Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с

• Название: Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
• Анкор: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 9.74 Mb.
• Имя файла: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Тип: Документы; #189
• страница: 7 из 88

ГЛАВА 4.
Технология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК (ее называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК) из одного организма в другой. Никакого единого, универсального набора методик здесь не существует, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме (рис. 4.1).

*   Из организма — донора нужных генов — экстрагируют  нативную ДНК  (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор—встроенная ДНК»).

*   Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией.

•   Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).

•   Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Предпосылками к созданию технологии рекомбинантных ДНК послужили многие открытия в области молекулярной биологии, энзимологии нуклеиновых кислот и молекулярной генетики бактериальных вирусов и внехромосомных элементов бактерий (плазмид). Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью целого арсенала ферментов — обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложнейшего процесса. Речь идет прежде всего о ферментах рестрикции (рестрицирующих эндонуклеазах, рестриктазах), которые узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК.

Рестрицирующие эндонуклеазы

При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках (сайтах) с образованием дискретного и воспроизводимого набора фрагментов. Если пропустить хромосомную ДНК через шприц с иглой малого диаметра или обработать ее ультразвуком, то мы получим фрагменты длиной от 0,3 до 5 т.п.н. К сожалению, в ходе этих простых операций разрывы двухцепочечных молекул происходят случайным образом, так что при каждой обработке препарата ДНК получается совершенно новый набор фрагментов. Молекулярное клонирование стало возможным только после выделения высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи. Эти ферменты называются рестрицирующими эндонуклеазами типа II.

Одна из первых рестрицирующих эндонуклеаз типа II была выделена из бактерии Escherichia coli

Технология рекомбинантных ДНК              51

Рис. 4.1. Клонирование рекомбинантной ДНК. Донорную ДНК расщепляют рестрицирующей эндонуклеазой и встраивают в клонирующий   вектор.    Полученную конструкцию вводят в популяцию клеток-хозяев, идентифицируют те клетки, которые содержат рекомбинантную ДНК,   и   культивируют   их. При необходимости можно индуцировать    экспрессию клонированного гена в клетках-хозяевах и получить кодируемый белок

52                ГЛАВА 4

Риc. 4.2. Расщепление короткого фрагмента ДНК рестрицирующей эндонуклеазой типа II EcoRI с образованием липких концов. Стрелки — связи, по которым происходит расшепление в сахарофосфатном остове. S — деэоксирибоза, P — фосфатная группа, ОН — гидроксильная группа. Последовательность, распознаваемая EcoRI, выделена штриховой линией.
Рис. 4.3. Расщепление короткого фрагмента ДНК рестриктазой типа II HindIIс образованием тупых концов. Стрелки — связи, по которым происходит расщепление в сахарофосфатном остове. Буквенные обозначения - те же, что и на рис, 4.2. Последовательность, распознаваемая рестрикгазой HindII, выделена штриховой линией.

 

Технология рекомбинантных ДНК             53
и получила назваие EcoRI. Этот фермент узнает участок ДНК, содержащий специфическую палиндромную последовательность (последовательность-перевертыш, идентичную в обеих цепях при прочтении в направлении 5'-->3') из шести пар оснований и вносит разрыв между остатками гуанина и аденина в каждой цепи (рис. 4.2), расщепляя связь между атомом кислорода при 3'-атоме углерода сахарного остатка одного нуклеотида и фосфатной группой, присоединенной к 5 '-углеродному атому сахарного остатка соседнего нуклеотида. Разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате чего образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из четырех нуклеотидов в каждом (липкие концы). Каждый одноцепочечный «хвост» заканчивается 5'-фосфатной группой, а 3'-гидроксильная группа противоположной цепи как бы утоплена.

Помимо EcoRI, из бактериальных клеток были получены сотни рестрицирующих эндуклеаз типа II. Названия этим эндонуклеазам даются по такому же принципу, как и .EcoRI: род микроорганизма обозначается прописной буквой, а вид — двумя строчными; штамм обычно не указывается. Римские цифры — порядковый номер данной эндонуклеазы в ряду прочих рестриктаз, выделенных из данного микроорганизма. Например, HраIи НраII — это соответственно первая и вторая рестрицируюшие эндонуклеазы типа II, выделенные из Haemophilus parainfluenzae.

Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа II и в которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с «тупыми» концами (рис. 4.3). Сайты узнавания могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов (табл. 4.1). От длины сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК; в большинстве случаев используют рестриктазы, узнающие тетра- и гексануклеотиды.

Рестрицирующие эндонуклеазы типа II играют ключевую роль при генном клонировании.

Таблица 4.1. Нуклеотидные последовательности, распознаваемые некоторыми ферментами рестрикции
Фермент	Сайт узнавания	Характер образуемых концов