Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
 Скачать 9.74 Mb.
|
ГЛАВА 1. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 | Рис. 1.1. Основные этапы биотехнологического процесса. Термин был введен Карлом Эреки и относился к крупномасштабному получению свинины (конечный продукт) с использованием дешевой сахарной свеклы (сырье) в качестве корма для свиней (биотрансформация). |
и встала на прочный фундамент микробиологии, биохимии и химической инженерии.
Промышленный биотехнологический процесс, в котором для производства коммерческих продуктов используются микроорганизмы, обычно состоит из трех ключевых этапов (рис. 1.1.).
1. Исходная обработка: обработка сырья таким образом, чтобы его можно было использовать как источник питательных веществ для микроорганизма-мишени.
2. Ферментация и биотрансформация; рост микроорганизма-мишени в большом (обычно более 100 л) биореакторе (ферментация) с последующим образованием нужного метаболита, например антибиотика, аминокислоты или белка (биотрансформация).
3. Конечная обработка: очистка нужного вещества от компонентов культуральной среды или от клеточной массы.
Целью биотехнологических исследований является максимальное повышение эффективности каждого из этих этапов и поиск микроорганизмов, с помощью которых можно получить нужные вещества (пищевые добавки, антибиотики и т. д.). В 60—70-е годы все эти исследования касались только исходной обработки, устройства биореакторов и получения конечного продукта. Благодаря этому был усовершенствован инструментальный контроль процесса ферментации и значительно расширены возможности крупномасштабного культивирования, что позволило повысить эффективность производства некоторых продуктов.
Наиболее трудным для оптимизации был этап биотрансформации. Когда использовались природные микробные штаммы, выход конечного продукта часто оказывался намного ниже оптимального. Поэтому предпринимались попытки изменить генетическую конституцию существующих штаммов-продуцентов с помощью химического мутагенеза или ультрафиолетового облучения. При таком подходе уровень повышения продукции обычно лимитировался чисто биологическими факторами. Например, если мутантный штамм синтезировал слишком много того или иного вещества, часто это отрицательно влияло на прочие метаболические процессы и приводило к угнетению роста культуры при крупномасштабном культивировании. Несмотря на это традиционные стратегии «индуцированного мутагенеза и селекции», направленные на усовершенствование штамма-продуцента, были исключительно плодотворны для многих процессов, например для производства антибиотиков.
Традиционные схемы генетического усовершенствования бактерий включают скрининг, отбор и тестирование огромного количества колоний, поэтому такие схемы высокозатратны и занимают много времени. Более того, при этом можно рассчитывать только на усовершенствование уже существующих, переливаемых по наследству свойств штамма, а не на расширение его генетических возможностей. И все же к концу 70-х годов таким образом были усовершенствованы производственные процессы получения целого ряда продуктов.
I8 ГЛАВА 1
С развитием технологии рекомбинантных ДН К природа биотехнологии изменилась окончательно и бесповоротно. Появилась возможность оптимизировать этап биотрансформации более прямым путем, создавать, а не просто отбирать высокопродуктивные штаммы, использовать микроорганизмы и эукариотические клетки как «биологические фабрики" для производства инсулина, интерферона, гормона роста, вирусных антигенов и множества других белков. Технология рекомбинантных ДНК позволяет получать в больших ко-личествах ценные низкомолекулярные вещества и макромолекулы, которые в естественных условиях синтезируются в минимальных количествах. Растения и животные стали естественными биореакторами, продуцирующими новые или изме-
ненные генные продукты, которые никогда не могли бы быть созданы методами мутагенеза и селекции или скрещивания. Наконец, эта новая технология способствует развитию принципиально новых методов диагностики и лечения различных заболеваний.
На стыке технологии рекомбинантных ДНК и биотехнологии возникла новая область исследований, динамичная и высококонкурентоспособная, - молекулярная биотехнология. Эта молодая дисциплина, как и молекулярная биология в период своего становления, весьма амбициозна, заявляемые ею притязания не всегда соответствуют реальным возможностям. Ее стратегия и экспериментальная база претерпевают быстрое изменение, одни подходы все время вытесня-
| Таблица 1.1. История развития молекулярной биотехнологии | |
| Дата | Событие |
| 1917 | Карл Эреки ввел термин «биотехнология" |
| 1943 | Произведен пенициллин в промышленном масштабе |
| 1944 | Эвери. МакЛеод и МакКарти показали, что генетический материал представляет собой ДНК |
| 1953 | Уотсон и Крик определили структуру молекулы ДНК |
| 1961 | Учрежден журнал "Biotechnology and Bioengineering" |
| 1961-1966 | Расшифрован генетический код |
| 1970 | Выделена первая рестрицирующая эндонуклеаза |
| 1972 | Корана и др. синтезировали полноразмерный ген тРНК |
| 1973 | Бойери Коэн положили начало технологии рекомбинантных ДНК |
| 1975 | Колер и Мильштейн описали получение моноклональных антител |
| 1976 | Изданы первые руководства, регламента руюшие работы с рекомбинантными ДНК |
| 1976 | Разработаны методы определения нуклеотндной последовательности ДНК |
| 1978 | Фирма Genentech выпустила человеческий инсулин, полученный с помощью E. coli |
| 1980 | Верховный суд США, слушая дело Даймонд против Чакрабарти, вынес вердикт, что микроорганизмы, полученные генноинженерными методами, могут быть запатентованы |
| 1981 | Поступили в продажу первые автоматические синтезаторы ДНК |
| 1981 | Разрешен к применению в США первый диагностический набор моноклональных антител |
| 1982 | Разрешена к применению в Европе первая вакцина для животных, полученная по технологии рекомбинантных ДНК |
| 1983 | Для трансформации растении применены гибридные Ti-плазмиды |
| 1988 | Выдан патент США на линию мышей с повышенной частотой возникновения опухолей, полученную генноинженерными методами |
| 1988 | Создан метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) |
| 1990 | В США утвержден план испытаний генной терапии с использованием соматических клеток человека |
| 1990 | Официально начаты работы над проектом «Геном человека» |
| 1994-1995 | Опубликоованы подробные генетические и физические карты хромосом человека |
| 1996 | Ежегодный объем продаж первого рекомбинантного белка (эритропоэтина) превысил 1 млрд. долларов |
| 1996 | Определена нуклеотидная последовательность всех хромосом эукаристического микроорганизма (Saccharomycescerevisiae) |
| 1997 | Клонировано млекопитающее из дифференцированной соматической клетки |
Mолекулярно-биотехнологическая революция 19
 |
| Рис. 1.2. Молекулярная биотехнология использует достижения многих областей науки и позволяет создавать широкий ассортимент коммерческих продуктов и методов. |
ются другими. Но несомненно одно: в будущем молекулярная биотехнология станет рутинным методом создания живых систем, обладающих новыми функциями и возможностями.
Очень редко новые научные дисциплины возникают «на пустом месте»; как правило, их фундаментом служат различные области науки. Что касается молекулярной биотехнологии, то ее биотехнологическая составляющая относится к сфере промышленной микробиологии и химической инженерии, а молекулярная — к областям молекулярной биологии, молекулярной генетики бактерий и энзимологии нуклеиновых кислот (табл. 1.1). В широком смысле молекулярная биотехнология пользуется достижениями самых разных областей науки и применяет их для создания самых разных коммерческих продуктов (рис. 1.2).
Коммерциализация молекулярной биотехнологии
Конечной целью всех биотехнологических исследований является создание коммерческого продукта. Следовательно, молекулярная биотехнология тесно связана с экономикой. Конечно, сейчас ее развитие обусловливается не только экономическими факторами, однако на первых порах ажиотаж вокруг этой молодой науки был связан с возможностью получения прибыли. К вечеру 15 октября 1980 г. основные держатели акций фирмы Genentech стали обладателями миллионных состояний, и это побудило очень многих людей к энергичным действиям. В период 1980—1983 гг. в Соединенных Штатах было создано около 200 мелких биотехнологических компаний; этому способствовали введение налоговых льгот, высокие прибыли от операций с ценными бумагами и заинтересованность частных вкладчиков. Вслед за Гербертом Бойером, который вначале был научным сотрудником Калифорнийского университета в Сан-Франциско, а затем стал вице-президентом фирмы Genentech, многие университетские профессора открыли собственные компании.
К 1985 г. в Соединенных Штатах было уже более 400 биотехнологических фирм; многие из них включили в свое название слово «ген», чтобы заявить о принадлежности к генноинженерному «цеху»: Biogen, Amgen, Calgene, Engenics, Genex, Cangene. На сегодняшний день в США свыше 1500 биотехнологических компаний, а во
20 ГЛАВА 1
всем мире их более 3000. Кроме того, большой вклад в развитие молекулярной биотехнологии внесли все крупные международные химические и фармацевтические компании, в том числе Monsanto, Du Pont, Upjohn, American Cyanamid, Eli Lilly, SmithKline Beecham, Merck, Novartis, Hoffman-LaRoche. В период бурного развития биотехнологического бизнеса в 80-е годы мелкие компании поглощались крупными, образовывались совместные предприятия. Например, в 1991 г. 60% акций компании Genentech было продано фирме Hoffmann-LaRoche за 2,1 млрд. долларов. В то же время многие компании обанкротились. Такая мобильность — характерная особенность биотехнологической индустрии.
К середине 90-х годов на рынке появилось более десятка новых биотехнологических лекарственных препаратов, более 100 препаратов сейчас проходят клинические испытания, еще свыше 500 находятся на стадии разработки. Создано и выпущено на рынок множество новых молеку-лярно-биотехнологических продуктов, повышающих урожайность сельскохозяйственных культур и продуктивность сельскохозяйственных животных. Ежегодный доход молекулярно-био-технологической индустрии увеличился с 6 млн. долларов в 1986 г. до примерно 30 млрд. в 1996 г. По оценкам, к 2000 г. объем продаж продуктов, изготовленных с применением молекулярной биотехнологии, превысит 60 млрд. долларов в год. И хотя в целом доходность биотехнологического бизнеса оказалась не такой высокой, как ожидалось, энтузиазм инвесторов не ослабевает и свидетельствует о том, что молекулярная биотехнология — по крайней мере по их представлениям — имеет блестящие перспективы.
Все новые независимые молекулярно-био-технологические компании узкоспециализированы, что часто находит отражение в их названии. Например, вслед за компаниями, занимающимися клонированием генов, в США появились компании, выпускающие полученные генноинженерными методами антитела, которые предназначены для лечения инфекционных заболеваний, рака и других болезней человека: Immunex, ImmuLogic, ImmunoGen, Immunomedics, Medlmmune, Immune Response.
Большая часть коммерческих разработок в области молекулярной биотехнологии приходится на Соединенные Штаты. В других странах, где инвестиционный климат не столь благоприятен и бизнес менее активен, главную роль в создании молекулярно-биотехнологических предприятий играют крупные корпорации и государство. Так, правительство Японии объявило биотехнологию «стратегической индустрией» и национальным приоритетом. За дело взялись крупные японские корпорации. Вначале им не хватало собственных кадров, и первые исследования проводились в сотрудничестве с американскими университетами и компаниями. Сейчас эти корпорации приобрели необходимый опыт и сами проводят молекулярно-био-технологические разработки и создают генноинженерные продукты.
Европейская биотехнологическая индустрия тоже неуклонно развивается: к 1995 г. в странах Европы было создано более 600 биотехнологических компаний. В экономически менее развитых странах роль «локомотива» в развитии национальной молекулярно-биотехнологической индустрии взяло на себя государство. Стимулом здесь служила уверенность в том, что молекулярная биотехнология — «самая революционная из всех технологий XX века». Ни одна страна не хотела оказаться лишенной всех тех благ, которые сулило ее развитие.
Сейчас, в конце второго десятилетия своего развития, молекулярная биотехнология фактически стала одной из отраслей промышленности, хотя вначале некоторые ученые считали ее чисто эзотерическим направлением. Без сомнения, в ближайшие десять лет коммерческую молекулярную биотехнологию ожидает бурный рост, но именно поэтому давать какие-то конкретные прогнозы здесь весьма рискованно,
Надежды и опасения
С молекулярной биотехнологией человечество связывают самые большие надежды:
• возможность точной диагностики, профилактики и лечения множества инфекционных и генетических заболеваний
• значительное повышение урожайности сельскохозяйственных культур путем создания
Молекулярно-биотехнологическая революция 21
 | |
Создание функциональных бактериальных плазмид in vitroS.N. Cohen, A.C.Y. Chang, H.W. Boyer, R.B. Helling Рroc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 3240-3244, 1973 | |
| Отсчет истории технологии рекомбинантных ДНК ведется с работы Коэна и др., которые показали, как, объединив генетические элементы из разных источников, можно создать новую реплицирующуюся генетическую структуру. Эту структуру Коэн и др. получили из автономно существующих в бактериальной клетке внехромосомных генетических элементов, называемых плазмидам и. В своей предыдущей работе (Cohen, Chang. Proc. Natl. AcadSci. USA 70: 1293-1297, 1973) авторы получили маленькую плазмиду из более крупной природной, отрезал от последней случайные фрагменты и вводя их смесь в клетки E. coli. Один из та-ких фрагментов размером около 1/10 размера исходной плазмиды «прижился» в бактериальной клетке как функционирующая плазми-да Чтобы исключить фактор случайности, присущий подобному подходу, и сделать процесс манипулирования генетическим материалом более управляемым, Коэн и др. решили использовать фермент (рестрицирующую эндонуклеазу), который расщепляет молекулу ДНК в строго определенном месте с образованием фрагментов с выступающими концами (липкими концами). Фрагменты разных молекул ДНК, обработанных одним и тем же ферментом, имели одинаковые липкие концы и при отжиге соединялись. Таким образом, если расщепить ДНК из равных источников одной и той же рестрицирующей эндонуклеа-зой, а затем смешать фрагменты, то образуются новые комбинированные молекулы ДНК, не существовавшие прежде. Коэн и др. не только смогли перенести ген из одной плазмиды в другую, но и показали, что этот ген остается биологически активным. К их чести, они в полной мере осознали, что данная стратегия «позволяет внедрять специфические нуклеотидные последовательности прокариотической или эукариотической хромосомы или внехромосомной ДНК в независимо реплицирующуюся бактериальную плазмиду. Другими словами, любой ген, взятый из любого организма, теоретически можно встроить в плазмиду, которая будет размножаться в клетке-хозяине, и при этом, возможно, будет синтезироваться белок, кодируемый клонированным геном. Проиллюстрировав возможность клонирования генов, Коэн и др. создали экспериментальную базу для технологии рекомбинантных ДНК, показали, что плазмиды могут служить носителями и векторами клонированных генов. Последующие работы очень скоро привели к созданию более сложных векторов и стратегий клонирования. Все это вызвало серьезную озабоченность относительно безопасности и этичности подобных экспериментов, и чтобы снять обеспокоенность общественности, были разработаны официальные инструкции и соз-даны правительственные органы, регламентирующие работы с рекомбинантными ДНК. Завершал перечень тех последствий, к которым привела публикация работы Козна и др., отметим, что она самым непосредственным образом повлияла на становление молекулярно-биотехнологической индустрии. | |
растений, устойчивых к вредителям, грибковым и вирусным инфекциям и вредным воздействиям окружающей среды
• создание микроорганизмов, продуцирующих различные химические соединения, антибиотики, полимеры, аминокислоты, ферменты
• создание пород сельскохозяйственных и других животных с улучшенными наследуемыми признаками
• переработка отходов, загрязняющих окружающую среду.
Обсуждать все блага, которые нас ожидают, легко и приятно, но одновременно нельзя забывать о последствиях, к которым может привести столь бурное развитие молекулярной биотехнологии. Эта новая отрасль раскинула свои сети так широко, что общество вправе получить ответы на свои вопросы:
• не будут ли организмы, полученные методами генной инженерии, оказывать вредное воздействие на другие живые организмы или на окружающую среду?
• не приведет ли создание и распространение генетически модифицированных организмов к уменьшению природного генетического разнообразия?
• правомочно ли, используя генноинженерные методы, изменять генетическую природу человека?
22 ГЛАВА I
• не нарушит ли применение новых диагностических методов прав человека на неприкосновенность частной жизни?
• следует ли патентовать животных, полученных генноинженерными методами?
• не будет ли активное финансирование молекулярной биотехнологии сдерживать развитие других важных технологий?
• не приведет ли стремление к получению максимальной прибыли к тому, что преимуществами молекулярной биотехнологии смогут воспользоваться только состоятельные люди?
• не нанесет ли молекулярная биотехнология ущерб традиционному сельскому хозяйству?
• не вытеснят ли подходы к лечению, основанные на достижениях молекулярной биотехнологии, традиционные, столь же эффективные методы лечения?
• не помешает ли борьба за приоритеты свободному обмену идеями между учеными?
Эти и многие другие вопросы рассматривают правительственные комиссии, активно обсуждают на конференциях и в научных публикациях ученые, о них глубокомысленно рассуждают авторы популярных изданий. Нa этой широчайшей основе были сформулированы соответствующие правила и инструкции, написаны руководства и выработаны политические решения. В этом принимали участие и ученые, и общественность, но некоторые противоречия все же остались.
За рекордно короткое время молекулярная биотехнология превратилась в многопрофильное научное предприятие, в равной степени коммерческое и академическое. Ей посвящено огромное количество научных и деловых публикаций, в университетах всего мира студентам и аспирантам читают учебные курсы по молекулярной биотехнологии. Об энтузиазме, с которым написан отчет Отдела по оценкам новых технологий США за 1987 г., свидетельствует следующее заявление: «Молекулярная биотехнология знаменовала собой еще одну революцию в науке, которая могла бы изменить жизнь и будущее... людей так же радикально, как это сделала Промышленная революция два века назад и компьютерная революция в наши дни. Возможность целенаправленного манипулирования генетическим материалом... обещает великие перемены в нашей жизни».
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В 1973 г. Стэнли Коэн и Герберт Бойер с сотрудниками разработали способ переноса генетической информации из одного организма в другой. Этот метод, получивший название технологии рекомбинантных ДНК, позволил ученым выделять конкретные гены и вводить их в организм нового хозяина. Технология рекомбинантных ДНК стимулировала развитие различных областей науки, но прежде всего она создала необходимые предпосылки для появления биотехнологии.
Биотехнология в значительной мере нацелена на получение с помощью микроорганизмов продуктов, имеющих коммерческую ценность. До эпохи рекомбинантных ДНК самым эффективным методом повышения продуктивности организмов был мутагенез с последующей селекцией оптимального штамма продуцента. Это длительный, трудоемкий, высокозатратный и небезошибочный процесс, позволяющий улучшить лишь немногие из присущих природному организму свойств. В то же время технология рекомбинантных ДНК — это быстродействующий, эффективный, мощный инструмент, обеспечивающий создание микроорганизмов с заранее заданными генетическими характеристиками. Более того, этот инструмент может работать не только с микроорганизмами, но также с растениями и животными. Союз технологии рекомбинантных ДНК и биотехнологии породил очень динамичную, исключительно интересную дисциплину — молекулярную биотехнологию.
Молекулярная биотехнология сразу захватила воображение общества. При участии частного капитала было создано много мелких компаний, занимающихся генным клонированием (технологией рекомбинантных ДНК). Правда, на то, чтобы предложить свою продукцию рынку, этим компаниям потребовалось времени несколько больше, чем ожидалось, но уже сейчас множество биотехнологических продуктов имеется в продаже и еще больше появится в ближайшем будущем.
Молекулярная биотехнология скрупулезно изучалась на предмет возможных негативных последствий ее распространения для человечества, поскольку спектр ее воздействия неограниченно широк. Рассматривались такие волнующие об-
Молекулярно-биотехнологическая революция 23
щественность вопросы, как безопасность экспериментов, негативное влияние на окружающую среду, патентование организмов, полученных генноинженерными методами.
ЛИТЕРАТУРА
Anonymous. 1987. New Developments in Biotechnology — Background Paper Public Perceptions of Biotechnology. Office of Technology Assessment, U.S. Congress, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C,
Bud R. 1991. Biotechnology in the twentieth century. Soc, Stud.Sci.2l:415-457.
Bud R. 1993. The Uses of Lije: a History of Biotechnology. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom,
Busch L., W.B. Lacy, J. Burkhardt, L. R, Lacy. 1992. Plants, Power, and Profit: Social, Economic and Ethical Consequences of the New Biotechnologies. Blackwell Publishers, Cambridge, Mass.
Cohen S., A.C.Y. Chang, H.W. Boyer, R.B. Helling. 1973. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70: 3240-3244.
Davis B.[). (ed.). 1991. The Genetic Revolution: Scientific Prospects and Public Perceptions. The Johns Hopkins University Press, Baltimore, Md.
Grace E.S. 1997, Biotechnology Unzipped: Promises and Realities. Trifolium Press, Inc., Toronto, Canada.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Укажите недостатки метода «мутагенез и селекция» для получения имеющих коммерческую ценность организмов с улучшенными свойствами.
2. В чем состоит революционность работы Коэна, Бойера и др., опубликованной в 1973 г.?
3. Какое отношение к биотехнологии имеет Карл Эреки?
4. Опишите основные этапы биотехнологического процесса.
5. Сравните биотехнологию и молекулярную биотехнологию.
6. Какие опасения связаны с развитием молекулярной биотехнологии?
7. Раскройте смысл утверждения, что «молекулярная биотехнология является многопрофильной наукой».
8. Назовите некоторые из потенциальных возможностей, предоставляемых молекулярной биотехнологией.
9. Опишите историю развития биотехнологической индустрии за последние 30 лет.
10. Прочтите рубрику «Новости» в последних номерах журнала "Nature Biotechnology", которые вы можете найти в научной библиотеке или в Интернете (hltp://biotech.nature.com), и детально рассмотрите пару сообщений.