Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
 Скачать 9.74 Mb.
|
Плазмидные векторыПлазмиды -- это внехромосомные автономно реплицирующиеся цвухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды есть практически у Технология рекомбинантных ДНК 57
всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (критические плазмиды; от англ, cryptic — скрытый, латентный). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала репликации (ori), без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна. Некоторые плазмиды представлены в клетке 10—100 копиями; они называются высококопийными. Низкокопийные плазмиды присутствуют в клетке в числе 1—4 копий. На долю плазмидной ДНК обычно приходится 0,1—5,0% суммарной клеточной ДНК. Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке, то говорят, что они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке, независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной клетке было обнаружено до 8—10 разных плазмид, при этом каждая из них выполняла свои функции, была представлена характерным для нее числом копий и относилась к своей собственной группе несовместимости. Одни плазмиды несут специфичный сайт инициации репликации и могут реплицироваться только в клетках одного вида. У других плазмид этот сайт менее специфичен, и они реплицируются в самых разных бактериальных клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и с широким спектром хозяев. Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Но довольно часто природные (немодифицированные, несконструированные) плазмиды бывают лишены некоторых обязательных для «высококачественного" вектора свойств. К таким важным свойствам относятся: 1 ) небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. coliзначительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.; 2) наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка; 3) наличие одного или более селективных генетиче- 58 ГЛАВА 4 ских маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК. Поэтому плазмидные векторы приходится создавать с помощью генной инженерии. Плазмидный вектор pBR322В 80-е годы плазмидный вектор pBR322 был одним из самых популярных универсальных векторов. Обычно обозначение плазмидного вектора включает строчную букву p (от англ, plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или к истории его создания. Так, буквы BR в обозначении плазмиды pBR322 указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса, сконструировавших эту плазмиду, а число 322 — цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. Длина плазмиды pBR322 — 4361 п. н. Она несет два гена устойчивости к антибиотикам (рис. 4.7), ампициллину (Ampr) и тетрациклину (Tetr), a также уникальные сайты для BamHI, HindIIIи SalIв генеТеtr, один PstI-сайт в гене Аmрr, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в E. coli. Плазмида реплицируется с образованием большого числа копий, в другие бактериальные клетки переносится с трудом. Как работает клонирующий вектор pBR322? Если очищенную кольцевую плазмиду pBR322
обработать рестриктазой, расщепляющей ее в единственном сайте, расположенном в одном из генов устойчивости к тому или другому антибиотику, то образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с донорной ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТР, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности объединившиеся между собой фрагменты до-норной ДНК и исходные плазмидные ДНК, Чтобы уменьшить количество последних, обрабатывают рестрицированную плазмидную ДНК щелочной фосфатазой, отщепляющей от линеаризованной молекулы 5'-фосфатные группы: ДНК-лигаза не может сшить концы дефосфорилированной линейной плазмидной ДНК (рис. 4.8). Что касается собственно рекомби-нантных молекул ДНК, то хотя в них и имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с помощью ДНК-лигазы между дефосфорилированной плазмидной ДНК и рестрицированной донорной ДНК (рис. 4,8). После репликации в трансформированной клетке одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина. Трансформация и отборТеперь необходимо ввести рекомбинантную ДНК в клетку-хозяина. Этот процесс называется трансформацией. Для его осуществления используют специально разработанные приемы, например подвергают клетки высокотемпературному воздействию и обрабатывают их хлористым кальцием (СаС12), Однако эффективность трансформации все же остается невысокой, обычно трансформируется не более одной клетки из тысячи. Таким образом, большинство клеток после проведения трансформации не содержат рекомбинантной ДНК. В некоторых из них появляется воссоединившаяся кольцевая плазмидная ДНК, избежавшая дефосфорилирования щелочной фосфатазой, в других — неплаз- Технология рекомбинантных ДНК 59
мидная ДНК и лишь в некоторых — плазмида со встроенным фрагментом чужеродной ДНК (гибридная плазмида). Как мы уже говорили, внехромосомная ДНК, не содержащая точки начала репликации, не может реплицироваться в бактериальной клетке. Таким образом, проникновение в клетку экзогенной ДНК, еще не означает, что она будет поддерживаться в хозяйской клетке. Далее, для сохранения рекомбинантной ДНК в клетке-хо- 60 ГЛАВА 4 зяине в первоначальном виде необходимо, чтобы в клетке отсутствовали гены, кодирующие синтез рестриктаз, которые могут привести к ее деградации, и чтобы клетка имела фенотип RecA– (такие клетки неспособны к общей рекомбинации, так что экзогенная ДНК не будет модифицироваться в результате гомологичной рекомбинации). Затем необходимо идентифицировать клетки, содержащие рекомбинантную ДНК. Способ идентификации должен быть как можно более простым, поскольку приходится проверять огромное число клеток. В системе pBR322, в которой чужеродная ДНК встраивается в сайт ВаmHI, специфическая идентификация состоит из двух этапов. Сначала клетки после трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин. В таких условиях могут вырасти только те клетки, в которых присутствует интактный ген Аmрr — или в составе интактной плазмиды pBR322, или в составе гибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чувствительны к ампициллину. Сайт BamHI расположен в гене Tetr плазмиды pBR322 (рис. 4.7); встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую последовательность, и устойчивость к тетрациклину утрачивается. Таким образом, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду pBR322, несут ген Tetr и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину. На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки. Клетки, образующие колонии на чашках с тетрациклином, содержат интактную плазмиду pBR322, поскольку, как мы уже говорили, они устойчивы и к ампициллину, и к тетрациклину. Клетки, не выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду pBR322. Среди колоний, выросших на среде с ампициллином, выделяют те, которые оказались чувствительны к тетрациклину, и из каждой колонии получают индивидуальные клеточные клоны или (чаще делают именно так) объединяют все колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к тетрациклину, и культивируют их вместе. Далее можно провести дополнительный скрининг и идентифицировать те клетки, которые несут гибридную плазмиду pBR322 со специфической вставкой. Присутствие сайтов HindIIIи SalI в гене Tetr и сайта PstI в гене Аmрr плазмиды pBR322 позволяет изменить локализацию клонированных фрагментов чужеродной ДНК. Если для встраивания используется сайт PstI, то отбор проводится по той же схеме, но в другом порядке, т. е. сначала высевают клетки на среду с тетрациклином, а затем — с ампициллином. Другие плазмидные векторыИдея использовать pBR322 как вектор для клонирования была вполне удачной, но эта плазмида содержит лишь несколько сайтов рестрикции, а отбор трансформированных клеток занимает много времени. Это привело к необходимости разработки альтернативных систем клонирования. Например, плазмида pUC19 длиной 2686 п. н. содержит: ген устойчивости к ампициллину; регулируемый сегмент гена β-галактозидазы (lacZ') лактозного оперона E. coli, ген lacI, кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена lacZ'; полилинкер — короткую последовательность с множеством уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз (EcoRI, SacI, КрпI, ХтаI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HinсII, AccI, BspMI, PstI, SphIи HindIII); точку начала репликации плазмиды pBR322 (рис. 4.9).
|
