Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с

• Название: Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
• Анкор: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 9.74 Mb.
• Имя файла: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Тип: Документы; #189
• страница: 73 из 88

их пациенту способствует понижению в крови уровней аденозина и дезоксиаденозина и предотвращает разрушение В- и Т-лимфоцитов. Стволовые клетки можно получить от самого пациента (оптимальный вариант) или от совместимых доноров, которых обычно нелегко найти.

К сожалению, тотипотентные стволовые клетки очень трудно выделять из костного мозга и культивировать. Исследования по ех vivo-генной терапии SCID, вызванного дефицитом АДА, проводили на аутологичных Т-клетках, модифицированных с помощью ретровирусных векторов. Т-лимфоциты имеют ограниченное время жизни, поэтому необходимо проводить их повторные инфузии. В первом испытании двум девочкам вливали с интервалом в несколько месяцев собственные генетически «исправленные» Т-клетки, продуцирующие АДА. Наблюдаемый положительный эффект, возможно, объяснялся снижением уровня аденозина и дезоксиаденозина в крови и предотвращением гибели В- и Т-клеток.

Т-клетки — не оптимальная система доставки, применяемая при генной терапии заболеваний гемопоэтических (происходящих из костного мозга) клеток. Предпочтительнее (хотя это не всегда возможно) использовать пуповинную кровь, содержащую стволовые клетки. Так, при однократном введении новорожденным с дефицитом АДА СО34+-клеток, полученных из их пуповинной крови и трансдуцированных кДНК АДА, эта кДНК поддерживалась и экспрессировалась в клетках крови неэритроидного ряда как минимум 18 мес.

В качестве примера успешной генной терапии ex vivo с использованием аутологичных клеток можно привести случай с пациенткой, гомозиготной по рецессивному гену семейной гиперхолестеролемии. Ее гепатоциты были лишены рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и не разрушали холестерол; он постоянно циркулировал в крови, приводя к закупорке артерий и тяжелой болезни сердца. Лекарственные средства в подобных случаях неэффективны, а шунтирование коронарных артерий дает непродолжительный эффект.

В описываемом случае пациентке удалили около 15% печени, гепатоциты поместили в культуральную среду и ввели в них ДНК реком-бинантного ретровируса, содержащую кДНК ЛПНП-рецептора. Затем осуществили инфузию трансдуцированных гепатоцитов в печень пациентки, где они прижились, экспрессировали кДНК ЛПНП-рецептора и вырабатывали функциональный рецептор как минимум 18 мес. Если брать за основу показатели содержания липидов, то состояние пациентки значительно улучшилось. Более того, в ее организме не образовывались антитела кЛПНП-рецептору.

Генная терапия ex vivo основана на трансплантации генетически модифицированных клеток, производящих терапевтический белок. Использование собственных клеток пациента предотвращает их отторжение, но ограничивает сферу применения генной терапии ex vivo. Так, число клеток ткани-мишени может быть недостаточно для их извлечения и культивирования in vitro, некоторые соматические клетки неэффективно поглощают ДНК, а экспрессия клонированного гена иногда оказывается временной. Поэтому в настоящее время разрабатывают системы, которые защищают неаутологичные (ксе-ногенные, аллогенные) клетки от иммунного

492             ГЛАВА 21

Создание «пакующей» клеточной линии и ее использование для производства хелпер-независимого дефектного ретровируса

R. Mann, R. С. Mulligan, D. Baltimore Сей 33: 153-159, 1983

Вопрос о применении геной терапии всегда вызывал споры, но большинство ученых согласны с Т. Фридманом и Р. Роблином, которые еще в  1972 г. (Science 175: 949-955) писали: «Мы считаем, что геная терапия сможет облегчить симптомы некоторых наследственных заболеваний человека,    поэтому    необходимо продолжать  исследования,  направленные   на   ее   развитие.» Ключевые моменты генной терапии — адресная доставка «терапевтического» гена и обеспечение его экспрессии    в    определенных клетках или тканях. Сначала в качестве   основного   средства доставки «терапевтических» генов   рассматривали   векторы, полученные на основе вирусов человека. Это было связано с наличием   у   них   механизмов проникновения   в  специфические клетки.  Наиболее многообещающими  считали  векторы на основе ретровирусов. Но нативный  ретровирус —  это инфекционный агент, который по-

вреждает   клетки   и   нередко приводит к их злокачественной трансформации.       Наиболее значимым   достижением   на пути  практической  реализации генной терапии стала разработка системы для упаковки «терапевтических" генов в инфекционные вирусные частицы, сохранившие способность прикрепляться  к клеткам-хозяевам. Манн и др. сконструировали первую клеточную линию для упаковки   ретровирусов.   Для этого они встроили  вирусный геном с предварительно удаленной нуклеотидной последовательностью, ответственной  за упаковку, в хромосому клеточной линии, которая в этих условиях производит не инфекционные вирусные частицы.  После трансфекции этих клеток ДНК-конструкцией, которая содержала последовательность, необходимую    для    упаковки,    и терапевтический ген, но не содержала ретровирусные гены,

она упаковывалась в вирусные частицы, которые затем использовали для доставки «терапевтического» гена в нужные клетки. Этот подход был принят на вооружение другими  исследователями,  занимающимися  генной терапией. Спустя несколько лет исходную «пакующую» клеточную линию адаптировали и для других вирусных векторов. В 1985 г., имея в виду результаты Манна и др., У. Андерсон отметил: «В последнее время появились эффективные системы доставки— экспрессии,   которые позволяют сделать генную терапию реальностью». А 22 мая 1989 г. Андерсон и его коллеги начали первое клиническое  испытание по генной терапии. Предпринимавшиеся до недавнего времени попытки генной терапии не отличались особым успехом, но полученная   информация   свидетельствует о том, что в будущем она станет вполне обычным методом лечения многих заболеваний.

ответа и позволяют высвобождать «терапевтический» белок.

Неаутологичная генная терапия ex vivo включает выделение тканеспецифичных клеток, хорошо растущих в культуре (например, фибробластов или кератиноцитов кожи, астроцитов мозга, гепатоцитов или миобластов), и их генетическую модификацию с помощью «терапевтического» гена. Рекомбинантные клетки заключают в искусственную полупроницаемую полимерную мембрану, через которую выходит рекомбинантный белок и поступают в клетки питательные вещества. Мембрана неиммуногенна и не вызывает сенсибилизации пациента и отторжения имплантированных клеток. В качестве инкапсулирующего материала используют разные полимеры:

альгинат—поли-L-лизин—альгинат, полиэфир-сульфон, поли(акрилонитрил-ко-винилхлорид).

Доклинические испытания, проведенные in vitro и на модельных животных, показали, что инкапсулированные рекомбинантные клетки могут пролиферировать и длительное время производить большие количества рекомбинантного белка. Чтобы попытаться предотвратить гибель мотонейронов, приводящую к нейродегенеративному заболеванию боковому амиотрофическому склерозу, была проведена I фаза клинических испытаний с использованием инкапсулированных клеток, вырабатывающих цилиарный нейротрофический фактор (CNTF, от англ, ciliaryneurotrvphicfactor). Пропедуа была признана безопасной, но у пациентов с боковым

Генная терапия            493
амиотрофическим склерозом улучшения состояния не наблюдалось. При имплантации инкапсулированных CNT F-производящих клеток в мозг животных с химически индуцированным повреждением, моделирующим другое фатальное нейродегенеративное заболевание, хорею Гентингтона, клетки мозга не разрушались. Метод инкапсуляции клеток, модифицированных с помощью генной инженерии, находится на ранней стадии развития, но может стать эффективным способом доставки терапевтических генных продуктов при лечении многих заболеваний.