курс микробиологии. Билет Морфология и ультраструктура бактериальной клетки
 Скачать 133.82 Kb.
|
|
Вирусы - это генетически детерминированные внутриклеточные паразиты, которые составляют царство Vira и имеют ряд отличительных признаков: 1)содержат один тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК); 2)отсутствие собственного метаболизма; 3)не имеют белоксинтезирующих и энергетических систем; 4)не способны к росту; 5)не имеют клеточной организации; 6)обладают дизъюнктивным (разобщённым) способом репродукции (синтез белков и нуклеиновых кислот происходит в различных зонах инфицированной клетки и в разное время); 7)облигатный паразитизм вирусов закреплён в геноме; 8)могут встраивать свой геном в геном инфицированной клетки; 9)могут существовать в двух формах: внеклеточной (вириона) и внутриклеточной (вируса). Морфология вирусов По форме вирионы могут быть: 1)округлыми; 2)палочковидными; 3)правильными многоугольниками; 4)нитевидными и др. Размеры вирионов колеблются от 15–18 (парвовирусы) до 300–400 нм (поксвирусы). По структуре вирусы делятся на простые и сложные. В центре любого вириона – вирусная нуклеиновая кислота, покрытая белковой оболочкой – капсидом. Капсид состоит из определённого числа белковых субъединиц (капсомеров), скомпонованных вокруг нуклеиновой кислоты по спирали (спиральный тип симметрии) или в виде многогранника (кубический тип симметрии). Такую структуру нуклеокапсида имеют простые вирусы. Основная функция капсида – защита генома от внешних воздействий и обеспечение адсорбции и проникновения вируса в клетку через взаимодействие с клеточными рецепторами. У сложных вирусов нуклеокапсид покрыт внешней облочкой – суперкапсидом. Суперкапсид – это липидный бислой с включенными в него гликопротеидами в виде шипов. Липидный бислой заимствован из мембран клетки-хозяйки. Основная роль суперкапсида – стабилизация структуры вириона. Вирусные белки подразделяют на неструктурные (функциональные) и структурные: 1)неструктурные белки обеспечивают репликацию вирусных нуклеиновых кислот и процессы репродукции вируса. Это ферменты, за счёт которых происходит увеличение количества копий материнской молекулы, или белки, с помощью которых на матрице нуклеиновой кислоты синтезируются молекулы, обеспечивающие реализацию генетической информации; 2)структурные белки делятся на белки капсида и суперкапсида. Белки капсида – простые белки, обладающие способностью к самосборке. Белки суперкапсида – гликопротеиды, образующие шипы. Шипы – это морфологические субъединицы, построенные из нескольких молекул одного и того же белка. Состоят из наружной гидрофильной части и погруженной в липидный бислой гидрофобной части. Примерами суперкапсидных белков являются гемагглютинины, нейроминидаза, белок слияния. Основные функции гликопротеидов: адсорбция на клетке и проникновение в клетку путем слияния с мембраной или слияния плазматических мембран соседних клеток. Белки вирусов обладают антигенностью и иммуногенностью. Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты. Их структура и размер сильно варьируют у различных видов вирусов. Основная функция генома вируса – сохранение генетической информации. ДНК вируса может быть: 1)двуцепочечной; 2)одноцепочечной; 3)кольцевой; 4)двуцепочечной, но с одной более короткой цепью; 5)двуцепочечной, с одной непрерывной, а с другой фрагментированной цепями. РНК может быть: 1)однонитевой (+) геномной, выполняющей роль иРНК; 2)однонитевой (−) геномной, выполняющей роль иРНК; 3)линейной двунитевой; 4)линейной фрагментированной; 5)кольцевой. Билет 7. Взаимодействие вируса с чувствительной клеткой. Особенности репродукции ДНК и РНК геномных вирусов. Процесс взаимодействия вирусов с чувствительной клеткой называется репродукцией. Различают 3 типа взаимодействия вируса с клеткой. 1. Продуктивная инфекция. При этой форме инфекции в клетке происходит репродукция вируса и образуется вирусное потомство – 104–106 вирусных частиц, которые выходят из зараженной клетки во внешнюю среду. 2. Интегративная инфекция. Геном вируса встраивается (интегрирует) в геном клетки-хозяина. Интегрированные вирусные геномы – провирусы – передаются потомству зараженной клетки при делении. РНК-содержащие вирусы также могут вызвать интегративную инфекцию путём обратной транскрипции с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). При этом в клеточный геном встраивается образующаяся ДНК-копия вирусной РНК. При определённых условиях интегративная форма вирусной инфекции может переходить в продуктивную. 3. Абортивная инфекция. При проникновении в клетку дефектного вируса, не способного к самостоятельной репродукции, или при попадании полноценного вируса в непермиссивную (не подходящую для его репродукции) клетку, или при неподходящих условиях внешней среды возникает абортивная форма инфекции. Взаимодействие с клеткой прерывается на одной из ранних стадий – вирус не репродуцируется и не передаётся потомству заражённой клетки. I стадия репродуктивного цикла любого вируса – адсорбция на клетке. Начальные процессы адсорбции имеют неспецифический характер, в их основе может лежать электрическое взаимодействие положительно и отрицательно заряженных группировок на поверхности вируса и клетки. На адсорбцию влияют рН, буферность и температура среды. При температуре 4 °С адсорбция носит синхронный характер, с повышением температуры скорость адсорбции увеличивается, но она приобретает асинхронный характер. Дальнейшее взаимодействие клеточных рецепторов и вирусных белков носит специфический характер. Вирусы используют рецепторы, предназначенные для проникновения в клетку необходимых для её жизнедеятельности веществ: гормонов, ферментов, факторов роста. Клеточные рецепторы имеют разную химическую природу. Так, для вирусов гриппа и парагриппа рецепторами являются структуры, содержащие сиаловую (нейраминовую) кислоту. Прикрепление вириона к клеточной поверхности осуществляется следующим образом. Вначале происходит образование единичной связи прикрепительного белка с рецептором – обратимая адсорбция. В этот момент, изменяя рН среды, воздействуя ультразвуком, антителами, можно удалить вирион с поверхности клетки. Для наступления необратимой адсорбции должны появиться множественные связи между вирионами и клеточными рецепторами. Число молекул клеточных рецепторов, участвующих в адсорбции, может доходить до 3000. Прикрепительные белки вирусов могут находиться в составе уникальных образований, таких как фибры у аденовирусов. У сложно организованных вирусов эти белки входят в состав шипов на поверхности суперкапсида, например, у вируса гриппа имеется 300–450 шипов гемагглютинина. Просто организованные вирусы содержат прикрепительные белки в составе капсида. II стадия − проникновение (пенетрация) вирусов в клетку осуществляется за счет двух механизмов, взаимодополняющих друг друга: виропексиса (эндоцитоза) и слияния клеточной и вирусной мембраны. Термин «виропексис», предложенный в 1942 г. Фазекасом де Сан Гро, означает, что вирион попадает в цитоплазму в результате инвагинации участка цитоплазматической мембраны и образования вакуоли. Виропексис является частным случаем рецепторного эндоцитоза, который обеспечивает поступление в клетку аминокислот, нуклеотидов, гормонов и других веществ из межклеточной жидкости. Большинство вирусов проникает в клетку с помощью: 1) рецепторного эндоцитоза, 2) некоторые вирусы – за счет механизма слияния. Функцию белка слияния у вируса гриппа выполняет малая гемагглютинирующая субъединица НА2, у вируса парагриппа, кори и др, белок слияния – fusion protein(англ. fusion– слияние, F-белок). III стадия – раздевание, или депротеинизация, вируса происходит параллельно с его проникновением. В результате депротеинизации разрушаются капсид и суперкапсид, как следствие ДНК или РНК вируса освобождаются. Раздевание вириона осуществляют ферменты клетки ностей: вирион теряет инфекционную активность, появляется чувствительность к нуклеазам, возникает устойчивость к нейтрализующему действия антител и др. Раздевание вириона осуществляется постепенно. Так, вирус гриппа вначале теряет липопротеиновую оболочку, на втором этапе удаляется М-белок и освобождается нуклеокапсид. IVстадия – реализация генетической программы вируса. В эту стадию с помощью специальных ферментов – полимераз снимаются копии с родительской нуклеиновой кислоты (происходит репликация), а также синтезируются информационные РНК, которые соединяются с рибосомами и осуществляют синтез дочерних вирусных белков (трансляцию). Стратегия репликативного цикла вирусов определяется типом вирусного генома. Передача наследственной информации при трансляции различна. Основные схемы: 1.Для ДНК-содержащих вирусов: ДНК вируса→ иРНК→ белок вируса. 2.Для (+) РНК-однонитьевых вирусов:(+) РНК вируса→ белок вируса.3.Для (−) РНК-однонитьевых вирусов:(−) РНК вируса→ иРНК→ белок вируса.4.Для 2-нитчатых РНК-содержащих вирусов:РНК вируса→ иРНК→ белок вируса.5.Для РНК ретровирусов:РНК вируса→ ДНК→ иРНК→ белок вируса. Синтезированные белки, входящие в суперкапсид, встраиваются в мембраны клеток и гликолизируются. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и капсидные белки обладают способностью специфически «узнавать» друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в нуклеокапсиды в результате гидрофобных связей. V стадия – сборка вирионов вируса. В этой стадии капсиды связываются с нуклеиновой вирусной кислотой. У сложных вирусов полный нуклеокапсид связывается со специфическими локусами на цитоплазматической мембране, обеспечивающими образование вирусной оболочки. VI стадия – выход, или освобождение из клетки дочерних вирионов. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, выходят путём «взрыва», вызывают деструкцию клетки (лизис) и попадают в межклеточное пространство. Сложные вирусы, имеющие липопротеидную оболочку, выходят из клетки путём почкования. Нуклеокапсиды фиксируются на клеточной мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают её. В результате нуклеокапсид покрывается суперкапсидом и отпочковывается, при этом клетка длительное время может сохранять жизнеспособность. Билет 8. Культивирование вирусов. Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Культуры клеток. Представляют собой соматические или эмбриональные клетки животных или человека, культивируемые в лабораторных условиях. Клеточные культуры различаются по источнику получения, способности к размножению in vitro и кариотипу. Их подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые .Первичные культуры клеток получают непосредственно из тканей многоклеточных организмов. Такие клетки обычно не способны к делению (неперевиваемые) и используются однократно. К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки различных тканей и органов, способные к ограниченному размножению in vitro. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 20–50 пассажей (пересевов) – до года – диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки при культивировании не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых. Перевиваемые культуры клеток готовят из нормальной ткани (ППЧ – перевиваемые клетки почек человека, ПЭЧ – почек эмбриона человека), а чаще из злокачественных линий клеток, обладающих способностью неограниченно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся, например, злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Hep-3 (из лимфоидной карциномы) и др. Для выращивания клеточных культур используют питательные среды сложного состава (среда Игла, среда 199), включающие источники энергии, минеральные вещества, аминокислоты, витамины и другие факторы роста. В среды добавляют индикатор феноловый красный, который при рН < 7 желтеет. Индикатор необходим для определения жизнеспособности клеток: живые клетки, метаболируя, снижают рН; пораженные вирусом клетки теряют способность к метаболизму, рН не изменяется, цвет среды остаётся красным. Большинство клеточных культур можно использовать в виде монослоя и суспензии. Приготовление первичной культуры клеток включает несколько последовательных этапов: 1) измельчение ткани; 2) разъединение клеток путём трипсинизации; 3) обработка антибиотиками; 4) отмывание полученной суспензии изолированных клеток от трипсина с последовательным суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост (например, в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови); 5) получение монослоя клеток. Куриные эмбрионы. В диагностических целях и для приготовления препаратов (вакцин, диагностикумов) используют, как правило, 8–12 дневные куриные эмбрионы. Для заражения эмбрионов используют аллантоисную и амниотическую полости, хорион-аллантоисную оболочку и желточный мешок. Вскрытие зараженных эмбрионов производят в сроки максимального накопления вируса (через 48–72 часа и инкубации при 37 °С). К специфическим поражениям эмбриона относят геморрагии, бляшки и др. Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных, их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорождённые животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки к вирусам Коксаки). Для демонстрации присутствия вируса в клеточной культуре используют несколько методов индикации. 1. Цитопатическое действие (ЦПД) может быть обнаружено микроскопически по морфологическим изменениям клеток. Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних вирусов (парамиксовирусы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других (энтеровирусы, реовирусы) – сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) – агрегация клеток. 2. ЦПД вирусов можно также обнаружить с помощью «цветной пробы Солка»: метаболически активные клетки культуры в ходе жизнедеятельности выделяют кислые продукты, что вызывает изменение цвета индикатора, присутствующего в культуральной среде. При репродукции вируса клетки утрачивают способность к метаболизму и погибают, поэтому окраска среды с течением времени не меняется. 3. ЦПД вирусов определяют и по образованию бляшек под агаром (метод Дульбеко). 4. Некоторые вирусы можно идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме заражённых клеток. Например, вирус бешенства вызывает дегенеративные поражения нейронов, в клетках образует эозинофильные тельца включений с нервными краями, преимущественно в клетках аммонова рога гиппокампа, известные как тельца Бабеша – Негри. Включения выявляют специфическими методами окраски по Муромцеву и Манну. 5. Реакцию гемадсорбции применяют для индикации гемагглютинирующих вирусов. Реакция основана на способности поверхности клеток, в которых репродуцируются такие вирусы, адсорбировать эритроциты. 6. Реакцию гемагглютинации (РГА) применяют для обнаружения гемагглютинирующих вирусов в культуральной жидкости заражённой культуры клеток либо в хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Билет 9. Фаги. Структура. Химический состав. Формы взаимодействия с бактериальной клеткой. Бактериофагия – явление лизиса живых бактерий, инфицированных бактериофагами. Явление бактериофагии наблюдали многие ученые, но приоритет открытия бактериофагов принадлежит Ф. Д’ Эреллю. Бактериофаги встречаются всюду, где есть бактерии, – в почве, воде, кишечнике человека и т.д. Они обладают высокой специфичностью – это означает, что сальмонеллёзные фаги лизируют только сальмонелл, стафилококковые – стафилококки. Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам. Их геном представлен либо РНК, либо ДНК и заключён в белковую оболочку – капсид. Фаги различаются по морфологии и характеру взаимодействия с микробной клеткой. По форме фаги бывают нитевидными, сферическими, сперматозоидными. Наиболее сложно устроены крупные фаги сперматозоидной формы. Они имеют следующую структуру: головка – икосаэдр, внутри 2нитчатая линейная ДНК (200 генов), головка с помощью воротника и зонтика связана с хвостовым отростком, который состоит из полого цилиндрического стержня и окружающего его сократительного чехла. Хвостик заканчивается шестиугольной базальной мембраной с шестью шипами и шестью хвостовыми нитями (фибриллами). В мембране и шипах содержится лизоцим. Хвостовой отросток служит для адсорбции фага и впрыскивания ДНК фага в бактериальную клетку. По взаимодействию с бактериальной клеткой фаги подразделяют на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги в бактериальной клетке вызывают продуктивную индукцию, т.е. размножаются в ней, вызывая её лизис. Умеренные фаги вступают с бактериальной клеткой в своеобразные симбиотические отношения: проникнув в клетку, ДНК фагов включается в ДНК нуклеоида бактерий и реплицируется вместе с ней. Бактерии, несущие умеренный фаг, получили название лизогенных. Фаг, встроенный в ДНК бактерий, называют профагом, а симбиоз бактериальной клетки с фагом – феноменом лизогении. Процесс лизогении выгоден и фагу, и бактериальной клетке. Лизогенная культура приобретает ряд новых полезных для неё свойств: невосприимчивость к повторному заражению вирулентным фагом, может продуцировать ряд веществ, синтез которых детерминируется профагом. Изменение свойств бактериальной клетки, связанное с присутствием профага получило название фаговая и лизогенная конверсия. Билет 10. Методы получения и титрования фагов. Практическое применение. Выделение фага из объектов окружающей среды. Готовят фильтрат исходного материала (вода, суспензия фекалий и др.), пропуская его ч/з бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 370С 18-24ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага определяют качественными и количественными методами. Качественный метод определения фагов E.coli. чашку Петри с ПА засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37оС 10-15 мин. На поверхность газона каплю фага, наклоняют, чтобы стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку на наличие зоны лизиса на месте стекания капли фага. Титрованием фага по Аппельману можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до порядка. Для этого используется жидкая питательная среда. а.Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в жидкой питательной среде. б. Каждое разведение засевается чувствительной к данному фагу бактериальной культурой. в. Посевы инкубируются в термостате. г. Последнее разведение фагосодержащего материала, в котором не будет роста – это и есть титр бактериофага Бактериофаги используются для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также в диагностике – для определения фагочувствительности и фаготипирования при идентификации микроорганизмов. Действие фагов основано на их строгой специфичности. Лечебно-профилактическое действие фагов обусловливается литической активностью самого фага, а также иммунизирующим свойством находящихся в фаголизатах компонентов (Аг) разрушенных микробных клеток. Выпускаются фаги для лечения и профилактики сальмонеллёзов, брюшного тифа, дизентерии, стафилококковых и других инфекций. Лекарственные формы фагов – жидкие (вводятся местно, перорально, ректально), таблетки с кислотоустойчивым покрытием, ректальные суппозитории (свечи). Диагностические фаги применяют для идентификации выделенных бактерий. Разработана фагодиагностика (РНТФ – реакции нарастания титра фага, реакция фаголизабельности) и фаготипирование бактерий (стафилококков, сальмонеллы и др.). Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеваний от эпидемических. Фаги (особенно умеренные) широко используют для изучения генетики микроорганизмов. Билет 11. Питательные среды и их классификация. Требования. |