цитологические исследования в кдл. цитологические исследования. Цитологические исследования Цитология
 Скачать 168.52 Kb.
|
|
Цитологические исследования Цитология – одна из самых молодых наук. Возникновение цитологии определено созданием и развитием оптических линз и сконструированного на базе этих линз микроскопа. Цитология изучает клетки многоклеточных организмов, ядерно-цитоплазматические комплексы, которые не расчленены на клетки, симпласты, плазмодии, синцитии, а так же одноклеточных животных, растений и бактерий. В развитии цитологии выделяют три этапа: 1) XVII – конец XIX в. Период накопления фактов клеточного строения. 1665 год. Р. Гук вводит термин «клетка». 1672 год. Грю, Мальпиги на различных объектах повторяют опыты Гука. В конце XVII века цитология начала становиться. Антон ван Левенгук сконструировал примитивный микроскоп, дававший увеличение в 40 раз. Открыл в 1674 году эритроциты в клетках крови земноводных. 1675 год – одноклеточные растительные организмы. 1683 год – описал бактерии. «Пустота или воздушное пространство в оболочке» - первое определение клетки. Во второй половине XVII века Левенгук подарил Петру I два микроскопа. Тот заинтересовался и в 1698 году собрал русских мастеров для конструирования своего микроскопа. Род Беляевых создавал стекла для микроскопов. В результате исследований в начале XIX века ряда ученых (Линк, Ламарк, Гербель, Курпен, Расспай, Пуркинье) утвердился взгляд на клетки как структурные единицы живого организма. В 1838 году ботаник Шлейден и зоолог Шванн в 1839 году сформулировали первую клеточную теорию. Благодаря этой теории сформулировалось представление, что функции организма в целом слагаются из активностей и взаимодействия отдельных клеточных единиц. В 1855 - 1858 году немец Вирхов, патологоанатом, применил клеточную теорию на своих объектах и доказал, что каждая клетка образуется в результате деления исходной клетки, а организмы образуются в результате слияния двух клеток, мужской и женской. 1831 Броун открыл ядро, описал его как важнейший и обязательный органоид клетки. Была изучена протоплазма клетки, и первоначальное понятие о клетке превратилось в представление о массе протоплазмы, ограниченной в пространстве клеточной оболочкой и содержащей ядро. Конденсор – многолинзовая система, которая улавливает и направляет лучи света на объект. 1850 – масляный иммерсионный объектив (позже водный). 1873 год – линза-конденсор, собирающая и направляющая линза микроскопа. Были открыты органоиды: 1876 год – клеточный центр (Эдуард ванн Бенеден, Бовери); 1898 – митохондрии (Бенда и Альтман в животной клетке, Мевес – в растительной клетке); 1898 – аппарат Гольджи, открыл Камилло Гольджи. Были открыты явления: Прямое деление бактерий; Амитоз, прямое деление клетки (Ремак); Митоз, непрямое деление (Флеминг; Страсбургер); Описаны главные особенности митоза – формирования хромосом (1890, Вальдейер). Создана теория индивидуальности хромосом. Гертвиг опубликовал монографию «Клетка и ткани» (1892).В ней были обобщены все биологические явления, исходя из характерных свойств, строения и функций клетки. Монография подвела черту первому этапу развития цитологии. 2) Конец XIX века – 20-е годы XX века. Дальнейшее совершенствование техники. Кроме светлопольного конденсора был предложен темнопольный конденсор. С помощью этого прибора можно было исследовать объекты при боковом освещении. Эффект Тиндаля – видим пылинки в луче света. Был также сконструирован поляризационный микроскоп, который позволял определять ориентацию частиц в клетке. 1903 год – сконструирован ультрафиолетовый микроскоп. 1932 год – фазово-контрастный микроскоп (позволил преобразовать фазовые сдвиги в амплитудные, что позволило смотреть бесцветные структуры) и интерференционный микроскоп. Метод выявления ДНК. Фельген, Россенбек 1924 год Создаются микроманипуляторы, с помощью которых можно было производить разнообразные операции. В 1909 году Гаррисон положил начало созданию метода культуры ткани. 3) В первые два десятилетия 20-го века все усилия были направлены на выяснения функций клеточных структур. Но это стало возможным только тогда, когда в 20-х годах сконструировали электронный микроскоп и появились методы рентгеноскопического анализа. Создания этого микроскопа открыло третий этап в развитии цитологии – современный. Использование электронного микроскопа привело к открытию субмикроскопической морфологии клетки. Разрешающая способность микроскопа – наименьший диаметр видимых частиц. Разрешение микроскопов: Световой микроскоп – не менее 0,2мкм. Электронный – 0,2 нм Были обнаружены неизвестные детали строения клетки. Изучено строение плазматической мембраны. Изучено строение сети мембран – ЭПР. Были изучены лизосомы (гидролитические ферменты), пероксисомы, содержащие фермент каталазу и уринокиназу. Изучено строение рибосом. Открыт цитоскелет (микротрубочки, микрофиламенты, промежуточные филаменты). Сформулировались первые задачи цитологии: 1) Изучить ультрамикро структуры клетки 2) Изучить функции клеточных структур и их взаимодействие; 3) Изучить способы проникновения веществ в клетку, выведения их из клетки, роли мембран; 4) Реакция клеток на нервные и гуморальные стимулы, как окружающей среды, так и внутри; 5) Изучить взаимодействие клеток; 6) Изучить реакцию на повреждения, репродукцию клеток и клеточных структур и апоптоз (запрограммированная гибель клеток). В зависимости от объектов и методов цитология включает в себя: кариосистематику, цитоэкологию, радиоцитологию, онкологию, иммуноцитологию, цитогенетику. Современные положения клеточной теории: 1) Клетка - основная единица строения и развития всех живых организмов. Наименьшая единица живого. 2) Клетки всех организмов сходны по своему строению, химическому составу, основным проявлениям жизнедеятельности и обмену веществ. 3) Размножение клеток происходит путем их деления. Каждая новая клетка образуются в результате деления исходной клетки. 4) В сложных многоклеточных организмах клетки специализированны и образуют ткани. Из тканей состоят органы, которые тесно связаны между собой и подчинены нервным и гуморальным механизмам регуляции. 5) Клетки многоклеточных организмов тотипотентны (обладают генетическим потенциалом всех клеток данного организма). Клетка – ограниченная активной мембраной, упорядоченная структурированная система биополимеров, участвующих в единой совокупности метаболических и энергетических процессов, осуществляющих поддерживание и воспроизведение всей системы в целом. Клетка – открытая система. Обмен с внешней средой потоками веществ, информацией и энергией. Методы цитологического исследования: 1) Непосредственное наблюдение живых клеток в организме (витальный) или в свежевыделенной ткани (суправитальный). 2) Наблюдение клеток убитых с помощью фиксации, которая сохраняет морфологическую и химическую структуру. После фиксации любой материал подвергают окрашиванию. Красители – натуральные и синтетические. Синтетические – кислые и основные. Основные - соли красящих оснований, содержащие аминогруппы, монометиламиногруппы, иминогруппы. Эти группы определяют щелочность красителей. Попадая внутрь клетки, эти группы образуют солевые связи с кислотами, находящимися в структуре клетки, что приводит к их окрашиванию. Кислотные группы клетки - базофильные. Кислые красители – красящие кислоты или их соли (эозин, пикриновая кислота, азокармин и др.). Кислотные свойства придают нитрогруппы, гидроксильные, карбоксильные группы. Структурные компоненты – ацитофильные или оксифильные. Широкое распространение получило гистохимическое или цитохимическое окрашивание, которое подразделяется на прямое и косвенное. К прямым методам относят приемы, специфичные для вещества, которые хотят определить. Выявление ДНК – с реактивом Шиффа. Чтобы обнаружить активность фермента, используют непрямой гистохимический способ или метод ферментативного переваривания. Для этой цели клетки помещают в среду, содержащую субстрат для данной ферментативной реакции и реагенты, связывающие специфически с конечными продуктами реакций. Краситель Азур связывает и окрашивает цитоплазму, ядро и ядрышко. Предварительная обработка клетки ферментом РНК-азой приводит к тому, что цитоплазма и ядрышко будет окрашиваться слабо, а ядро не изменится в своей окраске. Если же клетку предварительно обработать ДНК-азой, то почти полностью исчезнет окрашивание структур ядра. На современном этапе особое значение имеют точные способы выявления структур – иммунохимические методы. Это реакции с использованием флуоресцентных антител. Для этого на белок, который хотят определить, получают специфическую сыворотку. В сыворотке содержатся антитела, их соединяют с флуоресцентными красителями. Затем, меченый белок вводят в клетку. Таким образом был открыт цитоскелет. Метод фракционирования или дифференциального замещения. 1) Сначала получают чистые клетки, разрушая ткань в гомогенизаторах. 2) Полученную суспензию (гомогенат) подвергают высокоскоростному центрифугированию. Крупные компоненты (ядра или неразрушенные мембранные структуры) оседают при низких скоростях 1-3 тыс.J. 3) При более высоких скоростях (15-30 тыс.) оседают более мелкие макросомы (митохондрии, пластиды, лизосомы, нервные окончания). 4) Более 50 тыс. – микросомы. 15-20% от общей массы. Имеют сложный химический состав. ЭПР, вакуоли. 5) При скорости 150 тыс. – в осадок выпадают рибосомы, вирусы, крупные макромолекулы. С помощью раствора сахарозы получают более высокую степень разделения. Плотность раствора постепенно увеличивается сверху вниз, образуя градиент плотности. Гомогенат клеток наслаивают поверх сахарозы, затем центрифугируют и органоиды клетки распределяются в зависимости от своей молекулярной массы по высоте градиента, образуя отдельные полосы, которые можно выделить и изучить. ЛЕКЦИЯ: Химический состав клетки Все вещества делят на макроэлементы (98% - H, O, C, N), микроэлементы (2-3% - Mg, Na, Ca, Fe, S,P, Cl) и ультрамикроэлементы (0,1% - Zn, Cu, I, F, Mn, Co, Si). Находятся элементы в виде ионов или компонентов молекул неорганических и органических веществ. Неорганические (минеральные) вещества – относительно простые соединения, которые встречаются как в живой, так и в неживой природе. Органические вещества – многообразные соединения углерода, которые синтезируется преимущественно живыми организмами (углеводы, белки, липиды, нуклеиновые кислоты). Органические вещества в клетке подразделяются на углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. Основу органических веществ составляют атомы углерода, способные вступать друг с другом в ковалентные связи и образовывать самые разнообразные классы органических молекул. В зависимости от массы и структуры различают малые низкомолекулярные органические молекулы (мономеры) и высокомолекулярные (полимеры). Мономеры служат блоками полимеров. Свойства полимеров зависят от числа, состава, последовательности мономеров. Состав, число и последовательность мономеров определяют различные свойства органических веществ и определяют многообразие живых организмов. Органические составляющие клетки Углеводы – сложные соединения, представленные атомами углерода и водой. Содержание углеводов различается в животных и растительных клетках. В растительных – 70%, в животных 1-5%. Подразделяются на три класса: моносахариды, олигосахариды, полисахариды. Моносахариды – бесцветные твердые кристаллические вещества, хорошо растворимые в воде, имеющие сладкий вкус. В зависимости от числа атомов углерода различают триозы, тетрозы, пентозы, гексозы и гептозы. Наиболее распространены пентозы и гексозы, которые являются основными источниками энергии в клетках. (1г. глюкозы при полном окислении = 17,6 кДж) Пентозы входят в состав нуклеиновых кислот (рибоза, дезоксирибоза). При взаимодействии двух или нескольких мономеров образуются ди- или олигосахара. Соединяются между собой моносахариды гликозидной связью. Самые известные дисахариды: мальтоза – солодовый сахар (2 глюкозы), лактоза - молочный сахар (галактоза, глюкоза), сахароза – свекольный сахар (глюкоза, фруктоза). Полисахариды – полимеры. Характеризуются высокой молекулярной массой. У них нет сладкого вкуса, плохо растворяются в воде. Являются биополимерами, выполняют важнейшие функции в клетки: запасание и защита. Производные глюкозы (крахмал, гликоген) используются клетками для хранения энергии. Целлюлоза и хитин обеспечивают прочность покровных структур. С углеводами могут вступать в связь белки (гликопротеин), липиды (гликолипиды). Эти вещества обеспечивают рецепторную функцию клетки, контактную функцию клетки. Кроме того, все углеводные компоненты выполняют структурную функцию. Функции углеводов: 1) Важнейший источник энергии; 2) Запасающая (удобная форма хранения энергии); 3) Защитная функция; 4) Структурная функция; 5) Рецепторная функция. Липиды Не растворяются в воде, растворяются в неполярных растворителях. Обнаруживаются во всех клетках без исключения, выполняют важнейшие специфические функции. Находясь внутри клеток, липиды подразделяются на нейтральные жиры или триацил-глицерины, воска, фосфолипиды, стероиды. Для большинства липидов характерно наличие в их составе жирных кислот. Нейтральные жиры – многоатомные спирты, эфиры трехатомного спирта глицерина и трех молекул жирных кислот. Жирные кислоты являются источником энергии. При окислении одного грамма жирных кислот освобождается 37 кДж и 1,2г чистой эндогенной воды. При этом синтезируется в два раза больше молекул АТФ, чем при расщеплении глюкозы. Воска – сложные жиры, которые образуются жирными кислотами и другими многоатомными спиртами. Как правило, секретируются кожными железами, выполняют защитную предохранительную функцию, обеспечиваю водоотталкивающие свойства производным кожи. Листья и плоды у растений защищены восковым налетом. Фосфолипиды – в состав этих эфиров входит остаток фосфорной кислоты. Это основной компонент клеточных мембран. Стероиды – особая группа липидов, которая не содержит жирных кислот. Имеется особая структура – стероидное кольцо (циклическое строение). Стероидами являются половые гормоны. Стероидную природу имеет важнейший компонент мембран – холестерин. Белки Биологические гетерополимеры, мономерами которых являются аминокислоты. Все аминокислоты имеют как минимум одну аминогруппу (NH2),одну карбоксильную группу (СООН) и радикал. Между аминогруппой одного кислотного остатка и карбоксильной группой другого остатка формируется пептидная связь, которая обеспечивает соединение огромного количества кислот в белки. Все белки присутствуют в организме в свободной форме и обладают высокой биологической активностью. Все белки делятся на простые (только из аминокислот) и сложные (соединения с другими группами веществ, углеводами, липидами). Гормоны, антибиотики, ядовитые токсичные вещества – все это белки. Белки отличаются числом, составом, последовательностью аминокислотных остатков. 1) Последовательность аминокислот в составе полипептидной цепи представляет первичную структуру белка и определяется последовательностью нуклеотидов в участке молекулы ДНК, кодирующей этот белок. 2) Вторичная структура имеет вид спирали и возникает в результате образования водородных связей (между карбоксильной группой одной АМК и аминогруппой другой АМК). 3) Третичная (глобулярная) структура образуется в результате сложной пространственной ориентации молекулы белка. Возникают дисульфидные связи, ионные и гидрофобные. 4) Четвертичную структуру имеют только некоторые белки. Это сложный комплекс, состоящий из нескольких третичных структур. Удерживается ионными, водородными и гидрофобными связями. Изменение структуры белка связано с изменениями свойств белка – денатурация (обратное восстановление – ренатурация). Денатурация бывает обратимая (если не затрагивает первичной структуры) и необратимая. Белки выполняются практически все функции в клетке. 1) Все ферменты – белки (но не все белки – ферменты!). Ферменты – катализаторы определенных химических реакций и каждая реакция требует своего катализатора и имеет его. Отсутствие хотя бы одного фермента приводит к накоплению субстрата. 2) Структурная (строительная) функция. Белки являются компонентами мембран и органоидов. 3) Функция перемещения. Двигательные белки – актин, миозин. Основной белок микротрубочек – тубулин. 4) Транспортная функция. Они могут связывать и переносить специфические молекулы и ионы из одного органоида в другой и из одной клетки в другую и из клетки во внешнюю среду. 5) Запасающая функция (в молоке млекопитающих). 6) Белки могут выполнять защитную функцию, обеспечивая защиту от вторжения чужеродных антигенов и организмов. Такие белки называются антителами. 7) Регуляторная функция. Гормоны регулируют обмен веществ. Упаковка ДНК (гистонами). 8) Энергетическая функция (редко). 1г белка = 17.6 кДж. Нуклеиновые кислоты 5% сухой массы в клетке. Представлены мононуклеотидами и полинуклеотидами. Мононуклеотид состоит из трех частей: 1) азотистое основание. 2) пятиуглеродный сахар (пентоза) 3) остатки фосфорной кислоты. Азотистые основания делятся на два вида: пуриновые (аденин, гуанин) и пиримидиновые (цитозин, тимин и урацил). Пятиуглеродный сахар: рибоза и дезоксирибоза. Остатки фосфорной кислоты. Название приобретают по виду азотистого основания и пентозы. В зависимости от числа фосфатных групп бывают монофосфаты, дифосфаты и трифосфаты. Мононуклеотиды выполняют энергетическую функцию; являются переносчиками химических молекул; являются мономерами для сборки полинуклеотидов Полинуклеотиды: ДНК и РНК. Это линейные полимеры. Соединяются мононуклеотиды ковалентными фосфодиэфирными связями. Образуются гидроксильной группой пентозы одного нуклеотида и фосфатной группой следующего нуклеотида. Образующиеся полинуклеотидные цепи формируют сахарофосфатную основу, на которой располагаются четыре вида азотистых оснований. Полинуклеотидные цепи ДНК и РНК отличаются друг от друга размером, видом и набором азотистых оснований. РНК содержит рибозу, одно из четырех азотистых основания (А, Г, У, Ц) и остаток фосфорной кислоты. ДНК содержит дезоксирибозу, одно из четырех азотистых основания (А, Г, Т, Ц) и остаток фосфорной кислоты. Практически у всех живых организмов ДНК имеет двуцепочечное строение. Эти две полинуклеотидные цепи антипараллельно направлены и ориентированы таким образом, что их сахарофосфатные остовы располагаются снаружи, а азотистые основания внутри образующихся петель. Основания комплементарны друг другу (А—Т, Ц---Г). Между ними водородные связи. Параметры ДНК: 1) Ширина – 2 нанометра; 2) Шаг спирали 3,4 нанометра и содержит 10 пар комплементарных нуклеотидов. 3) ДНК обладает уникальным свойством: способностью к самоудвоению (репликация). Под действием ферментов в точках репликации разрываются водородные связи, спираль раскручивается, служит матрицей для синтеза дочерних ДНК. Фермент – ДНК-полимераза. Скорость репликации неодинакова. 1-ая цепь – лидирующая, 2-ая – фрагментальная. ДНК-лигаза (фермент) сшивает цепи. Каждая хроматида содержит 2 цепочки (материнскую и дочернюю). Полуконсервативный способ (полное воспроизведение информации). 4) Способность к самовосстановлению (репарация). Осуществляют 20 репарационных ферментов, которые узнают измененные участки ДНК, удаляют их из цепи, восстанавливают правильную последовательность. Функции ДНК: 1) Записывает генетическую информацию; 2) Хранит генетическую информацию; 3) Воспроизводит генетическую информацию; 4) Передает дочерним клеткам. |