Бактериальной клетки. Основные морфологические формы бактерий и методы их изучения. Принципы классификации бактерий по Берджи
 Скачать 3.01 Mb.
|
|
Провирус – вирусы встраивают свой генетический материал в хромосому клетки хозяина. Образовавшаяся структура – провирус – реплицируется вместе с клеточной хромосомой в процессе деления и переходит в дочерние клетки. Строение вирусов. Вирусы могут иметь различные морфологические формы: сферическую, палочковидную, пулевидную, нитевидную, булавовидную. Размер их варьирует от 20–25 до 350–400 нм. Основной компонент вириона – капсид – белковая оболочка, которая покрывает расположенную внутри НК. Комплекс НК (геном) + капсид образует нуклеокапсид. Капсид состоит из отдельных белков капсомеров. Все представители царства Vira имеют разнообразную форму и размеры, которые колеблются диапазоне от 20нм (у самых маленьких пикорнавирусов до) до 400нм (крупных поксвирусов). Они могут иметь сферическую, многогранную, палочковидную, пулевидную, нитевидную, булавовиднуюформы. Различают просто устроенные (простые, безоболочечные вирусы) и сложно устроенные (оболочечные вирусы). У тех и у других в центре находится молекула нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), окруженная белковой оболочкой капсидом. Вся такая структура называется нуклеокапсид. У сложных вирусов нуклеокапсид является сердцевиной вириона, поверх которой расположен суперкапсид, это наружняя оболочка, которая является модифицированной мембраной клеточного происхождения, в «которую вирион одевается при выходе из клетки путем «почкования». В двойной липидный слой мембраны встроены вирусоспецифические поверхностные белки- гликопротеины, расположенные трансмембранно и выступающие наружу в виде шипиков. Это гликопротеины – гемагглютинин и нейраминидаза, белки слияния и другие, ответственные за прикрепление вириона к рецепторам клетки и проникновение в клетку. Они обладают антигенными свойствами. У многих сложных вирусов к суперкапсиду изнутри прилегает слой матриксного белка ( М- слой). Вирусные НК. Отличительной особенностью вирусов является один тип НК. 1.Обычно вирусные ДНК бывают двунитевые, редко однонитевые: линейные с незамкнутыми концами; линейные с замкнутыми концами; циркуляторные (кольцевидные); циркуляторнозамкнутые с одной неполной цепью ДНК. 2. Вирусные РНК, как правило, однонитевые, редко могут быть и двунитевые с фрагментированным геномом: цельные линейные; фрагментированные (сегментированные) линейные; кольцевые сегментированные. Геномная минус-РНК выполняет только геномную функцию, то есть служит матрицей для синтеза как геномной, так и и-РНК. Вирусные белки. Вирусные белки делят на две группы: 1-я группа – структурные белки (VP) – белки данной группы входят в состав вириона, это: – капсидные белки, их функция – формировать капсид; – поверхностные белки суперкапсидной оболочки – гликопротеины, их основная функция заключается в прикреплении вириона к клеточному рецептору и внедрению в клетку; они определяют антигенную изменчивость вируса; – матриксные белки сложных вирусов (М-слой), их основная функция – участие в заключительном этапе самосборки вириона. Внутренние белки: – внутренние геномные белки (связанные с НК вируса); – ферменты, участвующие в процессах репродукции. 2-я группа – неструктурные белки (NS) – образуются внутри инфицированной клетки, не входят в состав вириона. Их функция – обеспечение процесса репродукции. – вирусиндуцированные ферменты, которые участвуют в процессах транскрипции и трансляции вирусного генома; – регуляторные белки; Белки вируса выполняют следующие функции: – защитную – защищает НК вируса от различных воздействий; – адресную – на поверхности клетки расположены рецепторы, которые комплементарны прикрепительным белкам вириона, что способствует адсорбции вириона на нужной клетке; – регулирующую, эту функцию выполняют внутриклеточные белки вирусов, белки полимеразного ферментного комплекса, которые содержатся в сердцевине вириона. Липиды. Липиды можно обнаружить только у сложных вирусов (редко – у простых). Основным местом их локализации является суперкапсидная оболочка вируса. Основные функции: – определяют конформацию суперкапсидной оболочки (скелет суперкапсида); – защитная – защищают НК от внешних воздействий. Углеводы. Входят в суперкапсидную оболочку сложных вирусов, а именно в состав вирусных поверхностных белков. Удаление гликопротеинов у сложноустроенных вирусов ведет к потере способности адсорбироваться на чувствительных клетках. Систематика: Представители царства Vira по типу нуклеиновой кислоты делится на 2 подцарства - рибовирусы и дезоксирибовирусы. В подцарствах выделяют семейства, рода и виды. Принадлежность вирусов к тому или иному семейству (всего их 19) определяется строением и структурой нуклеиновой кислоты, типом симметрии нуклеокапсида, наличием суперкапсидной оболочки. Принадлежность к тому или иному роду и виду связано с другими биологическими свойствами вирусов: размер вирионов, способность размножаться в культурах ткани и курином эмбрионе, характер изменений, происходящих в клетках под воздействием вирусов, антигенные свойства, пути передачи, круг восприимчивых хозяев. Вирусы - возбудители болезней человека относятся к 6 семействам ДНК-овых и 13 семействам РНК-овых вирусов. Краткая характеристика этих семейств приведена в таблицах Прионы Прионы – это инфекционные белки ( сиалогликопротеиды) PrP sc, которые являются видоизмененными клеточными белками PrPc , преобразовавшимися вследствие мутаций. В норме белки PrPc находятся в наружных мембранах клеток организма, их особенно много в нейронах. Эти белки принимают участие в межклеточном узнавании, их функции не выяснены до конца. Патологические PrP sc, отличаются от нормальных изменением пространственной конфигурации ( третичной и четвертичной) , т.е. являются их изомерами. Проникнув в нейрон или глиальную клетку, молекула приона PrP sc контактирует с молекулой нормального белка PrPc и изменяет его конфигурацию, передавая ему свое патогенное состояние. Таким образом, нормальный белок превращается в патологический прион. Этот процесс нарастает в геометрической прогрессии. Патологические прионные белки устойчивы к действию клеточных протеаз, нечувствительны к интерферону. Они накапливаются в большом количестве, поражая все новые клетки, вызывая дегенерацию, вакуолизацию и массовую гибель нейронов. Развивается губчатая энцефалопатия мозга, часто с образованием амилоидных бляшек. Виройды: Виро́иды (англ. Viroids) — инфекционные агенты, состоящие только из кольцевой РНК. Они вызывают различные болезни растений, в том числе веретеновидность клубней картофеля, экзокортис цитрусовых[en] и карликовость хризантемы. По оценкам учёных, более трети вирусных заболеваний растений вызываются вироидами[3]. Вироиды представляют собой ковалентно замкнутые кольцевые одноцепочечные молекулы РНК (оцРНК) длиной от 246 до 467 нуклеотидов[4] (для сравнения: геном мельчайшего из известных вирусов составляет 2000 нуклеотидов в длину[3]). В отличие от вирусов, вироиды лишены белковой оболочки (капсида). Обычно кольцевая РНК вироидов существует в виде палочковидной формы из- за спаривания азотистых оснований внутри цепи, в результате чего образуются двухцепочечные участки с одноцепочечными петлями. Некоторые вироиды находятся в ядрышке инфицированной клетки, где может присутствовать от 200 до 100 000 копий генома вироида. Другие вироиды располагаются в хлоропластах. РНК вироидов не кодирует каких-либо белков, поэтому вироиды не могут реплицироваться сами по себе. Предполагается, что для этих целей они используют ДНК-зависимую РНК-полимеразу хозяйской клетки — фермент, который обычно используется для синтеза РНК на матрице ДНК. Однако в инфицированной вироидом клетке этот фермент использует РНК вироида, а не ДНК клетки-хозяина, как матрицу для синтеза РНК. Эта молекула РНК, комплементарная геному вироида, используется как матрица для синтеза новых РНК вироида[5]. 27. Методы диагностики вирусных инфекций Современная вирусология располагает широким набором методов диагностики вирусных инфекций. Это: Вирусоскопическое исследование; Вирусологическое исследование; Методы серодиагностики; Методы Иммуноиндикации; Молекулярно-генетические методы. Выбор метода лабораторной диагностики определяется характером заболевания, периодом болезни и возможностями лаборатории. 1. Вирусоскопическое исследование. Целью его является обнаружение при микроскопии исследуемого материала внутриклеточных включений, а в отдельных случаях при электронной микроскопии - вирионов. Обнаружение включений Бабеша-Негри при оптической микроскопии патологического материала применяется, например, для диагностики бешенства. Для диагностики ротавирусной инфекции используют электронную микроскопию фекалий, при которой можно обнаружить типичные по морфологии вирионы. 2. Вирусологическое исследование. Целью его является выделение вирусов и их идентификация. Этот метод является наиболее достоверным для доказательства этиологической природы заболевания. Вирусологическое исследование наиболее информативно. Однако, необходимо помнить, что само по себе выделение вируса из организма даже больного человека не всегда может свидетельствовать о его этиологической роли. Только при тщательном сопоставлении с данными клиники, эпидемиологического анамнеза, результатами серологических реакций результаты вирусологического исследования приобретают соответствующее значение. Это положение приобретает особенно большое значение в связи сналичием большого числа латентных и персистирующих вирусов. Алгоритм вирусологического исследования. I. Выделение вируса с помощью различных методов культивирования. II. Идентификация вируса до уровня: семейства, вида, внутривидовая. I. Выделение вируса. Для выделения вируса от больных могут быть использованы разные методы культивирования. 1. Культивирование в организме восприимчивых животных. 2. Культивирование в развивающихся куриных эмбрионах. 3. Культивирование в культуре ткани Наибольшее распространение получили первично-трипсинизированные культуры эпителиальной и соединительной тканей, клетки которых в виде монослоя прикрепляются к стенкам пробирок. Для поддержания жизнедеятельности клеток культуры ткани используют специальные питательные среды, содержащие полный набор веществ необходимых для роста клеток. Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из эмбриональных тканей человека, кур, мышей. Эмбриональные ткани обладаютбольшой потенцией к росту. Перевиваемые культуры представляют собой штаммы клеток злокачественных опухолей (Hela, Нер-1, Нер-2, Детроит-6). Их рост поддерживается в лабораториях путем последовательных пассажей. О размножении вируса в культуре ткани судят по следующим критериям. 1. Цитопатическое действие. Оно выражается в различных изменениях морфологии клеток, пикнозе ядер, образовании симпластов (гигантских многоядерных клеток), полной деструкции монослоя. 2. Внутриклеточные включения. Вирусы в зараженных клетках могут вызывать образование внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме или ядре пораженных клеток. 3. Метод цветной пробы. Клетки культуры ткани культивируют в питательной среде с индикатором. При росте незараженных клеток они образуют кислые продукты метаболизма, и индикатор меняет цвет питательной среды. Репродукция вируса в клетках культуры ткани нарушает метаболизм клеток, кислых продуктов не образуется, и цвет среды не изменяется. 4. Феномен гемадсорбции. На поверхности клеток, зараженных вирусами, синтезирующими гемагглютинин, экспрессируются значительные его количества, и эти клетки приобретают способность адсорбировать эритроциты. 5. Феномен гемагглютинации. При размножении в культуре ткани гемагглютинирующих вирусов культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретает способность агглютинировать эритроциты. 6. Бляшки под агаром. На газоне однослойной культуры ткани, залитой агаром, формируются негативные колонии. II. Идентификация выделенных вирусов. Первичную идентификацию вируса до уровня семейства можно провести с помощью набора следующих тестов: Определение типа НК - проба с бромдезоксиуридином; Определение наличия суперкапсидной оболочки - проба с эфиром; Определение размеров вирионов - фильтрование через фильтры с диаметром пор 50 и 100 нм; Синтез гемагглютинина - реакция гемагглютинации. Оценку результатов проводят путем заражения культуры ткани пробой, подвергнутой соответствующей (1, 2, 3) обработке, с последующим учетом результатов заражения по цветной пробе. Идентификация вируса до вида, внутривидовая идентификация может быть проведена разными методами. Чаще всего для этого используют реакцию вируснейтрализации с соответствующими иммунными противовирусными сыворотками. После обработки такими сыворотками вирусы теряют свою биологическую активность (нейтрализуются). Об этом судят по: результатам РТГА; цветной пробе; отсутствию цитопатического действия; выживаемости чувствительных животных; отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов. Для идентификации выделенных от больного вирусов могут быть использованы методы молекулярной гибридизации (МГ). 3. Серодиагностика. Серодиагностика вирусных инфекций используется для обнаружения в сыворотке обследуемого АТ и нарастания их титра. Для этого используют различные реакции иммунитета, чаще всего это РСК, ИФА, РТГА. Реакции ставят с известными вирусными диагностикумами. Обязательно исследование парных сывороток для выявления нарастания титра инфекционных антител. 4. Иммуноиндикация. Для иммуноиндикации вирусных антигенов в патологическом материале используют различные варианты реакций иммунитета 2 и 3 поколений (РПГА, РИФ, ИФА, РТПГА и др.). Известным компонентом реакций являются иммунные противовирусные сыворотки. 5. Молекулярно-генетические методы. Эти методы широко используют как для диагностики вирусных инфекций, так и для анализа вирусных ДНК и РНК и их взаимодействий. В первую очередь МГМ применяются для выявления персистирующих вирусов, находящихся в клиническом материале, которые с трудом или вообще не обнаруживаются другими методами. Эти методы достаточно просты и позволяют быстро обнаруживать НК или ее фрагменты. Существует две разновидности МГМов - ДНК-зондирование (ДНК- гибридизация) и ПЦР. Метод ДНК-гибридизации основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для этой второй нити используют лабораторно приготовленные фрагменты молекулы ДНК, гомологичные фрагментам ДНК искомых вирусов. Их называют ДНК-зонды. Медицинская промышленность выпускает различные типы ДНК-зондов. Для регистрации включения зонда в ДНК вируса, если она присутствует в исследуемом материале, зонд метят либо радиактивной, либо ферментной меткой. В последнем варианте при добавлении субстрата возникает окраска,видимая невооруженным глазом. В основе ПЦР лежит способность молекул НК и ее фрагментов при определенных условиях нарабатывать неограниченное число копий, чтопозволяет существенно облегчить их выявление. 28. Типы взаимодействия вируса с клеткой. Продуктивная вирусная инфекция. Выделяют следующие типы взаимодействия вируса и клетки. Продуктивная вирусная инфекция. При таком типе взаимодействия вируса с клеткой происходит репродукция вируса, а клетка-хозяин погибает. Продуктивная инфекция лежит в основе острых вирусных заболеваний. Абортивная вирусная инфекция. При таком типе взаимодействия репродукция вируса нарушается (не происходит), при этом клетка избавляется от вируса, не нарушая своих функций. Латентная вирусная инфекция. При таком типе взаимодействия происходит репродукция вируса, но клетка не погибает и сохраняет свою жизнеспособность. В ней происходит синтез и вирусных и клеточных компонентов. При этом синтез клеточных компонентов преобладает, и поэтому клетка способна долго сохранять свои свойства. Данный механизм лежит в основе безусловных латентных вирусных инфекций. Условные латентные вирусные инфекции. При таком типе взаимодействия вируса с клеткой погибают не все клетки пораженного органа, а только их часть. Остальные неповрежденные клетки этого органа компенсируют некоторую утрату его функций, вследствие чего заболевание некоторое время не проявляется, пока не наступит декомпенсация. Вирус-индуцированная трансформация. Это такой тип взаимодействия вируса с клеткой, при котором клетки, пораженные вирусом, приобретают новые, ранее не присущие им свойства. При этом геном вируса (или его часть) встраивается в геном клетки. Такой интегрированный в хромосому клетки-хозяина вирусный геном называется провирусом. Продуктивная вирусная инфекция Основные этапы продуктивной вирусной инфекции: 1. Адсорбция вируса на поверхности клетки. 2. Проникновение вируса в клетку. 3. Депротеинизация вириона. 4. Экспрессия вирусного генома. 5. Морфогенез. 6. Выход вирионов из клетки. Первый, второй и третий этапы лежат в основе подготовки вируса к процессам репродукции, в которых в соответствии с программой, заложенной в геноме вируса, происходят процессы воспроизведения нового поколения вирусов и выхода вирусов из клетки. 1-й этап – адсорбция вируса на поверхности клетки. На данном этапе адсорбция носит неспецифический характер, она обусловлена илой ионного притяжения между вирусом и клеткой. Следующая фаза – специфическая, осуществляется за счет специфических рецепторов клетки и прикрепительных белков на поверхности вируса – у простых вирусов и белков гликопротеинов – у сложных вирусов. |