цитологические исследования в кдл. цитологические исследования. Цитологические исследования Цитология

• Название: Цитологические исследования Цитология
• Анкор: цитологические исследования в кдл
• Дата: 06.11.2019
• Размер: 168.52 Kb.
• Имя файла: цитологические исследования.docx
• Тип: Документы; #93805
• страница: 7 из 9

Хроматин. Термин предложен Флемингом в 1880 году. По биохимическим характеристикам хроматин имеет кислые свойства, которые связаны с тем, что в состав хроматина входит ДНК в комплексе с белками. Белки подразделяются на два типа: гистоны (60%) и негистоновые белки.

Кроме того, в состав хроматиновой фракции входят мембранные компоненты – углеводы, липиды, гликопротеины, РНК. Нитчатые комплексные молекулы дезоксирибонуклеопротеинов. За счет ассоциации гистонов с ДНК образуются лабильные нуклеогистоновые нити, толщиной 10-30нм.

Хроматин может находиться в двух альтернативных состояниях: в деконденсированном, соответствующим интерфазе, и конденсированным, т.е. максимально уплотненным во время митоза.  Хроматин интерфазных ядер представляет собой рыхлую деконденсированную структуру, которая имеет разную степень этой разрыхленности. Когда хромосома или ее участок полностью деконденсирован, такие зоны называют диффузным хроматином. Он характерен для интенсивно делящихся и мало специализированных клеток.

При неполном разрыхлении хромосом в составе интерфазного ядра видны участки конденсированного хроматина. Это высоко специализированные клетки или клетки, заканчивающие свой жизненный цикл, где хроматин выглядит массивным темным периферическим слоем, имеет крупные белки хромоцентры. Чем более диффузен хроматин, тем выше в нем идут синтетические процессы и наоборот.

Максимально конденсированный хроматин наблюдается во время митотического деления клетки, когда он обнаруживается в виде хромосом. В это время хромосомы не несут никаких синтетических нагрузок, и такой конденсированный хроматин выполняет функцию перераспределения генетического материала.

Исходя из этих наблюдений, принято считать, что хроматин ядра находится в двух структурно-функциональных состояниях: в рабочем, под которым понимают полную или частичную деконденсацию хроматина, когда происходят процесы транскрипции и редупликации. Или в нерабочем – в состоянии метаболического покоя при максимальной конденсации, когда хроматин перераспределяется между клетками.

В 1932 году Гейцем было замечено, что при метаболизме клетки не все участки конденсированного хроматина переходят в рыхлую зону. И было замечено, что в состоянии метаболической активности не все участки диффузные. Недиффузные участки получили название гетерохроматин (конститутивный хроматин), а остальная масса хроматина стала называться эухроматином.

По этим представления гетерохроматин – компактные участки хромосом, которые в профазе появляются раньше других частей хромосом, а в телофазе – не деконденсируются. Они переходят в интерфазное ядро в виде хромоцентров, сгустков хроматина. Такой гетерохроматин принято называть конститутивным или постоянным.

Конститутивный гетерохроматин практически никогда не меняет своего конденсированного состояния и формирует центромерные и кольцевые участки хромосом. Кроме того, он находится в виде вставочного или интеркалярного гетерохроматина.

Участки конститутивного гетерохроматина обладают целым рядом особенностей:

1)  Генетически конститутивный гетерохроматин не активен, т.е. он не транскрибируется.

2)  Реплицируется он позже всего остального хроматина.

3)  В его состав входит особая сателлитная ДНК, которая обогащена повторяющимися последовательностями нуклеотидов.

Зачем нужны такие участки?

1) Поддерживают общую структуру ядра;

2) Участвует в прикреплении хромосом к ядерной оболочке;

3) Играют роль разделителя между генами;

4) Является местом узнавания гомологичных хромосом при мейозе.

   

Вся остальная масса хроматина может менять степень своей компактизации или упаковки и в зависимости от функциональной активности соответствует эухроматину или факультативному гетерохроматину.

Примером гетерохроматина является Х-хромосома в организме человека. В клетках мужской особи есть Х-хромосома. Она находится в деконденсированном состоянии. Значит, активна, транскрибируется и морфологически ее найти сложно, потому что она в рыхлом состоянии.

В клетках женского организма одна Х-хромосома находится в активном диффузном состоянии, а вторая – в неактивном. Она временно гетерохроматизирована и может существовать у женщин в течение всей жизни. Но, попадая в виде гамет в клетки мужского организма она активируется, деконденсируется и начинает выполнять свои функции. В дифференцированных клетках всего лишь около 10% генов находится в активном состоянии, а остальные находятся в стоянии факультативного гетерохроматина.

Представление о том, что митотические хромосомы после деления клеток превращаются в хроматин интерфазного ядра и, что самое главное, не теряют своей целостности не распадаются на фрагменты, а сохраняют свою физическую индивидуальность, переходя лишь в разрыхленное диффузное состояние было высказано еще ученым Говери в 1887 году.

Эти представления позднее оформились в теорию непрерывности хромосом: Хромосомы, вошедшие в состав дочернего ядра в телофазе сохраняются в нем, хотя и в очень измененном виде, в качестве индивидуальных структур и появляются (становятся видны) снова в виде хромосом в следующей профазе.

Первые исследование о порядке расположения хромосом внутри ядра принадлежат ученому Раблю. В 1885 году, изучая профазные ядра растений, предположил, что внутри ядра хромосомы повторяют свою анафазную ориентацию, т.е. их центромерные участки располагаются на одном полюсе клетки ядра, а теломерные обращены к другому. При этом каждое плечо хромосомы занимает определенную зону, объем которой никогда не заходит в объем соседних хромосом.

Каждая из хромосом образует спиральную структуру, в которой находится 5 – 7 витков, которая в нескольких местах взаимодействует с ядерной оболочкой. Эти места, которые фиксирую хромосому, являются участками конститутивного хроматина.

В состав ДНК эукариот входит две фракции, которые восстанавливаются (процесс – ренатурация) Восстановление исходной двуспиральной структуры молекул ДНК за счет воссоединения ее комплементарных цепей.

Выделяют фракцию с высокой скоростью и с медленной. При этом в составе фракции, ренатурирующей с высокой скоростью, выделяют: 1) фракцию с высоко повторяющимися последовательностями, где сходные участки ДНК повторяются до 10⁶ раз. Это фракции сателлитной ДНК.

Вторая фракция с умеренно повторяющейся последовательностью, которая повторяется в геноме от 100 до 1000 раз.

Сателлитная ДНК не участвует в синтезе основных типов РНК, не связана с процессом синтеза белка. Полагают, что саттелитная ДНК несет информацию, которая играет структурную роль в сохранении и функционировании хромосом.

Например, центромерная ДНК человека состоит из мономеров, в которые входят по 170 нуклеотидных пар. Мономеры в свою очередь образуют еще более крупные последовательности и такие поселедовательности повторяются 1000 раз. С этой специфической центромерной ДНК взаимодействуют особые белки, участвующие в образовании кинетохора – обязательной структуры хромосом, обеспечивающей их связь с микротрубочками веретена деления и определяющей расхождения хромосом в анафазе.

Во фракцию умеренно повторяющихся последовательностей входят гены рибосомных ДНК. Сюда же входят участки для синтеза транспортных РНК, структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, в частности белков-гистонов. Такие последовательности повторяются до 400 раз.

Среды высших растений количество ДНК может отличаться в сотни раз у разных видов. У некоторых амфибий в ядрах ДНК больше, чем в ядрах человека в 10 раз.

Различие в количестве ДНК у разных таксонов связаны с неодинаковой долей тех или иных фракций ДНК в ядре. У амфибий на долю повторяющийся последовательностей приходится 80% всей ДНК, у растений до 70%, а у рыб до 60%. Истинное же богатство генетической информации отражает фракция уникальных последовательностей. В среднем, на интерфазное ядро млекопитающих приходится около 2м ДНК. Поэтому огромная линейная молекулы ДНК укладывается в 10мкм клетки определенным сложным образом и ведущую роль в этой укладке молекулы в организации ее расположение компактизации и функциональной активности принадлежит ядерным белкам. Ведущую роль среди  ядерных белков играю белки-гистоны.

 

Основные белки хроматина – гистоны.

 

На долю гистонов приходит 5 типов белков. Гистоны связаны с ДНК в виде субъединиц нуклеосомы. Гистоны характерны только для хроматина. Они обладают щелочными свойствами, которые определяются высоким содержанием аминокислот лизина и аргенина. Положительные заряды на аминогруппах этих кислот обуславливают солевую или электростатическую связь этих белков с отрицательными зарядами на фосфатных группах молекулы ДНК.

Гистоны имеют сродство к молекуле ДНК. Но эта связь нестабильная, легко разрушается. В этом случае может происходить диссоциация на свои составляющие структуры.

Гистоны имеют относительно небольшую молекулярную массу. Они подразделяются на 5 групп: H₁, H_2a, H_2b, H₃, H₄. Гистоны всех классов кроме H₁ в равных количествах. У 3 и 4 большое количество аргенина и они наиболее консерватины по отношению к другим. H_2a и H_2b – умеренно обогащенные лизином белки. У разных объектов внутри группы образуются межвидовые вариации. Гистон H₁ – уникальная молекула. Класс белков, который состоит из нескольких достаточно близкородственных белков. У этого гистона обнаружены очень большие межвидовые и межтканевые вариации. Наиболее вариабельным участком имеется N-конец, который осуществляет связь  с другими гистонами. И С-конец, богатый лизином, который взаимодействует с ДНК. По количеству всех гистонов примерно одинаковое количество, кроме Н₁, его примерно в 2 раза больше.

В процессе жизнедеятельности клеток с гистонами происходят модификации. Главными из которых является ацетилирование и метилирование остатков лизина, что приводит к потере положительного заряда.

Фосфорилирование сириновых остатков, которое приводит к появлению отрицательного заряда.

Эти модификации гистонов существенно сказываются на функциях белков и их способностью взаимодействовать с молекулой ДНК. Так, например, повышенное ацетилирование гистонов предшествует активации генов, а фосфорилирование или наоборот дефосфорилирование связано с конденсацией или деконденсацией хроматина.

Все типы гистонов синтезируются в цитоплазме на рибосомах, транспортируются в ядро через поровые комплексы и связываются с ДНК во время ее репликации в S-периоде клеточного цикла. Т.е синтез гистонов и синтез ДНК синхронизированы.

Включившись в состав хроматина, гистоны становятся очень стабильными, имеют низкую скорость замены и примерно в течение 4 – 5 циклов клетки не выходят из состава.

 

Функции:

1) Упаковка ДНК;

2) Структурная роль в организации хроматина;

3) Регуляция уровня транскрипции;

4) Регуляторная функция. Определяет степень компактности и активности хроматина.

 

В процессе упаковки ДНК проходит несколько уровней.

Спирализация молекулы ДНК.

 

1)  Первый уровень упаковки носит название нуклеосомный. Структурные единицы этого уровня – нуклеосомы. Они представляют из себя октамер гистонов, которые представлены двумя копиями гистонов Н_2а, Н_2b, Н₃ и Н₄. Гистоны образуют белковую основу нуклеосомы, сердцевину, на поверхности которой располагается молекула ДНК. Нуклеосома – участок ДНК в комплексе с гистоном, а свободный – линкерный участок.

Тот линейный участок молекулы ДНК, который располагается на гистонах, имеет как правило величину, равную 146 последовательностей нуклеотидов. Количество оборотов составляет 1,75 оборота, а в линкерный участок входит 54 пары нуклеотидов. Линкерный участок более вариабелен. Гистоны формируют между собой электростатические взаимодействия и с помощью электростатических взаимодействий осуществляется связь молекулы ДНК с гистоном. В фибриллах хроматина линкерный участок не является линейным. Продолжается спирализованная структура, которая как бы связывает рядом расположенные нуклеосомы, формируя нить толщиной примерно 30 нм. Укладка этих спиралей происходит за счет положительно заряженных аминокислотных остатков на поверхности гистона с отрицательно заряженными фосфатными группами молекулы ДНК. Новые нуклеосомы возникают со скоростью примерно 3-4 в секунду и такая высокая скорость образования нуклеосом связана с тем, что в момент синтеза ДНК уже имеется готовый пункт гистонов всех классов.

    Гистоновые гены, относящиеся к фракции умеренно повторяющихся последовательностей ДНК, представлены в виде множественных копий для каждого гистона. Во время транскрипции часть нуклеосомных белков остается связанной с ДНК и при прохождении фермента РНК-полимеразы связь с молекулой ДНК не теряется. Такой способ упаковки позволяет сократить общую длину молекулы приблизительно в 6-7 раз.

 

2)  Второй уровень упаковки – 30нм хроматиновое волокно. Способ формирования этого волокна разнообразный. Выделяют несколько типов, например соленоидный тип. Плотно упакованные нуклеосомы первого уровня образуют равномерную спираль с шагом около 10 нм. На один виток такой спирали приходится примерно шесть нуклеосом и возникает фибрилла, которая имеет центральную полость. Считается, что ведущим фактором во втором способе укладки является тот гистон, который отсутствовал в первом уровне. Это гистон Н₁ обеспечивает взаимодействие с соседними нуклеосомами, как бы сближая и притягивая рядом расположенные нуклеосомы. Причем, своей глобулярной центральной частью гистон Н1 присоединяется к нуклеосоме. Одним концом взаимодействует с линкерным участком, а другим – с белками следующей нуклеосомы.

Это сокращает первоначальную длину молекулы почти в 40 раз.

Другим примером формирования волокна является нуклеомерный тип укладки. Здесь тоже ведущий гистон Н₁, причем компактность нуклеомеров зависит от концентрации ионов магния и группируются нуклеомеры как бы блочно по 6-8 штук, а затем существует более длинный линкерный участок. Эта упаковка тоже сокращает молекулу в 40 раз. Компактизация молекулы связана с ограничением функций генетического материала.

В составе 30нм фибриллы хроматин практически недоступен. Резко падает способность хроматина связаться с полимеразой, регуляторными белками, поэтому мы говорим, что при втором уровне упаковки наблюдается инактивация генной активности.

 

3)  Петельная укладка (петлевые домены). Ведущую роль выполняют негистоновые белки. Они составляют 20% от всех белков хроматина. Это сборная группа белков, которая отличается друг от друга по общим свойствам и функциям. 80% этих белков относятся к белкам ядреного матрикса. Они имеют различную молекулярную массу от 5 до 200 кДа. Некоторые белки водорастворимы, часть растворяется в кислотах. Выполняют они функцию регуляторных белков, т.к. стимулируют инициацию транскрипции или ингибируют ее. Ряд белков специфически взаимодействует с определенными последовательностями. Некоторые белки изучены подробно. Их выделяют в группу белков с высокой подвижностью или белков Джонса. Около 5% от всех негистонных белков приходятся на эту фракцию. Они обеспечивают изменения уровня компактизации фибрилл ДНП (дезоксинуклеопротеины). Эти белки делают молекулы более доступными для взаимодействия с ДНК-полимеразой. Изначальная длина молекулы сокращается в 600 раз.

    Очень важно, что размеры отдельных петлевых доменов совпадают с размером средних репликонтов и соответствуют таким образом одному или нескольким генам. В своих основаниях петли ДНК связаны негистоновыми белками ядерного матрикса, в состав которых могут входить как ферменты репликации ДНК, так и транскрипции. Такая петельно-доменная структура хроматина обеспечивает не только структурную его компактизацию, но и организует функциональные единицы хромосом, а именно репликоны и транскрибируемые гены.

 

4)  Четвертый уровень – хромонемный. Собранные в петли молекулы ДНК свертываются в еще более плотную структуру за счет суперспирализации с образованием нитчатой структуры, которая называется Хромонема, которая имеет фиксированную толщину 0,1 – 0,2 мкм. Ведущим фактором суперспирализации или конденсации хромосом является фосфорилирование гистона Н₁, того гистона, который связан между собой нуклеосомой при втором уровне упаковки. В результате последнего четвертого уровня упаковки формируется типичная метафазная хромосома.

    Фосфорилирование гистона Н1 происходит постепенно. Во время еще интерфазы первый раз фосфорилируется гистон Н1 в конце S-периода, второй – в конце G2 периода, а третий раз – в самом начале митоза. Присоединяются 3 остатка фосфорной кислоты.

1.4

Ядрышко.

 

Ядрышки, которые входят в состав ядра, были впервые описаны ученым Фонтана в 1774 году. Ядрышки обнаружены практически во всех ядрах эукариотических клеток. Это более плотная структура на фоне диффузной организации хроматина. Основным компонентом ядрышка является белок. На его долю приходится до 80%. Кроме белка, в составе ядрышка находятся нукленовые кислоты. РНК 5-14%, а ДНК 2-12%. В 30-х годах 20-го века было показано, что возникновение ядрышек всегда привязано к определенным зонам. Эти зоны ученые Мак Клинтон, Нейтс и Навашин назвали ядрышковыми организаторами. Другими словами, это место расположения генов рибосом. Ядрышковые организаторы не являются каким-то точечным локусом, это множественное по своей структуре образование, которое содержит несколько одинаковых генных участков, каждый из которых отвечает за образование ядрышка. В составе геномов эукариот рибосомные гены представлены тысячами единиц. Они принадлежат к умеренно повторяющимся последовательностям ДНК. Часто ядрышковые организаторы локализованы во вторичных перетяжках хромосом. У человека ядрышковые организаторы расположены на коротких плечах некоторых хромосом. Но ядрышко формируется одно.

    Максимальное число ядрышек определяется и числом ядрышковых организаторов. Увеличивается согласно плоидности ядра.

    Характерно, что в клетках разных тканей и таксономической принадлежности преобладает небольшое количество ядрышек. Чаще всего количество ядрышек меньше, чем число организаторов. Это связано с тем, что при новообразовании ядрышка ядрышковые организаторы сливаются в одну общую структуру. Они объединяются в пространстве интерфазного ядра, формируя одно ядрышко  от разных хромосом.

    В ооцитах число ядрышек достигает нескольких сот. Это явление амплификации генов рибосомной РНК. Сверхчисленность. Обычно в соматических клетках число генов в рибосомных РНК постоянно. Оно не меняется в зависимости от уровня транскрипции этих генов. При репликации  ДНК в S-периоде происходит и удвоение числа генов рибосомных РНК, а в половых клетках эти гены подвергаются избыточной репликации с целью обеспечения большого количества рибосом. В результате сверхсинтеза генов рибосомной РНК, их копии становятся свободными кольцевыми молекулами или внехромосомными. Они могут функционировать независимо, и в результате образуется масса свободных дополнительных ядрышек, которые уже структурно не связаны с ядрышкообразующими хромосомами. И количество генов рибосомальной РНК становится почти в 3000 раз больше того, которое приходится на гаплоидной количество рибосомальной РНК.

    Биологический смысл заключается в обеспечении большого количества запасных продуктов, которые используются на ранних стадиях эмбриогенеза и которые в клетке могут быть синтезированы только на дополнительных матриксах амплифицированных ядрышек, поскольку собственный синтез рибосомальных генов у зародыша отсутствует.

    После периода созревания ооцитов дополнительные ядрышки разрушаются. Поэтому репликация рибосомальных генов – временное явление.

 

    В структуре ядрышка выделяют следующие компоненты:

1) Гранулярный компонент;

2) Фибриллярный компонент (представлен фибриллярным центром и плотным компонентом);

3) Хроматин;

4) Белковый матрикс.

 

    Ядрышки построены из гранулярного и фибриллярного компонента и взаимное их расположение различается. Чаще всего гранулярный компонент расположен по периферии ядрышка, а фибриллярный образует ядрышковые нити, толщиной около 100 – 200 нм. Они иногда называются нуклеолонемами. Они не однородны по своему строению в них кроме гранул входит множество новых фибрилл, которые образуют в нуклеолонемах отдельные сгущения.

    Оказалось, что структура и диффузного фибриллярного компонента тоже неоднородна. Было обнаружено, что в ядрышках встречаются фибриллярные центры. Это участки скопления фибрилл с низкой электронной плотностью, окруженные зоной фибрилл более высокой электронной плотности. Эта зона называется плотным компонентом.

    Хроматин ядрышка – околоядрышковый хроматин, который может примыкать к ядрышку и даже окружать его полностью. Часто 30нм фибриллы хроматина заходят между нуклеолонемными участками.

    На срезах мы не можем выделить белковый матрикс в виде отдельного компонента.

    Кроме различной степени выраженности, существуют и другие варианты структурной организации ядрышка.

    Несколько типов ядрышка: 1) ретикулярный или нуклеолонемный 2) компактный 3) кольцевидный 4) остаточный или покоящийся 5) сегрегированный.

    Ретикулярный характерен для большинства клеток. Для него типично нуклеолонемное строение. Фибриллярные центры проявляются плохо, поскольку очень высок уровень транскрипции. Этот тип ядрышек встречается в клетках животных и растений и типичен для политенных хромосом двукрылых.

    Компактный тип отличается меньшей выраженностью нуклеолонемы, большей частотой встречаемости в фибриллярных центрах. Встречается в активно размножающихся клетках, в клетках растительных меристем, в клетках культуры тканей. Предполагают, что первый тип может переходить и наоборот.

    Кольцевидные ядрышки характерны для животных. Имеют форму кольца, которое является фибриллярным центром, окруженным фибриллами и гранами. Размер таких ядрышек около 1 мкм. Типичные кольцевидные ядрышки характерны для эндоцитов, эндоэлеоцитов, т.е. для клеток с низким уровнем транскрипции.

    Остаточные – характерны для клеток, потерявших способность к синтезу рРНК.

    Сегрегированные ядрышки – это клетки, которые подвержены воздействию различных химических веществ, которые вызывают прекращение синтеза в рРНК.

    Термин используется в связи с тем, что происходит обособление разных компонентов ядрышек, сопровождающихся прогрессивным уменьшением его объема. В неактивной форме ядрышковый организатор хромосом представлен в виде одного крупного фибриллярного центра, включающего в себя компактно уложенную часть хромосомной ДНК, в котором находятся друг за другом следующие рибосомные гены. В начале активации ядрышка происходит деконденсация рибосомальных генов на периферии фибриллярного центра. Эти гены начинают транскрибироваться и на них образуются РНП-транскрипты. Эти транскрипты при созревании дают начало предшественникам рибосом, которые скапливаются по периферии активированного ядрышка. По мере усиления транскрипции единый фибриллярный центр распадается на ряд более мелких структур, связанных друг с другом полностью деконденсированными участками ДНК. Чем выше транскрипционная активность ядрышка, тем больше количество мелких связанных друг с другом фибриллярных структур, окруженных плотным фибриллярным компонентом, который содержат предшественники рибосомальных генов 45 S. При полной активации ядрышка все мелкие фибриллярные центры деконденсируются и в этом случае зоны плотного компонента содержат всю рибосомную РНК, которая находится в активном состоянии. В случае инактивации ядрышка происходит постепенная конденсация рибосомальных ДНК, снова образуются фибриллярные центры. Они объединяются друг с другом и величина их растет параллельно уменьшению долей плотного компонента. Такое инактивированное состояние ядрышка сходно по своим структурам с ядрышковым организатором митотических хромосом.

    Ядрышко является непостоянной структурой в клетке. Оно меняет свои свойства и структуру в ходе клеточного цикла. В начале митоза структуры ядрышка слегка уплотняются, а после разрыва ядреной оболочки напротив – теряют плотность, разрыхляются, распадаются на свои структурные составляющие и в виде ядрышкового материала растекаются между конденсированными хромосомами. И поэтому в метафазе и анафазе ядрышки как таковые в клетке отсутствуют. Они находятся в виде матрикса митотических хромосом. Первые признаки новых ядрышек появляются в средней телофазе, одновременно с практически уже деконденсированными хромосомами и с клетками, имеющими новую ядреную оболочку, в виде плотных колец, которые называются предъядрышками. Число их обычно большое. В G1-периоде клеточного цикла предъядрышки растут, объединяются друг с другом их общее число падает, а суммарный объем увеличивается. В G2 и S периодах общий объем ядрышка удваивается.

    Таким образом, в новые дочерние ядра после деления переносятся белковые компоненты, ферменты, что создает условия, необходимые для возобновления синтеза и созревания как рибосом, так и синтеза рРНК. Митотическая хромосома переносит в дочернее ядро не только генетическую информацию в виде ДНК-хроматина, но и необходимое количество синтетического аппарата, готового к активации транскрипции в новом клеточном цикле. И эти необходимые компоненты находятся в виде матрикса на митотических хромосомах.

 

Функции ядрышка:

1)  синтез рРНК;

2)  Участие в созревании информационных РНК;

3)  Участие в созревании транспортных РНК;

4)  В ядрышках образуются типы РНК, входящие в состав srp-частицы рибосом;

5)  В ядрышке осуществляется синтез переносчика протонов никотинамидадениндинуклеотид.