курс микробиологии. Билет Морфология и ультраструктура бактериальной клетки
 Скачать 133.82 Kb.
|
|
Светлопольная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, основной частью которого является объектив. На оправе объективов обозначается увеличение: 8, 10, 20, 40, 90. При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей. Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, состоящий из двух линз. В отечественных микроскопах применяются окуляры с увеличением: 7, 10, 15. Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В микробиологии обычно используются увеличения в 900-1000 раз. Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности. Под этим надо понимать наименьшее расстояние между двумя точками препарата, при котором они еще четко различимы под микроскопом. Разрешающая способность обычных световых микроскопов с иммерсионной системой равна 0,2 мкм. Темнопольная микроскопия Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем принципе. Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя, поле зрения остается темным, а объект на его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального конденсора (параболоид), или обычного конденсора, прикрытого в центре кружком черной бумаги. Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу раздавленной капли. Исследуемый материал (бактериальная культура в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным . Капля материала заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов. Фазово-контрастная микроскопия При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазовоконтрастного конденсора и фазового объектива. Фазовоконтрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива. Фазовоконтрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов. Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, ФИТЦ, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения. Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему. Очень важно использование нефлюоресцентного иммерсионного масла. Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний с помощью реакции иммунофлюоресценции. Электронная микроскопия. Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью. В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность. Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследую объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др. С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получит увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм. Билет 3. Особенности строения и химического состава клеточной стенки Гр(+) и Гр(-) бактерий. Клеточная стенка бактерий тонкая, эластичная и ригидная, может полностью отсутствовать у L-форм, протопластов и микоплазм (класс Mollicites). Она выполняет защитную, опорную и формообразующую функции. На поверхности клеточной стенки расположены рецепторы для бактериофагов, бактериоцинов и химических веществ. Её толщина 0,01–0,04 мкм. В состав стенки бактерий входит пептидогликан, представленный гликановыми цепями, состоящими из чередующихся N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты (NАМК), связанных между собой b-гликозидными связями, а через молекулы NАМК пептидными мостиками. В состав пептидных мостиков входят уникальные аминокислоты: диаминопимелиновая и D-изомеры глутаминовой кислоты и аланина. Таким образом, наличие двух типов связей придает особую прочность и ригидность клеточной стенке бактерий. В то же время эти связи являются мишенями: b-гликозидная – для лизоцима, пептидные – для b-лактамных антибиотиков. Клеточные стенки Гр(+) и Гр(−) бактерий отличаются по строению и химическому составу. Компонентами стенки Гр(+) бактерий являются: пептидогликан, полисахариды и тейхоевые кислоты (состоящие из сахаров, спиртов, аминокислот и фосфорной кислоты).Стенки Гр(−) бактерий содержат незначительное количество пептидогликана и липиды, связанные с белками и сахарами в сложные комплексы – липопротеиды и липополисахариды. Содержат белки-порины: мажорные и минорные. Структура клеточной стенки грациликутных бактерий многослойная. Липополисахарид Гр(−) бактерий состоит из базиса, липида «А» и полисахаридных звеньев. Полисахаридная часть ЛПС обладает иммуногенными свойствами и называется «О-Аг». О-Аг обладает специфичностью. Липидная часть термоустойчива и отвечает за биологические эффекты эндотоксина. Билет 4. Протопласты, сферопласты, L-формы. Удаление клеточной стенки приводит к образованию L-форм, протопластов и сферопластов, различающихся по происхождению (из Гр(+) или Гр(−) бактерий соответственно), а также по осмотической устойчивости. Пребывая в изотонической среде, бактерии, лишенные клеточной стенки, способны поглощать О2 и выделять СО2, а также размножаться. Под действием внешних факторов бактерии способны терять клеточную стенку и образовывать L-формы (названы в честь института им. Д. Листера, где были выделены впервые). Подобная трансформация может быть спонтанной (например, у хламидий) или индуцированной (например, под действием антибиотиков). Выделяют стабильные и нестабильные L-формы; первые не способны к реверсии, а вторые реверсируют в исходные формы после удаления фактора воздействия. Протопласты образуются при полном удалении клеточной стенки (например, под действием лизоцима). Они состоят из цитоплазматической мембраны и клеточного содержимого. Для поддержания сферической формы протопласты нуждаются в изотонической среде и теряют целостность При переносе в гипо- или гипертоническую среду. Клетки с поврежденной клеточной стенкой образуют сферопласты(т.е. они принимают сферическую форму) даже в неизотонической среде т.к. они устойчивы к разнице осмотического давления между внутриклеточными и внеклеточными отделами. Билет 5. Метаболизм микроорганизмов. Ферменты. Практическое использование биохимической активности микроорганизмов. Совокупность химических реакций в клетке называется метаболизмом или обменом веществ. Термин «метаболизм» объединяет два процесса: катаболизм (диссимиляция, или энергетический метаболизм) и анаболизм (ассимиляция, или пластический метаболизм). Метаболизм микроорганизмов имеет ряд особенностей: 1.Реакции обмена веществ идут с огромной скоростью и большой интенсивностью, в 100 раз превышающей скорость метаболизма эукариотических организмов. 2.В качестве питательных веществ микроорганизмы могут использовать как органические, так и неорганические соединения. 3.Микроорганизмы могут жить в бескислородных условиях и при наличии кислорода. 4.Микроорганизмы отличаются широким спектром адаптации к факторам окружающей среды. 5.Большая часть энергии выделяется у микроорганизмов вне клетки из-за простоты структуры и несовершенства строения. По способу получения энергии все микроорганизмы могут быть подразделены на 4 категории: фотолитотрофы, фотоорганотрофы, хемолитотрофы и хемоорганотрофы. Фототрофы используют энергию солнечной радиации. Источник энергии хемотрофов – химические соединения. 1.Фотолитотрофы. Рост зависит от экзогенных неорганических доноров электронов. 2.Фотооорганотрофы. Рост зависит от экзогенных органических доноров электронов. 3.Хемолитотрофы. Рост зависит от окисления экзогенных неорганических соединений. 4.Хемоорганотрофы. Рост зависит от окисления или сбраживания экзогенных органических соединений Все реакции в бактериальной клетке (распад и биосинтез органических соединений, выделение и накопление энергии) катализируются соответствующими ферментами. Ферменты – это специфические и эф -фективные белки, которые узнают соответствующий субстрат по пространственному распределению его молекулы и распределению зарядов в ней. Ферменты-белки обладают строгой специфичностью – каждый фермент регулирует свою реакцию. Локализация ферментов в прокариотической клетке разнообразна. Одни – находятся в цитоплазме, другие – в цитоплазматической мембране, мезосомах и периплазме. Существует несколько классификаций ферментов. 1.По локализации: • Эндоферменты – находятся внутри клетки. • Экзоферменты – выделяются в окружающую среду, относятся к типу адаптивных. 2.По наличию субстрата: • Конститутивные – всегда присутствуют в клетке, независимо от наличия субстрата. • Индуцибельные – в клетке синтезируются при наличии субстрата. 3.По характеру превращений выделяют 6 классов ферментов: • Оксидоредуктазы (класс 1) – катализируют процессы окисления. • Трансферазы (класс 2) – переносят радикал с одного субстрата к другому. • Гидролазы (класс 3) – участвуют в реакциях гидролиза, катализируют расщепление сложных органических соединений при участии Н2О • Лиазы (класс 4) – катализируют образование или расщепление химических соединений, при этом образуются или исчезают двойные связи. • Изомеразы (класс 5) – перемещают радикалы в пределах молекулы без изменения общей формулы субстрата. • Лигазы (класс 6) – катализируют энергозависимые реакции и поэтому их действие сопряжено с гидролизом нуклеозидтрифосфата. У патогенных видов существуют ферменты агрессии, например: • Уреаза – расщепляет мочевину до NH3, который токсичен для организма. • Коагулаза – вызывает коагуляцию белков макроорганизма. • Лецитиназа – расщепляет лецитин эукариотических клеток. Ферментный состав микроорганизма определяет геном: каждый микроорганизм может синтезировать только те ферменты, для которых имеются соответствующие гены. Питание и дыхание см. вопросы 12, 13. Билет 6. Общая характеристика вирусов. Принцип классификации. Значение работ Ивановского для вирусологии. Морфология и структура вириона. Химический состав вириона. Дмитрий Иосифович Ивановский 12 февраля 1892 года доложил на заседании Ученого Совета Академии наук о своих наблюдениях, болезнь табака «табачная мозаика» вызывается агентом, легко проходящим ч/з бактериальные фильтры. Он заразил здоровые растения, но на искусст питат средах не росло, дал название «фильтрующиеся бактерии». Вирусы - это генетически детерминированные внутриклеточные паразиты, которые составляют царство Vira и имеют ряд отличительных признаков: 1)содержат один тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК); 2)отсутствие собственного метаболизма; 3)не имеют белоксинтезирующих и энергетических систем; 4)не способны к росту; 5)не имеют клеточной организации; 6)обладают дизъюнктивным (разобщённым) способом репродукции (синтез белков и нуклеиновых кислот происходит в различных зонах инфицированной клетки и в разное время); 7)облигатный паразитизм вирусов закреплён в геноме; 8)могут встраивать свой геном в геном инфицированной клетки; 9)могут существовать в двух формах: внеклеточной (вириона) и внутриклеточной (вируса). Морфология вирусов По форме вирионы могут быть: 1)округлыми; 2)палочковидными; 3)правильными многоугольниками; 4)нитевидными и др. Размеры вирионов колеблются от 15–18 (парвовирусы) до 300–400 нм (поксвирусы). По структуре вирусы делятся на простые и сложные. В центре любого вириона – вирусная нуклеиновая кислота, покрытая белковой оболочкой – капсидом. Капсид состоит из определённого числа белковых субъединиц (капсомеров), скомпонованных вокруг нуклеиновой кислоты по спирали (спиральный тип симметрии) или в виде многогранника (кубический тип симметрии). Такую структуру нуклеокапсида имеют простые вирусы. Основная функция капсида – защита генома от внешних воздействий и обеспечение адсорбции и проникновения вируса в клетку через взаимодействие с клеточными рецепторами. У сложных вирусов нуклеокапсид покрыт внешней облочкой – суперкапсидом. Суперкапсид – это липидный бислой с включенными в него гликопротеидами в виде шипов. Липидный бислой заимствован из мембран клетки-хозяйки. Основная роль суперкапсида – стабилизация структуры вириона. Вирусные белки подразделяют на неструктурные (функциональные) и структурные: 1)неструктурные белки обеспечивают репликацию вирусных нуклеиновых кислот и процессы репродукции вируса. Это ферменты, за счёт которых происходит увеличение количества копий материнской молекулы, или белки, с помощью которых на матрице нуклеиновой кислоты синтезируются молекулы, обеспечивающие реализацию генетической информации; 2)структурные белки делятся на белки капсида и суперкапсида. Белки капсида – простые белки, обладающие способностью к самосборке. Белки суперкапсида – гликопротеиды, образующие шипы. Шипы – это морфологические субъединицы, построенные из нескольких молекул одного и того же белка. Состоят из наружной гидрофильной части и погруженной в липидный бислой гидрофобной части. Примерами суперкапсидных белков являются гемагглютинины, нейроминидаза, белок слияния. Основные функции гликопротеидов: адсорбция на клетке и проникновение в клетку путем слияния с мембраной или слияния плазматических мембран соседних клеток. Белки вирусов обладают антигенностью и иммуногенностью. Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты. Их структура и размер сильно варьируют у различных видов вирусов. Основная функция генома вируса – сохранение генетической информации. ДНК вируса может быть: 1)двуцепочечной; 2)одноцепочечной; 3)кольцевой; 4)двуцепочечной, но с одной более короткой цепью; 5)двуцепочечной, с одной непрерывной, а с другой фрагментированной цепями. РНК может быть: 1)однонитевой (+) геномной, выполняющей роль иРНК; 2)однонитевой (−) геномной, выполняющей роль иРНК; 3)линейной двунитевой; 4)линейной фрагментированной; 5)кольцевой. Билет 7. Взаимодействие вируса с чувствительной клеткой. Особенности репродукции ДНК и РНК геномных вирусов. Процесс взаимодействия вирусов с чувствительной клеткой называется репродукцией. Различают 3 типа взаимодействия вируса с клеткой. 1. Продуктивная инфекция. При этой форме инфекции в клетке происходит репродукция вируса и образуется вирусное потомство – 104–106 вирусных частиц, которые выходят из зараженной клетки во внешнюю среду. 2. Интегративная инфекция. Геном вируса встраивается (интегрирует) в геном клетки-хозяина. Интегрированные вирусные геномы – провирусы – передаются потомству зараженной клетки при делении. РНК-содержащие вирусы также могут вызвать интегративную инфекцию путём обратной транскрипции с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). При этом в клеточный геном встраивается образующаяся ДНК-копия вирусной РНК. При определённых условиях интегративная форма вирусной инфекции может переходить в продуктивную. 3. Абортивная инфекция. При проникновении в клетку дефектного вируса, не способного к самостоятельной репродукции, или при попадании полноценного вируса в непермиссивную (не подходящую для его репродукции) клетку, или при неподходящих условиях внешней среды возникает абортивная форма инфекции. Взаимодействие с клеткой прерывается на одной из ранних стадий – вирус не репродуцируется и не передаётся потомству заражённой клетки. I стадия репродуктивного цикла любого вируса – адсорбция на клетке. Начальные процессы адсорбции имеют неспецифический характер, в их основе может лежать электрическое взаимодействие положительно и отрицательно заряженных группировок на поверхности вируса и клетки. На адсорбцию влияют рН, буферность и температура среды. При температуре 4 °С адсорбция носит синхронный характер, с повышением температуры скорость адсорбции увеличивается, но она приобретает асинхронный характер. Дальнейшее взаимодействие клеточных рецепторов и вирусных белков носит специфический характер. Вирусы используют рецепторы, предназначенные для проникновения в клетку необходимых для её жизнедеятельности веществ: гормонов, ферментов, факторов роста. Клеточные рецепторы имеют разную химическую природу. Так, для вирусов гриппа и парагриппа рецепторами являются структуры, содержащие сиаловую (нейраминовую) кислоту. Прикрепление вириона к клеточной поверхности осуществляется следующим образом. Вначале происходит образование единичной связи прикрепительного белка с рецептором – обратимая адсорбция. В этот момент, изменяя рН среды, воздействуя ультразвуком, антителами, можно удалить вирион с поверхности клетки. Для наступления необратимой адсорбции должны появиться множественные связи между вирионами и клеточными рецепторами. Число молекул клеточных рецепторов, участвующих в адсорбции, может доходить до 3000. Прикрепительные белки вирусов могут находиться в составе уникальных образований, таких как фибры у аденовирусов. У сложно организованных вирусов эти белки входят в состав шипов на поверхности суперкапсида, например, у вируса гриппа имеется 300–450 шипов гемагглютинина. Просто организованные вирусы содержат прикрепительные белки в составе капсида. |