Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
 Скачать 9.74 Mb.
|
Построение генетических карт хромосом человекаГенетический полиморфизмСцепление между локусом АВО и геном наследственного онихоартроза удалось обнаружить по двум причинам. Во-первых, каждый из основных аллелей системы АВО (1А, IB, 1O) можно точно идентифицировать при помощи простого лабораторного теста, так что генотипы всех исследуемых родителей и детей оказываются известными. Во-вторых, каждый аллель системы АВО встречается в популяции с высокой частотой, и вероятность того, что родители будут гетерозиготны, достаточно высока. В Великобритании, где были проведены первые работы по изучению сцепления ABO-NPS, частоты аллелей 1А, 1В и 1O составляют примерно 0,66; 0,28 и 0,06 соответственно. Термин «частота аллеля» обозначает долю конкретного аллеля среди всех аллелей данного локуса в популяции. Например, для двухаллельного локуса (AI, A2) в популяции из 13 000 человек, где 3800 человек имеют генотип А1А1, 6400 — А1А2 и2800 —А2Α2, частота аллеля A1 составляет
Молекулярная генетика человека 451
Для большинства локусов частота одного аллеля (>0,999) значительно превышает частоту другого (других) (<0,001). Вследствие этого в больших популяциях подавляющее большинство (99,8%) особей оказываются гомозиготными по более часто встречающемуся аллелю, около 0,198% — гетерозиготными и 0,001% — гомозиготными по редкому аллелю. В подобных условиях практически невозможно установить сегрегацию аллелей данного локуса или его сцепление с другим локусом, поскольку большинство родителей будут гомозиготны по часто встречающемуся аллелю. Если же частоты двух аллелей данного локуса составляют 0,99 и 0,01, то гетерозиготными будут примерно 1% особей, и шансы обнаружить сегрегацию или сцепление возрастают, поскольку в популяции много особей, гетерозиготных по данному локусу (табл. 20.3). Таким образом, изучение сцепления у человека возможно только для локусов с часто встречающимися аллелями. Если два или больше аллелей данного локуса встречаются в популяции с частотой 0,01 и выше, то говорят, что имеет место генетический полиморфизм, и локус называют полиморфным. Поскольку генетический полиморфизм, подобный полиморфизму аллелей системы АВО, встречается редко, для осуществления проектов по картированию хромосом необходимо разрабатывать методы, которые позволяют с легкостью обнаруживать большое количество полиморфных сайтов.
Полиморфизм длины рестрикционных фрагментовДля возникновения аллелей достаточно, чтобы два гомологичных гена различались всего одним нуклеотидом. Во многих случаях замена одного нуклеотида приводит к значительным различиям между продуктом измененного гена и нормальным белком. Однако множество однонуклеотидных замен не приводит к синтезу измененных генных продуктов, а кроме того, замены могут происходить в некодирующих областях ДНК и не приводить ни к каким последствиям. Такие «безвредные» замены, распределяясь по всей длине хромосомы, порождают полиморфные сайты (маркерные локусы, генетические маркеры), которые можно использовать для генетического картирования. Но сначала эти полиморфные сайты нужно обнаружить. В 1980г. Д. Ботштейн, Р. Уайт, M Сколники В. Дэвис (D. Botstein, R.L. White, М.Н. Skolnick, R.W. Davis) разработали теоретические основы идентификации однонуклеотидных полиморфных сайтов и использования их в качестве маркеров для построения хромосомных карт человека. Смысл методологии состоит в следующем. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) расщепляют ДНК в специфических сайтах. Когда однонуклеотидная замена происходит внутри такого сайта, рестриктаза перестает его расщеплять, но по-прежнему узнает и расщепляет интактный сайт в другой хромосоме (рис. 20.11, А). Поскольку один из аллелей содержит сайт узнавания для данной рестриктазы, а другой — нет, то при обработке ДНК этой рестриктазой образуются фрагменты разной длины. Наличие или отсутствие полиморфного сайта рестрикции можно установить, проведя гибридизацию ДНК с зондом, строго специфичным в отношении уникального участка хромосомы. 452 ГЛАВА 20
Молекулярная генетика человека 453 Предполжим, например, что какой-то участок хромосомы содержит три сайта, распознаваемых рестриктазой HindIII (рис. 20.11, Б), при этом у всех индивидуумов сайты А и В интактны. Это означает, что в популяции нет альтернативных аллелей по этим сайтам, т. е. отсутствует полиморфизм. В отличие от этого в сайте 1 с высокой частотой встречается однонуклеотидная замена, в результате чего он становится устойчивым к расщеплению HindIII. Таким образом, две хромосомы в популяции различаются по данному сайту: одна из них расщепляется (+), а другая нет (-). Если расстояния от сайта А до сайта 1 и от сайта ) до сайта В не совпадают, каждое из них не превышает 20 т. п, н. и существует однокопийный зонд, гибридизующийся с участком ДНК между сайтами А и 1 (рис. 20.11, Е), то после блот-гибридизации по Саузерну и разделения в агарозном геле фрагментов ДНК, полученных в результате обработки HindIII, мы сможем различить две ситуации. Первая — сайт 1 расщепляется, в результате чего образуется два фрагмента, и зонд гибридизуется с тем из них, который ограничивается сайтами А и 1. Вторая — сайт 1 не расщепляется и зонд гибридизуется с фрагментом ДНК, ограниченным сайтами А и В (рис. 20.11, Б). Анализ реальных образцов ДНК несколько более сложен, поскольку хромосомы встречаются парами (рис. 20.11, В). Однако и в этом случае каждому генотипу (+/+, +/—, —/—) соответствует определенный набор фрагментов, образующийся в результате гибридизации с зондом. Кроме того, для выявления сайта рестрикции на участке I можно использовать зонды, гибридизующиеся с другими участками ДНК между сайтами А и В (рис. 20.11, Г). Феномен, состоящий в том, что наличие часто встречающегося в популяции измененного рестрикционного сайта приводит к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называют полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. Генетический статус каждого ПДРФ-локуса на одной хромосоме называют гаплотипом. В случае одного сайта существуют два возможных гаплотипа (+ или —), в случае двух разных сайтов — четыре (++, + —, —+, – –); для n локусов число гаплотипов равно 2". Определение аллелей ПДРФ-локуса (или любых других полиморфных локусов), присутствующих на хромосомах данного индивидуума, называется гаплотипированием (генотипированием, ДНК-тип ированием). Наследование ПДРФ-локусов происходит в соответствии с законами Менделя, и можно проследить их передачу в пределах родословной. Если изучается наследование двух и более ПДРФ-локусов в данной семье, то можно выявить рекомбинацию. На рис. 20.12 представлена следующая ситуация: отец (1-1) гетерозиготен по трем разным ПДРФ-локусам, расположенным на одной хромосоме, а у матери (1-2) сайты рестрикции в трех рассматриваемых локу-сах отсутствуют. Генетический статус хромосомы, унаследованной от отца каждым из детей, можно установить путем генотипирования. Сын П-2 получил от отца хромосому, в которой произошел кроссинговер; остальные дети унаследовали от него нерекомбинантные хромосомы. На практике ДНК каждого индивидуума в отдельной пробирке обрабатывают различными
454 ГЛАВА 20 рестриктазами, а затем гибридизуют с клонированными однокопийными фрагментами ДНК, которые используются в качестве зондов для выявления ПДРФ. Гибридизация ДНК-зонда с препаратом метафазных хромосом человека, распластанных на предметном стекле (гибридизация in situ), позволяет определить, соответствует ли данный зонд уникальному участку хромосомы (однокопийной ДНК). Для обозначения тысяч ПДРФ-локусов разработана стандартная номенклатура. Например, запись D21S18 соответствует локусу, идентифицированному с помощью ДНК-зонда (D), который гибридизуется с хромосомой 21 (21), представлен одной копией (S) и зарегистрирован Комитетом по систематизации карт сцепления человека (DNA Committee of the International System for Human Linkage Maps -ISLM) под восемнадцатым номером (18). Полиморфные маркерные сайты, расположенные внутри известных генов, обозначают по названию гена. Например, ADH — это полиморфный локус в гене алкогольдегидрогеназы (ADH1). Никакого стандартного обозначения для ПДРФ-аллелей не существует. В одних лабораториях аллели нумеруют по порядку (DlS34*l, D1S43*2 и т. д.), в других — по длине фрагмента (в т.п.н.), образующегося при наличии или в отсутствие сайта (сайтов) рестрикции (D4S56*8, D4S56*12, D4S564 и т. д.). Уже идентифицированы тысячи ПДРФ-локусов, благодаря чему значительно увеличилось число аллелей, которые можно использовать для генетических исследований. Сцепление между ПДРФ-локусом (локуса-ми) и геном того или иного заболевания можно установить, подсчитав «парный» («двухлокусный») лод-балл для гаплотипированных семей, в которых выявлены случаи изучаемого генетического заболевания. Аналогично, сцепление между ПДРФ-локусами можно обнаружить, проанализировав данные по родословным, представленным несколькими поколениями. Использование ПДРФ для картирования имеет несколько ограничений. Эти локусы распределены по хромосомам неравномерно, зонды в виде клонов поддерживать неудобно, а гаплотипирование большого числа индивидов из нескольких семей методом блот-гибридизации по Саузерну весьма трудоемко. К счастью, в геноме человека в большом количестве (>100 000) встречаются другие полиморфные локусы, содержащие простые повторяющиеся элементы из двух, трех или четырех пар нуклеотидов — короткие тандемные повторы (STR, от англ. short tandem repeats), которые легко регистрируются с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полиморфизм коротких тандемных повторовПо геному человека равномерно распределены примерно 100 000 блоков динуклеотидных повторов CA/GT [(СА) · (GТ)] (рис. 20.13), содержащих от 1 до 40 повторяющихся CA/GT-элементов. Любой такой блок, локализованный в определенном участке хромосомы, передается из поколения в поколение с сохранением числа повторяющихся элементов. Для CA/GT-повтора принято обозначение (СА)n, где n — число СА-повторов. В геноме человека встречаются и другие динуклеотидные повторы [например, (АТ)n и т. д.], а также три-[(АТО)n и т. д.] и тетрануклеотидные [(ATCG)n и т. д.]. Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олиго-нуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА)n-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны-
Молекулярная генетика человека 455
ми, проводят гибридизацию in situ с комплементарными им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и проводят амплификацию СА-повтора. Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученной от большого числа индивидуумов. ΠЦР-продукты, длина которых для удобства электрофоретического разделения выбирается примерно 200 п. н., разделяют в полиакриламидном геле. Если длина амплифицированного таким образом сегмента ДНК одинакова для всех образцов ДНК, значит, повтор не полиморфен (рис. 20.14, А), и наоборот, если образуются ΠЦР-продукты разной длины, это указывает на полиморфизм по данному STR (STR-полиморфизм, STRP) (рис. 20.14, Б). Различающиеся по длине СА-повторы данного локуса представляют собой аллели (рис. 20.15). Такие аллели нередко встречаются с частотой 0,20 и даже больше. К настоящему времени уже обнаружены тысячи STRP-локусов. Для их обозначения используются те же правила, что и для ПДРФ-локусов. В то же время названия STRP-праймеров часто отличаются от названий локусов. Многие STRP-локусы были идентифицированы французскими исследователями при финансовой поддержке со стороны Французской ассоциации по мышечным дистрофиям (Association Française contre les
456 ГЛАВА 20 Myopathies), и это нашло свое отражение в том, что обозначения многих пар STRP-праймеров начинаются с аббревиатуры АРМ, после которой идет идентификационный номер (AFM349xc5). Обозначение пары праймеров часто сопровождается обозначением соответствующего локуса [AFM349xc5 (D3S2017)]. В настоящее время для картирования генома человека используются в основном не ПДРФ-локусы, a STRP. В отличие от ПДРФ-зондов, которые необходимо клонировать в векторе, очищать и метить, в случае STRP-локусов нужна информация лишь о нуклеотидной последовательности пары праймеров, которая может храниться в компьютерной базе данных. Кроме того, STRP-локусы равномерно распределены в геноме человека; частоты STR-аллелей очень высоки, что обеспечивает высокую гетерозиготность, а сами аллели без труда идентифицируются после ПЦР-амплификации. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
