курс микробиологии. Билет Морфология и ультраструктура бактериальной клетки

• Название: Билет Морфология и ультраструктура бактериальной клетки
• Анкор: курс микробиологии
• Дата: 29.10.2021
• Размер: 133.82 Kb.
• Имя файла: MIKRA_1.docx
• Тип: Документы; #259020
• страница: 6 из 9

II стадия − проникновение (пенетрация) вирусов в клетку осуществляется за счет двух механизмов, взаимодополняющих друг друга: виропексиса (эндоцитоза) и слияния клеточной и вирусной мембраны. Термин «виропексис», предложенный в 1942 г. Фазекасом де Сан Гро, означает, что вирион попадает в цитоплазму в результате инвагинации участка цитоплазматической мембраны и образования вакуоли. Виропексис является частным случаем рецепторного эндоцитоза, который обеспечивает поступление в клетку аминокислот, нуклеотидов, гормонов и других веществ из межклеточной жидкости. Большинство вирусов проникает в клетку с помощью: 1) рецепторного эндоцитоза, 2) некоторые вирусы – за счет механизма слияния. Функцию белка слияния у вируса гриппа выполняет малая гемагглютинирующая субъединица НА2, у вируса парагриппа, кори и др, белок слияния – fusion protein(англ. fusion– слияние, F-белок).
III стадия – раздевание, или депротеинизация, вируса происходит параллельно с его проникновением. В результате депротеинизации разрушаются капсид и суперкапсид, как следствие ДНК или РНК вируса освобождаются. Раздевание вириона осуществляют ферменты клетки ностей: вирион теряет инфекционную активность, появляется чувствительность к нуклеазам, возникает устойчивость к нейтрализующему действия антител и др. Раздевание вириона осуществляется постепенно. Так, вирус гриппа вначале теряет липопротеиновую оболочку, на втором этапе удаляется М-белок и освобождается нуклеокапсид.
IVстадия – реализация генетической программы вируса. В эту стадию с помощью специальных ферментов – полимераз снимаются копии с родительской нуклеиновой кислоты (происходит репликация),

а также синтезируются информационные РНК, которые соединяются с рибосомами и осуществляют синтез дочерних вирусных белков (трансляцию). Стратегия репликативного цикла вирусов определяется типом вирусного генома.

Передача наследственной информации при трансляции различна.

Основные схемы: 1.Для ДНК-содержащих вирусов: ДНК вируса→ иРНК→ белок вируса. 2.Для (+) РНК-однонитьевых вирусов:(+) РНК вируса→ белок вируса.3.Для (−) РНК-однонитьевых вирусов:(−) РНК вируса→ иРНК→ белок вируса.4.Для 2-нитчатых РНК-содержащих вирусов:РНК вируса→ иРНК→ белок вируса.5.Для РНК ретровирусов:РНК вируса→ ДНК→ иРНК→ белок вируса.

Синтезированные белки, входящие в суперкапсид, встраиваются в мембраны клеток и гликолизируются. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и капсидные белки обладают способностью специфически «узнавать» друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в нуклеокапсиды в результате гидрофобных связей.
V стадия – сборка вирионов вируса. В этой стадии капсиды связываются с нуклеиновой вирусной кислотой. У сложных вирусов полный нуклеокапсид связывается со специфическими локусами на цитоплазматической мембране, обеспечивающими образование вирусной оболочки.
VI стадия – выход, или освобождение из клетки дочерних вирионов. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, выходят путём «взрыва», вызывают деструкцию клетки (лизис) и попадают в межклеточное пространство. Сложные вирусы, имеющие липопротеидную оболочку, выходят из клетки путём почкования. Нуклеокапсиды фиксируются на клеточной мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают её. В результате нуклеокапсид покрывается суперкапсидом и отпочковывается, при этом клетка длительное время может сохранять жизнеспособность.
Билет 8. Культивирование вирусов.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные

эмбрионы и чувствительных лабораторных животных.

Культуры клеток. Представляют собой соматические или эмбриональные клетки животных или человека, культивируемые в лабораторных условиях. Клеточные культуры различаются по источнику получения, способности к размножению in vitro и кариотипу. Их подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые

.Первичные культуры клеток получают непосредственно из тканей многоклеточных организмов. Такие клетки обычно не способны к делению (неперевиваемые) и используются однократно.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки различных тканей и органов, способные к ограниченному размножению in vitro. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 20–50 пассажей (пересевов) – до года – диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки при культивировании не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Перевиваемые культуры клеток готовят из  нормальной ткани (ППЧ – перевиваемые клетки почек человека, ПЭЧ – почек эмбриона человека), а чаще из злокачественных линий клеток, обладающих

способностью неограниченно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся, например, злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Hep-3 (из лимфоидной карциномы) и др.
Для выращивания клеточных культур используют питательные среды сложного состава (среда Игла, среда 199), включающие источники энергии, минеральные вещества, аминокислоты, витамины и другие факторы роста. В среды добавляют индикатор феноловый красный, который при рН < 7 желтеет. Индикатор необходим для определения жизнеспособности клеток: живые клетки, метаболируя, снижают рН; пораженные вирусом клетки теряют способность к метаболизму, рН не изменяется, цвет среды остаётся красным. Большинство клеточных культур можно использовать в виде монослоя и суспензии.

Приготовление первичной культуры клеток включает несколько последовательных этапов:

1) измельчение ткани;

2) разъединение клеток путём трипсинизации;

3) обработка антибиотиками;

4) отмывание полученной суспензии изолированных клеток от трипсина с последовательным суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост (например, в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови);

5) получение монослоя клеток.

Куриные эмбрионы. В диагностических целях и для приготовления препаратов (вакцин, диагностикумов) используют, как правило, 8–12 дневные куриные эмбрионы. Для заражения эмбрионов используют аллантоисную и амниотическую полости, хорион-аллантоисную оболочку и желточный мешок. Вскрытие зараженных эмбрионов производят в сроки максимального накопления вируса (через 48–72 часа и инкубации при 37 °С). К специфическим поражениям эмбриона относят геморрагии, бляшки и др.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных, их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорождённые животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки к вирусам Коксаки).
Для демонстрации присутствия вируса в клеточной культуре используют несколько методов индикации.
1. Цитопатическое действие (ЦПД) может быть обнаружено микроскопически по морфологическим изменениям клеток. Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних вирусов (парамиксовирусы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других (энтеровирусы, реовирусы) – сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) – агрегация клеток.

2. ЦПД вирусов можно также обнаружить с помощью «цветной пробы Солка»: метаболически активные клетки культуры в ходе жизнедеятельности выделяют кислые продукты, что вызывает изменение цвета индикатора, присутствующего в культуральной среде. При репродукции вируса клетки утрачивают способность к метаболизму и погибают, поэтому окраска среды с течением времени не меняется.

3. ЦПД вирусов определяют и по образованию бляшек под агаром (метод Дульбеко).

4. Некоторые вирусы можно идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме заражённых клеток. Например, вирус бешенства вызывает дегенеративные поражения нейронов, в клетках образует эозинофильные тельца включений с нервными краями, преимущественно в клетках аммонова рога гиппокампа,

известные как тельца Бабеша – Негри. Включения выявляют специфическими методами окраски по Муромцеву и Манну.
5. Реакцию гемадсорбции применяют для индикации гемагглютинирующих вирусов. Реакция основана на способности поверхности клеток, в которых репродуцируются такие вирусы, адсорбировать эритроциты.
6. Реакцию гемагглютинации (РГА) применяют для обнаружения гемагглютинирующих вирусов в культуральной жидкости заражённой культуры клеток либо в хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.

Билет 9. Фаги. Структура. Химический состав. Формы взаимодействия с бактериальной клеткой.
Бактериофагия – явление лизиса живых бактерий, инфицированных бактериофагами. Явление бактериофагии наблюдали многие ученые, но приоритет открытия бактериофагов принадлежит Ф. Д’ Эреллю. Бактериофаги встречаются всюду, где есть бактерии, – в почве, воде, кишечнике человека и т.д. Они обладают высокой специфичностью – это означает, что сальмонеллёзные фаги лизируют только сальмонелл, стафилококковые – стафилококки.

Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам. Их геном представлен либо РНК, либо ДНК и заключён в белковую оболочку – капсид. Фаги различаются по морфологии и характеру взаимодействия с микробной клеткой. По форме фаги бывают нитевидными, сферическими, сперматозоидными. Наиболее сложно

устроены крупные фаги сперматозоидной формы. Они имеют следующую структуру: головка – икосаэдр, внутри 2нитчатая линейная ДНК (200 генов), головка с помощью воротника и зонтика связана с хвостовым отростком, который состоит из полого цилиндрического стержня и окружающего его сократительного чехла. Хвостик заканчивается шестиугольной базальной мембраной с шестью шипами и шестью хвостовыми нитями (фибриллами). В мембране и шипах содержится лизоцим. Хвостовой отросток служит для адсорбции фага и впрыскивания ДНК фага в бактериальную клетку.

По взаимодействию с бактериальной клеткой фаги подразделяют на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги в бактериальной клетке вызывают продуктивную индукцию, т.е. размножаются в ней, вызывая её лизис. Умеренные фаги вступают с бактериальной клеткой в своеобразные симбиотические отношения: проникнув в клетку, ДНК фагов включается в ДНК нуклеоида бактерий и реплицируется вместе с ней. Бактерии, несущие умеренный фаг, получили название лизогенных. Фаг, встроенный в ДНК бактерий, называют профагом, а симбиоз бактериальной клетки с фагом – феноменом лизогении. Процесс лизогении выгоден и фагу, и бактериальной клетке. Лизогенная культура приобретает ряд новых полезных для неё свойств: невосприимчивость к повторному заражению вирулентным фагом, может продуцировать ряд веществ, синтез которых детерминируется профагом. Изменение свойств бактериальной клетки, связанное с присутствием профага получило название фаговая и лизогенная конверсия.

Билет 10. Методы получения и титрования фагов. Практическое применение.

Выделение фага из объектов окружающей среды. Готовят фильтрат исходного материала (вода, суспензия фекалий и др.), пропуская его ч/з бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37⁰С 18-24ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага определяют качественными и количественными методами.

Качественный метод определения фагов E.coli. чашку Петри с ПА засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37^оС 10-15 мин. На поверхность газона каплю фага, наклоняют, чтобы стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку на наличие зоны лизиса на месте стекания капли фага.

Титрованием фага по Аппельману можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до порядка. Для этого используется жидкая питательная среда. а.Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в жидкой питательной среде.
б. Каждое разведение засевается чувствительной к данному фагу бактериальной культурой.
в. Посевы инкубируются в термостате.
г. Последнее разведение фагосодержащего материала, в котором не будет роста – это и есть титр бактериофага
Бактериофаги используются для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также в диагностике – для определения фагочувствительности и фаготипирования при идентификации микроорганизмов.

Действие фагов основано на их строгой специфичности. Лечебно-профилактическое действие фагов обусловливается литической активностью самого фага, а также иммунизирующим свойством находящихся в фаголизатах компонентов (Аг) разрушенных микробных клеток.

Выпускаются фаги для лечения и профилактики сальмонеллёзов, брюшного тифа, дизентерии, стафилококковых и других инфекций.

Лекарственные формы фагов – жидкие (вводятся местно, перорально, ректально), таблетки с кислотоустойчивым покрытием, ректальные суппозитории (свечи).

Диагностические фаги применяют для идентификации выделенных бактерий. Разработана фагодиагностика (РНТФ – реакции нарастания титра фага, реакция фаголизабельности) и фаготипирование бактерий (стафилококков, сальмонеллы и др.). Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеваний от эпидемических. Фаги (особенно умеренные) широко используют для изучения генетики микроорганизмов.
Билет 11. Питательные среды и их классификация. Требования.
Питательная среда — вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов.

Простые жидкие (ПВ, МПБ) и плотные (МПЖ и МПА).

Сложные Специальные: сахар. МПА (Рис. 1), МПБ, сывороточный. МПА, кровяной МПА,асцитический МПА. Обогащения, накопления: селенитовый МПБ, среды Мюллера, Кауффмана, Китта-Тароцци. Элективные: Ру, 1% щелочная ПВ. Диференциально-диагностические: 1) для определения сахаролитических свойств (среды Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева) 2)  для определения протеолитических свойств (свернутая сыворотка, МПЖ, кусочки мышц, белка куриного яйца) 3)     для определения пептолитических свойств (МПБ, ПВ) 4)     для определения гемолитических свойств (кров.МПА) 5)     для определения редуцирующих свойств (среды с разными красителями)

Требования к питательным средам: прозрачная, стерильная (не должно быть ассоциаций), полноценная, забуференная (определённый рН), влажная (вода для формирования клетки), соответствующий рдокс-потенциал (влияние на окисл-восст).

Биохимические свойства бактерий определяются составом ферментов: сахаролитические – расщепление углеводов; протеолитические – расщепление белков, липолитические – расщепление жиров. Посев на среды Гисса (пестрый ряд).

Билет 12. Типы питания бактерий.

вещества для питания: H₂, O₂, C₂, N₂.

По происхождению клеточного углерода бактерии делятся на автотрофные и гетеротрофные.
Автотрофия. Пищевые потребности некоторых бактерий ограничены, для их роста достаточно внесения в среду

NaCl, K2HPO4, FeCl2, MgSO4и (NH4)2SO4. Автотрофные бактерии в качестве источника углерода используют двуокись углерода или карбонаты и не нуждаются в углеводах и белках. Они способны синтезировать все необходимые соединения из простых веществ.
Гетеротрофия. Некоторые бактерии неспособны обеспечить собственный метаболизм за счет своих синтетических резервов и нуждаются в  наличии органического соединения в  окружающей среде. Гетеротрофные бактерии в качестве источника углерода используют углеродсодержащие соединения – гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты, органические кислоты и углеводороды. Сапротрофы – деструкция, паратрофы – паразиты – инфекции, некропаратрофы – хищники.
Гипотрофия является крайней степенью утраты метаболической активности. Гипотрофные бактерии обеспечивают свою жизнедеятельность, реорганизуя клеточные структуры или метаболиты хозяина.
Некоторые бактерии, особенно патогенные, нуждаются в факторах роста; наиболее часто это витамины, пурины и пиримидины; основное значение для бактерий имеют водорастворимые витамины, принимающие участие в образовании большого количества ферментов, являясь их коэнзимами. Факторы, стимулирующие рост бактерий, разделяют на три категории: 1) факторы, присутствие которых обязательно для роста бактерий; 2) факторы, отсутствие которых не вызывает полной остановки роста культуры; 3) факторы, непосредственно синтезируемые бактериями и добавление которых в среду необязательно.

Ауксотрофия. Прихотливые бактерии или мутанты с наследственными дефектами могут расти только в среде, дополненной определенными компонентами, которые сами синтезировать не могут. Бактерии, нуждающиеся в подобных факторах роста, называются ауксотрофами. Если ауксотрофия возникает в результате мутаций, то «дикий», или основной, тип, не нуждающийся в определенном факторе роста, называют прототрофным.
Энергетические потребности бактерий обеспечивает

система электронного транспорта, расположенная между внешней и внутренней

цитоплазматическими мембранами. К ней относятся:
1.Диффузия. Протекает по градиенту концентрации, без затраты энергии, скорость её минимальная. Диффузия может быть пассивной и облегченной. При пассивной – вещества перемещаются за счет различия концентраций по обе стороны мембраны (например, проникновение Н2О). При облегченной – вещества поступают в клетку с участием мембранных белков – пермеаз, способных проходить через мембранный барьер с молекулой субстрата и без неё (например, проникновение глицерина в клетки бактерий кишечной группы).
2.Активный транспорт – энергозависимый процесс. Энергия направлена на изменение концентрации поглощаемого субстрата. Вещества поступают в клетку против градиента концентрации с максимальной скоростью и с помощью пермеаз. Так в клетку поступает лактоза или другой β-галактозид.
3.Транспорт, обусловленный фосфорелированием – энергозависимый процесс, используемый при утилизации углеводов, например глюкозы. Транспортируемые вещества претерпевают химическую модификацию, взаимодействуют со специфическим ферментом – Ф2. Данный вид транспорта не рассматривают как активный, поскольку концентрация питательного вещества внутри клетки всегда остаётся низкой.