Билет 1 Вопрос Строение бактериальной клетки
 Скачать 3.25 Mb.
|
|
Билет 32. вопрос 1. простые и сложные методы окрасок, все про них Выделяют простые и сложные методы окраски. Простыми методами окрашивания называют окрашивание пре- паратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты) плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями. Техника приготовления препарата заключается в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой. Присложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.). Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы. Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка (мазок) слишком толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом. Сущность метода. На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет. Этапы дифференцированного окрашивания по Граму: Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги (1,5 х 1,5 см) и на него до полного смачивания наносят карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллический фиолетовый (чаще используют модификацию Синева). Окрашивание проводят на протяжении 1–2 мин. Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на препарат раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка. Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом. Для этого препарат 2–3 раза помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек (время обесцвечивания – не более 30 с), либо наливают 2–4 капли спирта на мазок на 30–45 с. Препарат быстро промывают водой (как описано выше). Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1–2 мин водным раствором фуксина (фуксин Пфейффера). Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. микроскопируют с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый. Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при помощи светового микроскопа трудно. Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавленной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК. Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде плотных тел с неправильными очертаниями, расположенные в центре или на полюсах клетки. Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности микобактерий и нокардий. Принцип метода. Кислотоустойчивость этих бактерий связана с высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются карболовым фуксином Циля при нагревании препарата в красный цвет и сохраняют эту окраску после обесцвечивания серной кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотой и в последующем докрашиваются метиленовым синим в синий цвет. Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить метод Бурри и Бурри-Гинса. В основе метода лежит негативное контрастирование. Так как капсула или тело микробной клетки не воспринимает красители, тушью окрашивается лишь фон микропрепарата. Капсула видна как неокрашенная зона на темном фоне тушевого мазка. По методу Бурри-Гинса тела микробных клеток дополнительно окрашиваются в красный цвет фуксином. Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO 4 ) 2 , HgCl 2 ) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона . Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки. Выявление капсулы по методу Гинса: 1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок. 2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки. 3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата. Окраска спор по методу Ожешки: 1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут. 2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки. 3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий. Окраска по Романовскому-Гимза является одним из основных методов при изучении морфологии риккетсий, хламидий, спирохет, простейших, а также при исследовании форменных элементов крови. Техника. Краситель Романовского-Гимза состоит из азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды нейтральной реакции прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на препарат, предварительно фиксированный жидким фиксатором, на один час. Затем краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. Окрашивание происходит бы- стрее (30-40 минут), если препарат с краской поместить в термостат при 37°С. К 10 мл дистиллированной воды нейтральной или слабо щелочной реакции непосредственно перед окраской препарата прибавляют 10 капель краски и тот час же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Если поместить препарат с краской в термостат при 37º, то окрашивание происходит быстрее (30-40 минут). Результаты окрашивания зависят от свойства воды, поэтому следует проверять ее реакцию. Микроскопическая картина. Риккетсии окрашиваются в розово-красный цвет, ядра эукариотических клеток – в красно-фиолетовый, а цитоплазма – в голубой. Вопрос 2. пути передачи инфекци, входные ворота и тд Механизм, пути и факторы передачи Механизм передачи - способ перемещения возбудителя инфекционных и инвазивных заболеваний из зараженного организма в восприимчивый. Этот механизм включает последовательную смену 3-х стадий: 1. выведение возбудителя из организма хозяина в окружающую среду; 2. пребывание возбудителя в объектах окружающей среды (биотических или абиотических); 3. внедрение возбудителя в восприимчивый организм. Различают следующие механизмы передачи: 1. фекально-оральный, 2. аэрогенный (респираторный), 3. кровяной (трансмиссивный), 4. контактный 5. вертикальный (от одного поколения к другому, т.е. от матери плоду трансплацентарно) Факторы передачи — это элементы внешней среды, обеспечивающие перенос микробов из одного организма в другой. К ним относятся вода, пища, почва, воздух, живые членистоногие, предметы окружающей обстановки. Пути передачи — это конкретные элементы внешней среды или их сочетание, обеспечивающие попадание возбудителя из одного организма в другой в определенных внешних условиях. Для фекально-орального механизма передачи характерны: 1. алиментарный (пищевой), 2. водный 3. контактный (непрямой контакт) пути передачи. Для аэрогенного механизма передачи характерны: 1. воздушно-капельный 2. воздушно-пылевой. Для трансмиссивного механизма передачи характерны: 1. передача через укусы кровососущих эктопаразитов, 2. парентеральный 3. половой. Для контактного (прямого) механизма передачи характерны: 1. раневой 2. контактно-половой (прямой контакт). Для вертикального механизма передачи характерен трансплацентарный путь. Русский ученый-эпидемиолог Л.В.Громашевский сформулировал закон соответствия механизма передачи с локализацией возбудителя в организме. По этому закону все инфекционные болезни по механизму и основным путям передачи классифицируются следующим образом: 1. кишечные инфекции; 2. инфекции дыхательных путей (респираторные); 3. трансмиссивные (или кровяные) инфекции; 4. инфекции наружных покровов. В соответствии с этим делением для каждой из групп присущи основные пути передачи инфекции: 1. для кишечных инфекций — это алиментарный, водный и контактно-бытовой; 2. для респираторных — воздушно-капельный и воздушно-пылевой; 3. для транссмиссивных — через переносчиков, парентеральный и половой; 4. для инфекций наружных покровов — раневой и контактно-половой пути передачи. Кроме этих основных механизмов, при некоторых инфекциях возможен вертикальный путь передачи инфекции от матери плоду и через зародышевые клетки. Входные ворота инфекции часто определяют локализацию возбудителя в организме человека, а также патогенетические и клинические особенности инфекционного заболевания. Для одних микроорганизмов существуют строго определенные входные ворота. Вирус кори, гриппа - верхние дыхательные пути, энтеробактерии -В желудочно-кишечный тракт. Для других микроорганизмов входные ворота могут быть различны, и они вызывают разные по своим клиническим проявлениям заболевания. Стафилококки, стрептококки, протеи при попадании на слизистую верхних дыхательных путей вызывают бронхиты, пневмонии, а при попадании на слизистую оболочку уретры - гнойные уретриты. Вопрос 3. Гепатиты Вирус гепатита А Семейство Picornaviridae Род Hepatovirus Сферическая форма Геном– однонитевая (+) РНК Тип симметрии капсида – кубический Вирусный гепатит А - острая энтеровирусная циклическая инфекция с преимущественно фекально-оральным механизмом заражения. Вирус гепатита А устойчив к окружающей среде: при комнатной температуре может сохраняться в течение нескольких недель, а при 4°С - несколько месяцев. Однако его можно инактивировать кипячением в течение 5 минут, автоклавированием, ультрафиолетовым облучением или воздействием дезинфектантов. Источник инфекции - чаще всего больной человек на начальной стадии Ведущий механизм заражения ГА - фекально-оральный, реализуемый водным, пищевым и контактно-бытовым путями передачи. Существует возможность реализации данного механизма и половым путем. Наиболее часто это происходит при повторном применении игл и шприцев внутривенными пользователями наркотиков. Культивирование вирус выращивают в культурах клеток. Цикл репродукции длинный, цитопатический эффект не выражен. Эпидемиология Вирус выделяется с фекалиями начиная со второй половины инкубационного периода . С появлением желтухи выделение вируса снижается. Вирус распространен повсеместно , но в основном в местах с дефицитом воды, плохими системами канализации м низким уровнем гигиены населения. Болеют в основном дети от 4 до 15 лет. Патогенез После заражения репликация вирусов происходит в кишечнике, а оттуда через портальную вену они проникают в печень и реплицируются в цитоплазме гепатоцитов. Повреждение гепатоцитов происходит не за счет прямого цитотоксического действия, а в результате иммунопатологических механизмов. Клиника Инкубационный период 15-50 дней, чаще около месяца. Начало острое с повышением температуры и явлениями со стороны жкт(тошнота рвота). Возможно появление желтухи на 5-7 день. Продолжительность 2-3 недели. Диагностика материал для исследования - сыворотка и испражнения. Диагностика основана на определении в крови IgM с помощью ИФА, РИА и иммунной электронной микроскопии. Так же можно обнаружить вирусный антиген в фекалиях Лечение - симптоматичекое Профилактика - повышение санитарной культуры населения, улучшение водоснабжения и условий приготовления пищи. Иммуноглобулин по эпидемическим показаниям. Иммунитет сохраняется около 3 месяцев. Применяется инактивированная культурная концентрированная вакцина. Инактивированный формалином вирус гепатита А, накопленный на культуре клеток Схема вакцинации: двукратно, 0 день – 6 (12 или 18) месяцев. Вирус гепатита Е Семейство Hepeviridae Род Hepevirus Hepatitis E virus Сферическая форма Геном – однонитевая (+) РНК Тип симметрии капсида – кубический Эпидемиология и клиника - источник - больные люди. Основной путь передачи - водный. Инкубационный период 2-6 недели. Умеренное поражение печени, интоксикация, желтуха. Прогноз благоприятный, кроме беременных - у них может привести к летальному исходу. Иммунитет после заболевания стойкий Диагностика - серологический метод - в сыворотке, плазме крови с помощью ИФА определяют - антитела к вирусу. молекулярно-генетический метод - применяют ПЦР для определения РНК вируса в кале и сыворотке крови больных в острой фазе инфекции. Лечение - симптоматическое. беременным- специфический иммуноглобулин. Профилактика - улучшение санитарно - гигиенических условий и снабжение качественно питьевой водой. Неживые цельновирионные вакцины Семейство Hepadnaviridae Род Orthohepadnavirus Сферическая форма Геном– двунитевая кольцевая ДНК Культуральные свойства Не культивируется на куриных эмбрионах , не обладает гемолитической активностью. Культивируется только на культуре клеток полученной из ткани первичного рака печени Резистентность высокая устойчивость к факторам окружащющей среды и дезинфицирующим средствам. Чувствителен толео к формалину и хлорамину Патогенез и клиника Инкубация 3-6 месяцев. Инфекционный процесс наступает после проникновения вируса в кровь. далее вирус проникает в гепатоцит. И далее возможно два типа реакции – интегративная и продуктивная Интегративная. вирусоносительство. без клиники Продуктивная. клинически – хронический гепатит, поражение печени , желтуха. Лечение интерферон, интерфероногены Профилактика неспецифическая специфическя вакцинация рекомбинантной генно – инженерной вакциной . всем новорожденным в первые 24 часа жизни , далее через 1 месяц, далее в 5- 6 месяцев и в 12-13 месяцев. среди взрослых трехкратной вакцинации подвергаются лди из зоны риска. длительность действия не менее 7 лет. Гепатит С Гепатит G Гепатит D Билет 33 Вопрос 1. Методы выделения чистых культур Под чистой культурой понимают потомство одной единственной клетки (клон). Для получения чистой культуры используют методы, основанные на изолировании отдельных клеток на твердой питательной среде. Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из скоплений. Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки по размеру и окраске по Граму. Выделяют следующие методы: |