микрофлора участвует в регуляции газового, водно-солевого обмена, поддерживает рН – среды. Синтезирует витамины, в том числе биотин, рибофлавин, пантотеновую кислоту, витамины К, Е, В 12, фолиевую кислоту. Морфокинетическая роль – принимает участие в развитии различных органов и систем организма. Эпигеномика – это учение о наследственных изменениях в фенотипе, в экспрессии генов и посттрансляционных процессах генной продукции, не связанных с изменением в порядке расположения нуклеиновых последовательностей в ДНК. В отличие от мутаций эпигеномные изменения возникают в результате биохимических реакций между ДНК, гистонами, продуцентами микробной клетки. Эти реакции разнообразны: метилирование; ацетилирование; фосфолипирование. Они не приводят к изменению структурной последовательности ДНК. То есть изменения фенотипических признаков может быть результатом вариаций структурной организации хроматина, определяющей активное или неактивное состояние генов, без изменения их нуклеотидных последовательностей – ЭПИМУТАЦИИ. Основная роль в эпимутациях принадлежит низкомолекулярным продуктам, продуцируемых нормальной микрофлорой – метабиотики. (Самые различные короткоцепочечные жирные кислоты: пропионовая, масляная, уксусная. ) Вопрос 12. Понятие Дисбактериоз, методы изучения. Препараты для коррекции. Дисбактериоз – любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормофлоры человека, возникает в результатете воздействия на макро и или микрооорганизм различных факторов экзо- и эндогенного хар-ра или являющиеся следствием каких-либо патогенныхих процессов в организме. Показатели дисбактериоза: 1.Снижение численности одного или нескольких постоянных видов. 2.Потеря бактериями тех или иных признаков или приобретение новых. 3.Повышение численности добавочных или транзиторных видов. 4.Появление новых, не свойственных данному биотипу видов. 5.Ослабление антагонистической активности нормальной микрофлоры. Причины развития дисбактериоза - нерациональная антибиотикотерапия; -длительная гормонотерапия или лечение нестероидными противовосп-ми препаратами; - оперативные вмешательства; - стрессорные воздействия; - воздействие радиации, облучения; - воздействие хим-их в-в; - нерациональное питание; - острые и хронические заболевание (дизентерия, сахарный диабет). - иммуносупрессивная терапия при трансплантации; - применение ряда ср-в, кот изменяя моторику слизистых нарушают образование муцина 1. наркологических, 2. местных анестезирующих, 3. рвотных, 4. слабительных, 5. отхаркивающих, 6. желчегонных и др Клинические проявления дисбактериоза. Дисбактериоз различных биотопов имеет различные клин-ие проявления: 1.Дисбактериоз кишечника может проявляться в виде o диареи, o неспецифического колита, o синдрома малой сорбции, o дуоденита, o язвенной болезни желудка, o гастрита, гастроэнтерита. 2.Дисбактериоз органов дыхания чаще протекает в форме нарушений со стороны дыхательных путей o бронхитов, o бронхиолитов, o хронических заболеваний легких, o пневмоний 3. дисбактериоз ротовой полости – o гингивиты, o парадонтиты, o стоматиты, o кариес. 4.Дисбактериоз мочеполовой системы женщин -вагиноз. У мужчин и женщин уретрит, цистит 5.С нарушением состава и функций нормальной микрофлоры связывают ЭТИОПАТОГЕНЕЗ ряда таких клинических синдромов и состояний как: 1. нарушение свертываемости крови, 2. юношеская гипертоническая болезнь, 3. возникновение опухолей из-за нарушения стероидного обмена, 4. мочекаменная болезнь, 5. нарушение менструального цикла, 6. развитие атопических дерматитов, 7. развитие аллергических заболеваний. Фазы дисбактериоза в зависимости от степени выраженности клин-их проявлений -Компенсированная -латентная, когда дисбактериоз не сопровождается какими - либо клиническими проявлениями. Снижение коллич-ва 1 из представителей индигенной микрофлоры без изменения других составляющих биоценоза. - Субкомпенсированные, когда в результате дисбаланса нормальной микрофлоры образуются локальные воспалительные процессы. Снижение количества или элиминация отдельных представителей индигенной микрофлоры и увеличениеие содержания транзиторной условно- патогенной микрофлоры. - Декомпенсированный, при которой в результате нарушения проницаемости клеточной стенки происходит генерализация процесса с возникновением метастатических воспалительных очагов. Диагноз дисбактериоза устанавливается повторным (с интервалом в 5-7 дней) бактериологическим исследованием с обязательной количественной оценкой результатов определения видов и вариантов обнаруживаемых микроорганизмов, входящих в состав обследуемого биоценоза. Диагностика основана на количественном бактериологическом исследовании материала, взятого из того или иного биотопа. Наличие дисбиоза определяется изменениями состава нормальной микрофлоры, а его выраженность степенью этих изменений. Показатели дисбактериоза. 1. уменьшение общего количества бактерий нормальной микрофлоры; 2. появление или увеличение числа редко встречающихся в нормемикроорганизмов; 3. изменение биохимических свойств штаммов нормальной микрофлоры иприобретение ими некоторых факторов вирулентности; 4. ослабление антагонистической активности нормальной микрофлоры. Также можно использовать молекулярно-генетические методы и МАСС-спектрометрии, методы обнаружения необычных продуктов метаболизма (хроматографияспектра жирных кислот). Лечение дисбактериозовдолжно быть комплексным и направленным восновном на устранение причин дисбактериоза и восстановление нормальноймикрофлоры. При дисбактериозе кишечника проводится коррекция составамикрофлоры с помощью эубиотиков - препаратов, содержащихлиофилизированные живые штаммы микроорганизмов - представителей егонормальной микрофлоры: бифидумбактерин, колибактерин, комбинированный препарат бификол, эубактерин, лактобактерин, бактисубтил (Bacillus subtilis), энтерол (Saccharomyces boulardii - сахаромицеты боуларди). В настоящее время в целях обеспечения функционального питания ипрофилактики дисбактериозов живые культуры бифидумбактерий,лактобактерий часто добавляют в продукты питания, чаще кисломолочные, итогда такие препараты живых микроорганизмов - представителей нормальноймикрофлоры человека называют пробиотики(эубиотики). Пробиотики-лиофилизированные живые штаммы микроорганизмов - представителей его нормальной микрофлоры Пребиотики- стимулирует рост нормальной МФ Симбиотики- 2 и более живых штаммов Комбинированные- с добавление витаминов Симбиотики- пре+про Метабиотики- изготовлены из продуктов метаболизма собственной микрофлоры. 13.Ядерный аппарат бактерий, его особенности. Плазмиды бактерий. Бактериоцины-лечебные и профилактичсекие препараты ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА БАКТЕРИЙ: а) ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ: 1. наследственный аппарат бактерий представлен нуклеоидом; 2. в отличие от ядра нуклеид не имеет ядерной мембраны; 3. в нуклеиде нет ядрышек; 4. в нуклеиде одна хромосома; 5. в бактериальной клетке может быть дополнительное наследственное вещество – плазмида; 6. молекула ДНК хромосомы и плазмиды прикрепляются к ЦПМ. б) МОЛЕКУЛЯРНЫЕ: 1. хромосома бактерий имеет кольцевую структуру; 2. хромосома бактерий – чистая двунитчатая ДНК, не содержит гистонов; 3. в ДНК бактерий повышенное содержание метиллированных (минорных) азотистых оснований, они выполняют защитную функцию гистонов; 4. ДНК бактерий содержит is-последовательности, строение которых аналогично таким же участкам ДНК у высших организмов; 5. отмечается выраженная изменчивость нуклеотидного состава: соотношение гуанина и цитозина (Г/Ц – индекс) у бактерий имеет видовые отличия. Важное место в генетике бактерий занимают плазмиды – дополнительные, внехромосомные элементы наследственности. Плазмида, как и хромосома, представлена кольцевой молекулой двунитчатой ДНК, но ее размеры значительно меньше хромосомы. Плазмида содержит структурные гены, кодирующие тот или иной признак, гены автономной репликации, is-последовательности. У некоторых плазмид есть гены, ответственные за ее трансмиссивность (перенос, передачу). Такие плазмиды называют трансмиссивными (конъюгативными). Основные свойства плазмид: 1. гены плазмид несут не обязательную для клетки информацию, а лишь сообщают ей селективные преимущества; без плазмид клетка существовать может, а без хромосомы нет; 2. плазмидная ДНК имеет значительно меньшую молекулярную массу, чем хромосомная; 3. плазмиды способны к автономной репликации или их репликация находится под ослабленным контролем хромосомы; 4. для плазмид с низкой молекулярной массой характерно явление амплификации (многокопийности); 5. некоторые плазмиды (F, R-факторы) способны находиться как в автономии, штаммы, у которых F- фактор интегрирован с хромосомой, Hfr-штаммы; 6. молекула ДНК плазмид более подвержена воздействию физических и химических агентов, чем хромосомы; частота плазмидных мутаций выше, чем хромосомных; 7. некоторые физические В(УФ, СВЧ и др.) и химические (акридиловые красители) агенты вызывают элиминацию (удаление, потеря) плазмид; 8. плазмиды могут содержать tra-гены и самостоятельно передаваться в процессе конъюгации, это конъюгативные плазмиды; частота передачи плазмидных генов выше, чем хромосомных; трансмиссивность (передача, перенос) плазмид может быть связана и с переносом их в клетки умеренными трансдуцирующими фагами; 9. в клетке могут находиться несколько разных плазмид, но некоторые плазмиды несовместимы между собой; по этому признаку различают группы несовметимости плазмид. Плазмиды могут детерминировать разные свойства бактерий. Различают: 1. R-плазмиды – кодируют лекарственную устойчивость; 2. F-плазмида – определяет пол бактерий; 3. Col-плазмиды – детерминируют синтез бактериоцинов; 4. Hly-плазмиды – кодируют синтез гемоливинов; 5. Ent-плазмида – детерминирует синтез энтеротоксина; 6. Плазмиды биодеградации – обуславливают расщепление сложных ароматических и других соединений, например, нефти, парафина, ПЛВ и др. Бактериоцины — большое семейство секретируемых бактериями пептидов, обладающих антимикробной активностью и действующих против других штаммов того же вида или близкородственных видов [6]. Бактериоцины синтезируют почти все известные бактерии. Механизм. Учитывая большое разнообразие химического строения бактериоцинов, можно предположить, что они воздействуют на жизненно важные функции чувствительных клеток, но большинство действуют, образуя в мембране поры или каналы, способствующие нарушению мембранного потенциала чувствительных клеток. Бактериоцины обладают рядом преимуществ, позволяющим заявить — они являются жизнеспособной альтернативой антибиотикам : антимикробная активность (как определено in vitro и in vivo); низкая токсичность; широкий и узкий спектр действия разных пептидов; возможность производства in situ (с лат. — «на месте») пробиотиками; возможность создания на их основе биоинженерных конструкций. Можно сказать о том, что, вероятно, в скором будущем появятся новые способы борьбы с инфекционными бактериальными заболеваниями в случае успешного изучения особенностей функционирования бактериоцинов, что станет достойной альтернативой антибиотикам. Вопрос 14. Мобильные генетические элементы бактерий В состав бактериального генома входят подвижные генетические элементы IS – последовательности – это участки ДНК, способные перемещаться из одного участка репликона в другой, а так же между репликонами. Они содержат 2 гена : – 1 ген – кодирует синтез фермента – транспозазу, которая обеспечивает процесс исключения IS элемента из хромосомы и его интеграцию в новый локус. Отличительной особенностью IS элементов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повторов. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза. - 2 ген – кодирует синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения. ТРАНСПОЗОНЫ – это те же IS– последовательности, только еще имеют 1 или два структурных гена, а следовательно, несут генетическую информацию. Например гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическими биологическими свойствами, например, токсичностью. (коротко- is+ стр.гены) Помимо плазмид и подвижных генетических элементов у бактерий существует еще одна система, способствующая распространению генов - система ИНТЕГРОНОВ. Интегроны обеспечивают горизонтальный перенос генов, захватывают чужеродную ДНК, так распространяется АБ- резистентности. 15 . Механизмы изменчивости бактерий. Рекомбинации у бактерий, их особенности. Различают два вида изменчивости: фенотипическую и генотипическую. 1. Фенотипическая изменчивость – появление тех или иных признаков под влиянием условий внешней среды. Она не затрагивает генотип. К этому виду изменчивости относятся МОДИФИКАЦИИ. Модификации не передаются по наследству и с течением времени затухают, то есть возвращаются к исходному фенотипу через большое число поколений – длительные модификации или меньшее число поколений – кратковременные модификации. 2. Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В ее основе лежат мутации и рекомбинации. МУТАЦИИ бактерий – это изменения в последовательности отдельных нуклеотидов ДНК. По протяженности изменений повреждения ДНК различают мутации: точечные, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов и протяженные или абберации, в этом случае могут наблюдаться: - выпадения нескольких пар нуклеотидов, которые называются делецией; - добавление нуклеотидных пар – дупликации; - перемещение фрагментов хромосомы – транслокации; - перестановки нуклеотидных пар – инверсии. Мутации могут быть спонтанными, то есть возникающими самопроизвольно и индуцированные. РЕКОМБИНАЦИИ Особенности рекомбинаций у бактерий: 1. У них отсутствует мейоз и образуется не зигота, а мерозигота. 2. Всегда направлены от донора к реципиенту. 3. Рекомбинанты содержат всю генетическую информацию реципиента и плюс |